Name: production of monoclonal antibodies targeting aminopeptidase n in the porcine intestinal mucosal epithelium
Uploaded: 2021-05-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium at JoVE.com

تم دعم هذه الدراسة من خلال منحة مؤسسة العلوم الوطنية الصينية (رقم 32072820 ، 31702242) ، والمنح المقدمة من منحة حكومة جيانغسو للدراسات الخارجية (JS20190246) والمواهب رفيعة المستوى لمؤسسة البحث العلمي بجامعة يانغتشو ، وهو مشروع أسسه البرنامج الأكاديمي ذي الأولوية لتطوير مؤسسة جيانغسو للتعليم العالي.

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات في هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية بجامعة يانغتشو (SYXK20200041).
1. تحضير مستضد بروتين APN الخنازير
ملاحظة: تم بناء سلالة pET28a (+) -APN-BL21 (DE3) والخلايا المعبر عنها بثبات APN pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 في دراسة سابقة<sup class="x...

<ol>
	<li>Chen, L., Lin, Y. L., Peng, G., Li, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+multifunctional+roles+of+mammalian+aminopeptidase+N.">Structural basis for multifunctional roles of mammalian aminopeptidase N.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States Of America. 109 (44), 17966-17971 (2012).</li><li>Mina-Osorio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+moonlighting+enzyme+CD13:+old+and+new+functions+to+target.">The moonlighting enzyme CD13: old and new functions to target.</a> Trends in Molecular Medicine. 14 (8), 361-371 (2008).</li><li>Lu, C., Amin, M. A., Fox, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD13/Aminopeptidase+N+is+a+potential+therapeutic+target+for+inflammatory+disorders.">CD13/Aminopeptidase N is a potential therapeutic target for inflammatory disorders.</a> The Journal of Immunology. 204 (1), 3-11 (2020).</li><li>Villase&#241;or-Cardoso, M. I., Frausto-Del-R&#237;o, D. A., Ortega, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminopeptidase+N+(CD13)+is+involved+in+phagocytic+processes+in+human+dendritic+cells+and+macrophages.">Aminopeptidase N (CD13) is involved in phagocytic processes in human dendritic cells and macrophages.</a> BioMed Research International. 2013, 562984 (2013).</li><li>Melkebeek, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+aminopeptidase+N,+a+newly+identified+receptor+for+F4ac+fimbriae,+enhances+the+intestinal+mucosal+immune+response.">Targeting aminopeptidase N, a newly identified receptor for F4ac fimbriae, enhances the intestinal mucosal immune response.</a> Mucosal Immunology. 5 (6), 635-645 (2012).</li><li>Morgan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+aminopeptidase+N/CD13+produced+by+fibroblast-like+synoviocytes+in+rheumatoid+arthritis:+role+of+CD13+in+chemotaxis+of+cytokine-activated+T+cells+independent+of+enzymatic+activity.">Expression and function of aminopeptidase N/CD13 produced by fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis: role of CD13 in chemotaxis of cytokine-activated T cells independent of enzymatic activity.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 67 (1), 74-85 (2015).</li><li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+and+arthritogenic+properties+of+the+soluble+form+of+CD13.">Angiogenic and arthritogenic properties of the soluble form of CD13.</a> The Journal of Immunology. 203 (2), 360-369 (2019).</li><li>Rasschaert, K., Devriendt, B., Favoreel, H., Goddeeris, B. M., Cox, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin-mediated+endocytosis+and+transcytosis+of+enterotoxigenic+Escherichia+coli+F4+fimbriae+in+porcine+intestinal+epithelial+cells.">Clathrin-mediated endocytosis and transcytosis of enterotoxigenic Escherichia coli F4 fimbriae in porcine intestinal epithelial cells.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 137 (3-4), 243-250 (2010).</li><li>Reguera, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+bases+of+coronavirus+attachment+to+host+aminopeptidase+N+and+its+inhibition+by+neutralizing+antibodies.">Structural bases of coronavirus attachment to host aminopeptidase N and its inhibition by neutralizing antibodies.</a> PLoS Pathogens. 8 (8), 100859 (2012).</li><li>Delmas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminopeptidase+N+is+a+major+receptor+for+the+entero-pathogenic+coronavirus+TGEV.">Aminopeptidase N is a major receptor for the entero-pathogenic coronavirus TGEV.</a> Nature. 357 (6377), (1992).</li><li>Xia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+aminopeptidase+N+binds+to+F4++enterotoxigenic+Escherichia+coli+fimbriae.">Porcine aminopeptidase N binds to F4+ enterotoxigenic Escherichia coli fimbriae.</a> Veterinary Research. 47 (1), 24 (2016).</li><li>Nakamura, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies:+methods+and+clinical+laboratory+applications.">Monoclonal antibodies: methods and clinical laboratory applications.</a> Clinical Physiology and Biochemistry. 1 (2-5), 160-172 (1983).</li><li>Chan, C. E., Chan, A. H., Lim, A. P., Hanson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+efficiency+of+antibody+selection+from+semi-synthetic+scFv+and+non-immune+Fab+phage+display+libraries+against+protein+targets+for+rapid+development+of+diagnostic+immunoassays.">Comparison of the efficiency of antibody selection from semi-synthetic scFv and non-immune Fab phage display libraries against protein targets for rapid development of diagnostic immunoassays.</a> Journal of Immunological Methods. 373 (1-2), 79-88 (2011).</li><li>K&#246;hler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).</li><li>El Miedany, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MABS:+targeted+therapy+tailored+to+the+patient's+need.">MABS: targeted therapy tailored to the patient's need.</a> British Journal of Nursing. 24 (16), 4-13 (2015).</li><li>Castelli, M. S., McGonigle, P., Hornby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharmacology+and+therapeutic+applications+of+monoclonal+antibodies.">The pharmacology and therapeutic applications of monoclonal antibodies.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 7 (6), 00535 (2019).</li><li>Weiner, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+better+monoclonal+antibody-based+therapeutics.">Building better monoclonal antibody-based therapeutics.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).</li><li>Bakshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+single-domain+antibodies+as+carriers+for+targeted+vaccine+delivery+to+the+small+intestinal+epithelium.">Evaluating single-domain antibodies as carriers for targeted vaccine delivery to the small intestinal epithelium.</a> Journal of Controlled Release. 321, 416-429 (2020).</li><li>Kohler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> The Journal of Immunology. 174 (5), 2453-2455 (2005).</li><li>Chen, W., Liu, W. E., Li, Y. M., Luo, S., Zhong, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+preliminary+application+of+monoclonal+antibodies+to+the+receptor+binding+region+of+Clostridium+difficile+toxin+B.">Preparation and preliminary application of monoclonal antibodies to the receptor binding region of Clostridium difficile toxin B.</a> Molecular Medicine Reports. 12 (5), 7712-7720 (2015).</li><li>Levieux, D., Venien, A., Levieux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitopic+analysis+and+quantification+of+bovine+myoglobin+with+monoclonal+antibodies.">Epitopic analysis and quantification of bovine myoglobin with monoclonal antibodies.</a> Hybridoma. 14 (5), 435-442 (1995).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellin+and+F4+fimbriae+have+opposite+effects+on+biofilm+formation+and+quorum+sensing+in+F4ac++enterotoxigenic+Escherichia+coli.">Flagellin and F4 fimbriae have opposite effects on biofilm formation and quorum sensing in F4ac+ enterotoxigenic Escherichia coli.</a> Veterinary Microbiology. 168 (1), 148-153 (2014).</li><li>Heinrich, L., Tissot, N., Hartmann, D. J., Cohen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+results+obtained+by+ELISA+and+surface+plasmon+resonance+for+the+determination+of+antibody+affinity.">Comparison of the results obtained by ELISA and surface plasmon resonance for the determination of antibody affinity.</a> Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 13-22 (2010).</li><li>Vander Weken, H., Cox, E., Devriendt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+oral+subunit+vaccine+design.">Advances in oral subunit vaccine design.</a> Vaccines. 9, 1 (2020).</li><li>Baert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-glucan+microparticles+targeted+to+epithelial+APN+as+oral+antigen+delivery+system.">&#946;-glucan microparticles targeted to epithelial APN as oral antigen delivery system.</a> Journal of Controlled Release. 220, 149-159 (2015).</li><li>Neuberger, M. S., Williams, G. T., Fox, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+antibodies+possessing+novel+effector+functions.">Recombinant antibodies possessing novel effector functions.</a> Nature. 312 (5995), 604-608 (1984).</li></ol>

يعد تحريض المناعة المخاطية أحد أكثر الأساليب فعالية في مواجهة مسببات الأمراض وفي الوقاية من الأمراض المختلفة وعلاجها. يشارك APN ، وهو بروتين مرتبط بغشاء عالي التعبير في الغشاء المخاطي المعوي ، في تحريض الاستجابة المناعية التكيفية وفي التداخل الخلوي الفيروسي والبكتيري بوساطة المستقبلات<su...

يعمل Aminopeptidase N (APN) ، وهو إنزيم يعمل في ضوء القمر ينتمي إلى عائلة ميتالوبروتيناز M1 ، كعلامة للورم ومستقبلات وجزيء إشارة عبر مسارات تعتمد على الإنزيم ومستقلة عن الإنزيم 1,2. بالإضافة إلى شق بقايا الأحماض الأمينية N-terminal لمختلف الببتيدات النشطة بيولوجيا لتنظيم نشاطها البيولوجي ، يلعب APN دورا مهما في التسبب في الأمراض الالتهابية المختلفة. تشارك APN في معالجة المستضد وعرضه بواسطة الببتيدات المشذبة التي ترتبط بإحكام بجزيئات معقد التوافق النسيجي الرئيسية من الفئةالثانية 2,3. يمارس APN أيضا تأثيرات مضادة للالتهابات عن طريق الارتباط بمستقبلات البروتين G المقترنة المشاركة في نقل الإشارات المتعددة ، وتعديل إفراز السيتوكين ، والمساهمة في البلعمة بوساطة مستقبلات جاما Fc في الاستجابة المناعية4،5،6،7.
باعتباره exopeptidase المرتبط بالغشاء الموزع على نطاق واسع ، فإن APN وفير في الغشاء المخاطي المعوي الصغير الخنازير ويرتبط ارتباطا وثيقا ب endocytosis بوساطة المستقبلات1،5،8. يتعرف APN على البروتين الشوكي لفيروس التهاب المعدة والأمعاء القابل للانتقال ويربطه لدخول الخلايا ، ويتفاعل مباشرة مع الوحدة الفرعية FaeG من الإشريكية القولونية المعوية F4 fimbriae للتأثير على الالتصاق البكتيري بالخلايا المضيفة9،10،11. وبالتالي ، فإن APN هو هدف علاجي محتمل في علاج الأمراض المعدية الفيروسية والبكتيرية.
منذ تطوير تقنية الورم الهجين والاستراتيجيات الأخرى لإنتاج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAbs) في عام 1975 ، تم استخدام mAbs على نطاق واسع في العلاج المناعي وتوصيل الأدوية والتشخيص12،13،14. حاليا ، يتم استخدام mAbs بنجاح لعلاج الأمراض ، مثل السرطان ومرض التهاب الأمعاء والتصلب المتعدد12,15. نظرا لتقاربها القوي وخصوصيتها ، يمكن أن تكون mAbs أهدافا مثالية في تطوير اتحادات الأدوية والأجسام المضادة (ADC) أو اللقاحات الجديدة16,17. يعد بروتين APN أمرا بالغ الأهمية لتوصيل المستضدات بشكل انتقائي إلى خلايا معينة ، ويمكن أن يثير استجابة مناعية مخاطية محددة وقوية ضد مسببات الأمراض دون أي تدخل بما في ذلك التعبير المنخفض للبروتين أو عدم نشاط الإنزيم أو التغيرات الهيكلية5،8،18. لذلك ، فإن المنتجات العلاجية القائمة على mAbs الخاصة ب APN تبشر بالخير ضد الالتهابات البكتيرية والفيروسية. في هذه الدراسة ، نصف إنتاج mAbs الخاصة ب APN باستخدام تقنية الورم الهجين ، والتعبير عن الأجسام المضادة المؤتلفة المضادة ل APN (rAbs) باستخدام نواقل بدائية النواة وحقيقية النواة. تشير النتيجة إلى أنه تم التعرف على بروتين APN من قبل كل من rAbs المعبر عنه في خلايا pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO و mAbs المشتقة من الورم الهجين.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Complete Freund&#8217;s adjuvant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5881</td>
			<td>Animal immunization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>C1002</td>
			<td>Nuclear counterstain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody</td>
			<td>Abbkine</td>
			<td>A23310</td>
			<td>Indirect immunofluorescence analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced Cell Counting Kit-8</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>C0042</td>
			<td>Measurement&#160;of&#160;cell&#160;viability and vitality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10091</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneticin&#8482; Selective Antibiotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11811098</td>
			<td>Selective antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAT Supplement (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21060017</td>
			<td>Cell selection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11067030</td>
			<td>Cell selection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incomplete Freund&#8217;s adjuvant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5506</td>
			<td>Animal immunization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl &#946;-d-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5502</td>
			<td>Protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>ST102</td>
			<td>Bactericidal antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 STED confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>&#160;SP8 STED</td>
			<td>Fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine&#174; 2000 Reagent</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa&#8482; fluorescence-activated cell sorting</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACS LSRFortessa</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BOX 998</td>
			<td>ELISA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Nano Drop one</td>
			<td>Nucleic acid concentration detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019308</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10002917</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985088</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 1500</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10783641001</td>
			<td>Cell fusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript&#8482; 1st strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>RR047</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein A agarose</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>P2006</td>
			<td>Antibody protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protino&#174; Ni+-TED 2000 Packed Columns</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>745120.5</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SBA Clonotyping System-HRP</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>May-00</td>
			<td>Isotyping of mouse monoclonal antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seamless Cloning Kit</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>D7010S</td>
			<td>Construction of plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shake flasks</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>E3285</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>C0221A</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>&#160;170-3940</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Homogenizer</td>
			<td>Ningbo Xinzhi Biotechnology</td>
			<td>JY92-IIN</td>
			<td>Sample homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of monoclonal antibodies targeting aminopeptidase n in the porcine intestinal mucosal epithelium

يمكن ل Porcine aminopeptidase N (APN) ، وهو ميتالوببتيداز مرتبط بالغشاء موجود بكثرة في الغشاء المخاطي في الأمعاء الدقيقة ، أن يبدأ استجابة مناعية مخاطية دون أي تدخل مثل انخفاض تعبير البروتين أو عدم نشاط الإنزيم أو التغيرات الهيكلية. هذا يجعل APN مرشحا جذابا في تطوير اللقاحات التي تستهدف بشكل انتقائي ظهارة الغشاء المخاطي. أظهرت الدراسات السابقة أن APN هو بروتين مستقبلات لكل من الإشريكية القولونية المعوية (E. coli) F4 وفيروس التهاب المعدة والأمعاء القابل للانتقال. وبالتالي ، فإن APN تبشر بالخير في تطوير اتحادات الأدوية والأجسام المضادة أو اللقاحات الجديدة القائمة على الأجسام المضادة الخاصة ب APN. في هذه الدراسة ، قارنا إنتاج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الخاصة ب APN (mAbs) باستخدام تقنية الورم الهجين التقليدية وطريقة التعبير عن الأجسام المضادة المؤتلفة. أنشأنا أيضا خط خلايا مبيض الهامستر الصيني (CHO) المنقول بشكل ثابت باستخدام pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN وسلالة تعبير الإشريكية القولونية BL21 (DE3) التي تؤوي ناقل pET28a (+) -rAbs-APN. تظهر النتائج أن الأجسام المضادة المعبر عنها في خلايا pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO و mAbs المنتجة باستخدام الأورام الهجينة يمكن أن تتعرف على بروتين APN وترتبط به. وهذا يوفر الأساس لمزيد من التوضيح لوظيفة مستقبلات APN لتطوير العلاجات التي تستهدف مختلف الحواتم الخاصة ب APN.

في هذه الدراسة ، تم استخدام بروتين APN المنقى القابل للذوبان (2.12 مجم / مل) لتحصين الفئران. أظهرت الفئران المحصنة ببروتين APN أربع مرات كل 14 يوما عيار أجسام مضادة أعلى ضد APN في أمصالها. على الرغم من الحصول على 14 ورم هجين باستخدام تجارب الاندماج ، إلا أن 9 أورام هجينة فقط نجت من دورات التجميد والذوب...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium at JoVE.com

Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium

يمكن لبروتين الأجسام المضادة المؤتلف المعبر عنه في خلايا pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO والأجسام المضادة وحيدة النسيلة المنتجة باستخدام تقنية الورم الهجين التقليدية التعرف على بروتين أمينوببتيداز N (APN) الخنازير والارتباط به.

إنتاج أجسام مضادة وحيدة النسيلة تستهدف أمينوببتيداز N في ظهارة الغشاء المخاطي المعوي الخنازير

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response ...

تستخدم الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المشتقة في المقام الأول في الكواشف المناعية العلاجية التشخيصية التي تسلط الضوء على الحاجة إلى إنتاج أجسام مضادة مستقرة وموثوقة في إنتاج محدود معد. أثبتت الطرق الموصوفة هنا أن إنتاج الأجسام المضادة المؤتلفة يمكن أن يزيد من كفاءة إنتاج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ويقلل من تكاليف العمالة والوقت المرتبطة به. تستخدم الطرق لتطوير اتحادات الأدوية القائمة على aminopeptidase والأجسام المضادة وغيرها من المنتجات العلاجية ، مما يساعد في توضيح دور APN في الوقاية والعلاج من الالتهابات البكتيرية والفيروسية.سيكون عرض الإجراء يان لي ، طالب دراسات عليا من مختبري. للبدء ، حقن 100 ميكروغرام من بروتين APN داخل الصفاق في الفئران الإناث البالغة المختارة لتعزيز المستضد النهائي. بعد ثلاثة أيام من الحقن ، اجمع الطحال من الفئران واغسله باستخدام DMEM مرتين لإزالة الدم والخلايا الدهنية.قم بتصفية معلق خلايا الطحال باستخدام شبكة نحاسية 200 شبكة لإزالة حطام الأنسجة وحصاد خلايا الطحال باستخدام الطرد المركزي لإزالة غشاء الطحال. قم بزرع خلايا الورم النقوي SP20 للفأر في قارورة مساحتها 25 سم مربع تحتوي على خمسة ملليلتر من DMEM مكملة بمصل بقري جنيني بنسبة 6٪ واستزراع الخلايا عند 37 درجة مئوية و 6٪ جو من ثاني أكسيد الكربون للحفاظ على صلاحية الخلية. بعد خمسة إلى ستة أيام من المزرعة ، يجب أن تصل الخلايا إلى 80 إلى 90٪ من التقاءها بعد الإنعاش وتظهر مستديرة ومشرقة وواضحة تحت المجهر.قبل يوم واحد من التهجين ، اجمع البلاعم من التجاويف البريتونية للفئران. البلاعم البريتونية للبذور بكثافة تتراوح من 0.1 إلى 0.2 مرة من 10 إلى الخامس لكل ملليلتر في 96 صفيحة بئر ، تحتوي كل منها على 100 ميكرولتر من وسط HAT وتحتضنها طوال الليل. للتهجين ، قم باستنشاق خلايا SP20 برفق باستخدام ماصة من 8 إلى 10 زجاجات وعلقها في 10 ملليلتر من وسط DMEM الخالي من المصل.اغسل الخلايا باستخدام DMEM الطازج وأجهزة الطرد المركزي مرتين ، ثم أعد تعليقها في 10 ملليلتر من DMEM. امزج خلايا الطحال الكمية مع خلايا SB20 بنسبة 10: 1 وانقلها إلى أنابيب سعة 50 ملليلتر. بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية واجمع الكريات في قاع الأنابيب.اضغط على الأنبوب لفك الكريات قبل التهجين. باستخدام قطارة ، أضف ملليلترا واحدا من البولي إيثيلين جلايكول 1500 تم تسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية بالتنقيط إلى حبيبات الخلية المفكوكة على مدار 45 ثانية أثناء تدوير الجزء السفلي من الأنبوب برفق. ثم أضف ببطء ملليلترا واحدا من DMEM المسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية إلى الخليط لمدة 90 ثانية ، متبوعا ب 30 ملليلترا أخرى من DMEM الطازج وضع أنبوب الانصهار في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.بعد الحضانة ، حصاد الخلايا. أعد تعليق وسط HAT والثقافة في صفيحة 96 بئرا ملقحة بالبلاعم البريتونية. بعد خمسة أيام ، أضف 100 ميكرولتر من وسيط HAT الطازج إلى كل بئر.ومرة أخرى بعد خمسة أيام من الحضانة ، استبدل الوسيط بوسط HAT. استخدم صفيحة عيار ميكرو مغلفة بخمسة ميكروغرام لكل مليلتر من بروتين APN المخفف في 0.05 مولار PBS لتحليل الأجسام المضادة وحيدة النسيلة في طاف الأورام الهجينة باستخدام مقايسة ELISA. تنمو pET28a بالإضافة إلى الأجسام المضادة المؤتلفة aminopeptidase NBL21 البكتيريا المحولة في وجود 0.4 مليمولار بيتا D-1-ثيوغالاكتوبيرانوسيد في شاكر مداري عند 37 درجة مئوية لمدة 10 ساعات.بذرة 100 ميكرولتر 0.5 مرة 10 إلى خلايا مبيض الهامستر الصيني الخامس لكل بئر في صفيحة 96 بئرا للحضانة عند 37 درجة مئوية وجو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 6٪ لمدة 18 إلى 24 ساعة. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 80 إلى 90٪ ، قم بتخفيف pIRES2-zs Green واحد الأجسام المضادة المؤتلفة أمينوببتيداز والبلازميد مع Opti-MEM إلى تركيز نهائي قدره 0.1 ميكروغرام لكل ميكرولتر. بعد خمس دقائق ، امزج 50 ميكرولترا من pIRES2-zs Green Green الأجسام المضادة المؤتلفة أمينوببتيداز والبلازميد مع ميكرولتر واحد من ليبوفيكتامين 2000 و 49 ميكرولتر من Opti-MEM.بعد 20 دقيقة من الحضانة ، أضف 100 ميكرولتر من الخليط إلى كل بئر من صفيحة 96 بئرا تحتوي على خلايا CHO. في أربع إلى ست ساعات بعد النقل ، استبدل الوسيط ب DMEM F12 المكمل ب 10٪ FBS. بعد 48 ساعة من الحضانة ، أضف 400 ميكروغرام لكل ميكرولتر G418 إلى كل بئر لتحديد الخلايا المنقولة بثبات.بعد 10 أيام من الاختيار باستخدام وسيط DMEM F12 المكمل ب 10٪ FBS و 400 ميكروغرام لكل ميكرولتر G418 ، قم بفرز الخلايا باستخدام فرز الخلايا المنشط بالفلورة. تمييع متسلسلا الخلايا الإيجابية المحصودة. قم بزرعها بمعدل 0.5 إلى 2 خلية لكل بئر في صفيحة 96 بئرا واستزراعها في 37 درجة مئوية ، 6٪ حاضنة ثاني أكسيد الكربون.في التحليل المجهري التمثيلي ، ظهرت جميع خلايا الأورام الهجينة مستديرة ومشرقة وواضحة. تم تأكيد الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المنقاة التي تحتوي على سلاسل ثقيلة 50 كيلو دالتون و 25 كيلودالتون خفيفة بواسطة SDS-PAGE وتم العثور عليها في الاستسقاء المنقى. يتم عرض عيارات هذه الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة ل APN في طافات الثقافة والاستسقاء هنا.كشف التنميط المتماثل للأجسام المضادة أحادية النسيلة للفأر أن الأجسام المضادة المشتقة من الحيوانات المستنسخة 5B31 و 5B36 و 3C48 و 5C51 و 6C56 تمتلك فئات فرعية من الغلوبولين المناعي G2B بينما كان APN 2A20 عبارة عن جسم مضاد من نوع الغلوبولين المناعي G2A kappa والجسم المضاد أحادي النسيلة APN 3FD9 و 3F10 و 10F3 ينتمي إلى نوع الغلوبولين المناعي M وسلاسل ضوء كابا المعالجة. أظهرت معظم هذه الأجسام المضادة وحيدة النسيلة قيم AV تزيد عن 50٪ مما يشير إلى أنها استهدفت حوائط مختلفة في APN بينما تعرف الجسم المضاد APN 5C51 على حوامل مستضدية مثل تلك التي تعرفت عليها الأجسام المضادة أحادية النسيلة APN 3C48 و 5B31 و 6C56. تم ربط جين APN 5B36 VHVL المضخم في ناقل واحد pET28a إيجابي أو pIRES2-zs Green لبناء بلازميدات التعبير المؤتلف pET28a إيجابية RABS APN و pIRES2-zs Green one RABS APN على التوالي.تم تنقية وتحليل الأجسام المضادة التي تم التعبير عنها بواسطة كل من pET28a بالإضافة إلى الأجسام المضادة المؤتلفة aminopeptidase NBL21 و pIRES2-zs Green one الأجسام المضادة المؤتلفة خلايا أمينوببتيداز NCHO باستخدام فحوصات ELISA و IFA. ومع ذلك ، فإن الجسم المضاد المعبر عنه فقط في طاف pIRES2-zs Green واحد الأجسام المضادة المؤتلفة خلايا أمينوببتيداز NCHO تتعرف على بروتين APN. وصل ارتباط الأجسام المضادة أحادية النسيلة APN 5B36 ببروتينات APN إلى توازن أبكر من الأجسام المضادة المؤتلفة.تنقية الأجسام المضادة وحيدة النسيلة في طاف باستخدام بروتين أغاروز أفضل من استخدام ترسيب كبريتات الأمونيا المشبعة.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

الإدارة السلبي من الاجسام المضادة ضد H. المغمدة مسببات الأمراض الفطرية وآخرون

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

في المختبر المقايسة المشتركة لتقييم الهجرة العدلية المستحثة المسببة للأمراض عبر الظهارية

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

نمذجة الأغشية المخاطية المبيضات في اليرقات الزرد عن طريق الحقن Swimbladder

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

الجيل المؤتلف الإنسان مفتش حيدة النسيلة من مخلد خلايا التصنيف B

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

تقييم فعالية وسمية الرنا استهداف HIV-1 الإنتاج للاستخدام في الجينات أو العلاج بالعقاقير

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

جيل من الفئران وحيدة النسيلة الأجسام المضادة بواسطة تقنية هجين

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

موسع لأخذ العينات من السوائل البطانة المخاطية للتحديد الكمي للمناعة-الوسيط في فيفو مجرى الهواء العلوي في مستويات

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

جيل متغيرات الهروب من تحييد الأجسام المضادة فيروس الإنفلونزا

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

جيل من التمييزية مونوكلونل البشرية من خلايا نادرة محددة مستضد ب المتداولة في الدم

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

جيل من الأجسام المضادة ضد المنتجات الطبيعية

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...