Name: production of monoclonal antibodies targeting aminopeptidase n in the porcine intestinal mucosal epithelium
Uploaded: 2021-05-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door de Chinese National Science Foundation Grant (nr. 32072820, 31702242), subsidies van Jiangsu Government Scholarship for Overseas Studies (JS20190246) en High-level Talents van Yangzhou University Scientific Research Foundation, een project opgericht door het Priority Academic Program of Development Jiangsu High Education Institution.

Alle dierproeven in deze studie werden goedgekeurd door de Yangzhou University Institutional Animal Care and Use Committee (SYXK20200041).
1. Bereiding van apn-eiwitantigeen bij varkens
OPMERKING: De pET28a (+)-APN-BL21 (DE3) stam en de APN stabiel tot expressie gebrachte cellen pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 werden geconstrueerd in een eerdere studie11.
<ol><li>Herstel bacteriën uit een bevroren glycerolvoorraad en streep op Luria-Bertani (LB) plat...

<ol>
	<li>Chen, L., Lin, Y. L., Peng, G., Li, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+multifunctional+roles+of+mammalian+aminopeptidase+N.">Structural basis for multifunctional roles of mammalian aminopeptidase N.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States Of America. 109 (44), 17966-17971 (2012).</li><li>Mina-Osorio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+moonlighting+enzyme+CD13:+old+and+new+functions+to+target.">The moonlighting enzyme CD13: old and new functions to target.</a> Trends in Molecular Medicine. 14 (8), 361-371 (2008).</li><li>Lu, C., Amin, M. A., Fox, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD13/Aminopeptidase+N+is+a+potential+therapeutic+target+for+inflammatory+disorders.">CD13/Aminopeptidase N is a potential therapeutic target for inflammatory disorders.</a> The Journal of Immunology. 204 (1), 3-11 (2020).</li><li>Villase&#241;or-Cardoso, M. I., Frausto-Del-R&#237;o, D. A., Ortega, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminopeptidase+N+(CD13)+is+involved+in+phagocytic+processes+in+human+dendritic+cells+and+macrophages.">Aminopeptidase N (CD13) is involved in phagocytic processes in human dendritic cells and macrophages.</a> BioMed Research International. 2013, 562984 (2013).</li><li>Melkebeek, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+aminopeptidase+N,+a+newly+identified+receptor+for+F4ac+fimbriae,+enhances+the+intestinal+mucosal+immune+response.">Targeting aminopeptidase N, a newly identified receptor for F4ac fimbriae, enhances the intestinal mucosal immune response.</a> Mucosal Immunology. 5 (6), 635-645 (2012).</li><li>Morgan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+aminopeptidase+N/CD13+produced+by+fibroblast-like+synoviocytes+in+rheumatoid+arthritis:+role+of+CD13+in+chemotaxis+of+cytokine-activated+T+cells+independent+of+enzymatic+activity.">Expression and function of aminopeptidase N/CD13 produced by fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis: role of CD13 in chemotaxis of cytokine-activated T cells independent of enzymatic activity.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 67 (1), 74-85 (2015).</li><li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+and+arthritogenic+properties+of+the+soluble+form+of+CD13.">Angiogenic and arthritogenic properties of the soluble form of CD13.</a> The Journal of Immunology. 203 (2), 360-369 (2019).</li><li>Rasschaert, K., Devriendt, B., Favoreel, H., Goddeeris, B. M., Cox, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin-mediated+endocytosis+and+transcytosis+of+enterotoxigenic+Escherichia+coli+F4+fimbriae+in+porcine+intestinal+epithelial+cells.">Clathrin-mediated endocytosis and transcytosis of enterotoxigenic Escherichia coli F4 fimbriae in porcine intestinal epithelial cells.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 137 (3-4), 243-250 (2010).</li><li>Reguera, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+bases+of+coronavirus+attachment+to+host+aminopeptidase+N+and+its+inhibition+by+neutralizing+antibodies.">Structural bases of coronavirus attachment to host aminopeptidase N and its inhibition by neutralizing antibodies.</a> PLoS Pathogens. 8 (8), 100859 (2012).</li><li>Delmas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminopeptidase+N+is+a+major+receptor+for+the+entero-pathogenic+coronavirus+TGEV.">Aminopeptidase N is a major receptor for the entero-pathogenic coronavirus TGEV.</a> Nature. 357 (6377), (1992).</li><li>Xia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+aminopeptidase+N+binds+to+F4++enterotoxigenic+Escherichia+coli+fimbriae.">Porcine aminopeptidase N binds to F4+ enterotoxigenic Escherichia coli fimbriae.</a> Veterinary Research. 47 (1), 24 (2016).</li><li>Nakamura, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies:+methods+and+clinical+laboratory+applications.">Monoclonal antibodies: methods and clinical laboratory applications.</a> Clinical Physiology and Biochemistry. 1 (2-5), 160-172 (1983).</li><li>Chan, C. E., Chan, A. H., Lim, A. P., Hanson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+efficiency+of+antibody+selection+from+semi-synthetic+scFv+and+non-immune+Fab+phage+display+libraries+against+protein+targets+for+rapid+development+of+diagnostic+immunoassays.">Comparison of the efficiency of antibody selection from semi-synthetic scFv and non-immune Fab phage display libraries against protein targets for rapid development of diagnostic immunoassays.</a> Journal of Immunological Methods. 373 (1-2), 79-88 (2011).</li><li>K&#246;hler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).</li><li>El Miedany, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MABS:+targeted+therapy+tailored+to+the+patient's+need.">MABS: targeted therapy tailored to the patient's need.</a> British Journal of Nursing. 24 (16), 4-13 (2015).</li><li>Castelli, M. S., McGonigle, P., Hornby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharmacology+and+therapeutic+applications+of+monoclonal+antibodies.">The pharmacology and therapeutic applications of monoclonal antibodies.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 7 (6), 00535 (2019).</li><li>Weiner, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+better+monoclonal+antibody-based+therapeutics.">Building better monoclonal antibody-based therapeutics.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).</li><li>Bakshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+single-domain+antibodies+as+carriers+for+targeted+vaccine+delivery+to+the+small+intestinal+epithelium.">Evaluating single-domain antibodies as carriers for targeted vaccine delivery to the small intestinal epithelium.</a> Journal of Controlled Release. 321, 416-429 (2020).</li><li>Kohler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> The Journal of Immunology. 174 (5), 2453-2455 (2005).</li><li>Chen, W., Liu, W. E., Li, Y. M., Luo, S., Zhong, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+preliminary+application+of+monoclonal+antibodies+to+the+receptor+binding+region+of+Clostridium+difficile+toxin+B.">Preparation and preliminary application of monoclonal antibodies to the receptor binding region of Clostridium difficile toxin B.</a> Molecular Medicine Reports. 12 (5), 7712-7720 (2015).</li><li>Levieux, D., Venien, A., Levieux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitopic+analysis+and+quantification+of+bovine+myoglobin+with+monoclonal+antibodies.">Epitopic analysis and quantification of bovine myoglobin with monoclonal antibodies.</a> Hybridoma. 14 (5), 435-442 (1995).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellin+and+F4+fimbriae+have+opposite+effects+on+biofilm+formation+and+quorum+sensing+in+F4ac++enterotoxigenic+Escherichia+coli.">Flagellin and F4 fimbriae have opposite effects on biofilm formation and quorum sensing in F4ac+ enterotoxigenic Escherichia coli.</a> Veterinary Microbiology. 168 (1), 148-153 (2014).</li><li>Heinrich, L., Tissot, N., Hartmann, D. J., Cohen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+results+obtained+by+ELISA+and+surface+plasmon+resonance+for+the+determination+of+antibody+affinity.">Comparison of the results obtained by ELISA and surface plasmon resonance for the determination of antibody affinity.</a> Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 13-22 (2010).</li><li>Vander Weken, H., Cox, E., Devriendt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+oral+subunit+vaccine+design.">Advances in oral subunit vaccine design.</a> Vaccines. 9, 1 (2020).</li><li>Baert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-glucan+microparticles+targeted+to+epithelial+APN+as+oral+antigen+delivery+system.">&#946;-glucan microparticles targeted to epithelial APN as oral antigen delivery system.</a> Journal of Controlled Release. 220, 149-159 (2015).</li><li>Neuberger, M. S., Williams, G. T., Fox, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+antibodies+possessing+novel+effector+functions.">Recombinant antibodies possessing novel effector functions.</a> Nature. 312 (5995), 604-608 (1984).</li></ol>

Inductie van mucosale immuniteit is een van de meest effectieve benaderingen bij het tegengaan van pathogenen en bij het voorkomen en behandelen van verschillende ziekten. APN, een sterk tot expressie gebracht membraangebonden eiwit in het darmslijmvlies, is betrokken bij de inductie van adaptieve immuunrespons en bij receptorgemedieerde virale en bacteriële endocytose 1,5,8. APN wordt gebruikt als antigeendeeltjes in vele form...

Aminopeptidase N (APN), een maanlichtenzym dat behoort tot de metalloproteïnase M1-familie, fungeert als een tumormarker, receptor en signaalmolecuul via enzymafhankelijke en enzymonafhankelijke routes 1,2. Naast het splitsen van de N-terminale aminozuurresiduen van verschillende bioactieve peptiden voor de regulatie van hun biologische activiteit, speelt APN een belangrijke rol in de pathogenese van verschillende ontstekingsziekten. APN neemt deel aan antigeenverwerking en -presentatie door bijgesneden peptiden die stevig binden aan belangrijke histocompatibiliteitscomplex klasse II-moleculen 2,3. APN oefent ook ontstekingsremmende effecten uit door zich te binden met G-eiwit-gekoppelde receptoren die deelnemen aan meervoudige signaaltransductie, cytokinesecretie moduleren en bijdragen aan Fc-gammareceptor-gemedieerde fagocytose in de immuunrespons 4,5,6,7.
Als een wijd verspreide membraangebonden exopeptidase is APN overvloedig aanwezig in het dunne darmslijmvlies van varkens en is nauw verbonden met receptorgemedieerde endocytose 1,5,8. APN herkent en bindt het spike-eiwit van het overdraagbare gastro-enteritisvirus voor celinvoer en interageert direct met de FaeG-subeenheid van enterotoxigene Escherichia coli F4 fimbriae om bacteriële hechting met gastheercellen te beïnvloeden 9,10,11. APN is dus een potentieel therapeutisch doelwit bij de behandeling van virale en bacteriële infectieziekten.
Sinds de ontwikkeling van hybridoma-technologie en andere strategieën voor de productie van monoklonale antilichamen (mAbs) in 1975, zijn mAbs op grote schaal gebruikt in immunotherapie, medicijnafgifte en diagnose12,13,14. Momenteel worden mAbs met succes gebruikt om ziekten te behandelen, zoals kanker, inflammatoire darmaandoeningen en multiple sclerose12,15. Vanwege hun sterke affiniteit en specificiteit kunnen mAbs ideale doelwitten zijn bij de ontwikkeling van antilichaam-geneesmiddelconjugaten (ADC) of nieuwe vaccins16,17. Het APN-eiwit is van cruciaal belang voor het selectief afleveren van antigenen aan specifieke cellen en kan een specifieke en sterke mucosale immuunrespons tegen pathogenen veroorzaken zonder enige interferentie, waaronder lage eiwitexpressie, enzyminactiviteit of structurele veranderingen 5,8,18. Daarom zijn therapeutische producten op basis van APN-specifieke mAbs veelbelovend tegen bacteriële en virale infecties. In deze studie beschrijven we de productie van APN-specifieke mAbs met behulp van hybridoma-technologie en expressie van anti-APN recombinante antilichamen (rAbs) met behulp van prokaryote en eukaryote vectoren. Het resultaat geeft aan dat het APN-eiwit werd herkend door zowel rAbs uitgedrukt in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-cellen als hybridoom-afgeleide mAbs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Complete Freund&#8217;s adjuvant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5881</td>
			<td>Animal immunization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>C1002</td>
			<td>Nuclear counterstain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody</td>
			<td>Abbkine</td>
			<td>A23310</td>
			<td>Indirect immunofluorescence analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced Cell Counting Kit-8</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>C0042</td>
			<td>Measurement&#160;of&#160;cell&#160;viability and vitality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10091</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneticin&#8482; Selective Antibiotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11811098</td>
			<td>Selective antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAT Supplement (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21060017</td>
			<td>Cell selection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11067030</td>
			<td>Cell selection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incomplete Freund&#8217;s adjuvant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5506</td>
			<td>Animal immunization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl &#946;-d-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5502</td>
			<td>Protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>ST102</td>
			<td>Bactericidal antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 STED confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>&#160;SP8 STED</td>
			<td>Fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine&#174; 2000 Reagent</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa&#8482; fluorescence-activated cell sorting</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACS LSRFortessa</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BOX 998</td>
			<td>ELISA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Nano Drop one</td>
			<td>Nucleic acid concentration detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019308</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10002917</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985088</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 1500</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10783641001</td>
			<td>Cell fusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript&#8482; 1st strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>RR047</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein A agarose</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>P2006</td>
			<td>Antibody protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protino&#174; Ni+-TED 2000 Packed Columns</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>745120.5</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SBA Clonotyping System-HRP</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>May-00</td>
			<td>Isotyping of mouse monoclonal antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seamless Cloning Kit</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>D7010S</td>
			<td>Construction of plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shake flasks</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>E3285</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>C0221A</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>&#160;170-3940</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Homogenizer</td>
			<td>Ningbo Xinzhi Biotechnology</td>
			<td>JY92-IIN</td>
			<td>Sample homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of monoclonal antibodies targeting aminopeptidase n in the porcine intestinal mucosal epithelium

Porcine aminopeptidase N (APN), een membraangebonden metallopeptidase dat overvloedig aanwezig is in dunne darmslijmvlies, kan een mucosale immuunrespons initiëren zonder enige interferentie zoals lage eiwitexpressie, enzyminactiviteit of structurele veranderingen. Dit maakt APN een aantrekkelijke kandidaat bij de ontwikkeling van vaccins die zich selectief richten op het slijmvliesepitheel. Eerdere studies hebben aangetoond dat APN een receptoreiwit is voor zowel enterotoxigene Escherichia coli (E. coli) F4 als overdraagbare gastro-enteritisvirus. APN is dus veelbelovend in de ontwikkeling van antilichaam-medicijnconjugaten of nieuwe vaccins op basis van APN-specifieke antilichamen. In deze studie vergeleken we de productie van APN-specifieke monoklonale antilichamen (mAbs) met behulp van traditionele hybridoma-technologie en recombinante antilichaamexpressiemethode. We hebben ook een stabiel getransfecteerde ovarium (CHO) cellijn van de Chinese hamster vastgesteld met behulp van pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN en een E. coli-expressie BL21 (DE3) stam met de pET28a (+)-rAbs-APN-vector. De resultaten tonen aan dat antilichamen die tot expressie komen in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-cellen en mAbs geproduceerd met behulp van hybridomen het APN-eiwit kunnen herkennen en eraan kunnen binden. Dit vormt de basis voor verdere opheldering van de APN-receptorfunctie voor de ontwikkeling van therapieën gericht op verschillende APN-specifieke epitopen.

In deze studie werd het gezuiverde oplosbare APN-eiwit (2,12 mg / ml) gebruikt voor immunisatie van muizen. Muizen die vier keer met tussenpozen van 14 dagen met het APN-eiwit waren geïmmuniseerd, vertoonden een hogere antilichaamtiter tegen APN in hun sera. Hoewel 14 hybridomen werden verkregen met behulp van de fusie-experimenten, overleefden slechts 9 hybridomen de drie continue vries-dooicycli, wat resulteerde in 9 stabiele klonen die antilichamen tegen APN uitscheidden. Al deze cellen zijn rond, helder en helder (<...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium at JoVE.com

Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium

Het recombinante antilichaameiwit dat tot expressie komt in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-cellen en monoklonale antilichamen geproduceerd met behulp van traditionele hybridoma-technologie kan het varkensaminopeptidase N (APN) -eiwit herkennen en eraan binden.

Productie van monoklonale antilichamen gericht tegen aminopeptidase N in het varkensdarmslijmvliesepitheel

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response ...

Afgeleide monoklonale antilichamen worden voornamelijk gebruikt in diagnostische therapeutische immuunreagentia, wat de noodzaak benadrukt om stabiele en betrouwbare antilichamen te produceren in beperkte productiebereidheid. De hier beschreven methoden bewezen dat de productie van recombinante antilichamen de productie-efficiëntie van monoklonale antilichamen kon verhogen en de arbeids- en tijdgerelateerde kosten kon minimaliseren. De methoden worden gebruikt om aminopeptidase en op antilichamen gebaseerde antilichaamgeneesmiddelconjugaten en andere therapeutische producten te ontwikkelen, wat helpt bij het verduidelijken van de rol van APN bij de preventie en behandeling van bacteriële en virale infecties.Yan Li, een postgraduaatsstudent uit mijn laboratorium, demonstreert de procedure. Om te beginnen, intraperitoneaal injecteren 100 microgram APN-eiwit in de geselecteerde volwassen vrouwelijke muizen voor een laatste antigeenboost. Na drie dagen injectie, verzamel de milt van muizen en was twee keer met DMEM om bloed- en vetcellen te verwijderen.Filter de miltcelsuspensie met behulp van een koperen rooster van 200 mazen om weefselresten te verwijderen en oogst miltcellen met behulp van centrifugatie om het miltmembraan te verwijderen. Zaai de muis SP20 myeloom cellen in een kolf van 25 vierkante centimeter met vijf milliliter DMEM aangevuld met 6% foetaal runderserum en kweek de cellen bij 37 graden Celsius en 6% kooldioxide atmosfeer om de levensvatbaarheid van de cel te behouden. Na vijf tot zes dagen kweek moeten de cellen na de reanimatie 80 tot 90% samenvloeiing bereiken en er rond, helder en helder uitzien onder de microscoop.Een dag voor hybridisatie, verzamel macrofagen uit de peritoneale holtes van de muizen. Zaad peritoneale macrofagen met een dichtheid van 0,1 tot 0,2 maal 10 tot de vijfde per milliliter in 96-putplaten, die elk 100 microliter HAT-medium bevatten en deze 's nachts incuberen. Voor hybridisatie, zuig sp20-cellen voorzichtig op met een pipet van 8 tot 10 flessen en suspensie ze in 10 milliliter serumvrij DMEM-medium.Was de cellen met verse DMEM en centrifugeer ze twee keer en resuspensie ze vervolgens in 10 milliliter DMEM. Meng de gekwantificeerde miltcellen met SB20-cellen in een verhouding van 10:1 en breng ze over in buisjes van 50 milliliter. Gooi na het centrifugeren het supernatant weg en verzamel de pellets op de bodem van de buizen.Tik op de buis om de pellets los te maken voordat ze worden gehybridiseerd. Voeg met behulp van een druppelaar een milliliter polyethyleenglycol 1500 voorverwarmd tot 37 graden Celsius druppelsgewijs toe aan de losgemaakte celpellet gedurende 45 seconden terwijl u de onderkant van de buis voorzichtig draait. Voeg vervolgens langzaam een milliliter DMEM voorverwarmd tot 37 graden Celsius toe aan het mengsel gedurende 90 seconden, gevolgd door nog eens 30 milliliter verse DMEM en plaats de fusiebuis gedurende 30 minuten in een waterbad van 37 graden Celsius.Na incubatie oogst je de cellen. Resuspendie van het HAT-medium en kweek in een 96-well plaat geënt met peritoneale macrofagen. Voeg na vijf dagen 100 microliter vers HAT-medium toe aan elk putje.En nogmaals na vijf dagen incubatie, vervang het medium door HAT-medium. Gebruik een microtiterplaat bedekt met vijf microgram per milliliter APN-eiwit verdund in 0,05 molaire PBS om monoklonale antilichamen in het hybridomas-supernatant te analyseren met behulp van ELISA-assay. Kweek de pET28a plus recombinante antilichamen aminopeptidase NBL21 getransformeerde bacteriën in de aanwezigheid van 0,4 millimolaire bèta-d-1-thiogalactopyranoside in een orbitale shaker bij 37 graden Celsius gedurende 10 uur.Zaai 100 microliter 0,5 keer 10 tot de vijfde ovariumcellen van de Chinese hamster per put in een 96-putplaat voor incubatie bij 37 graden Celsius en een 6% koolstofdioxide-atmosfeer gedurende 18 tot 24 uur. Wanneer de cellen 80 tot 90% samenvloeiing bereiken, verdun de pIRES2-zs Green one recombinante antilichamen aminopeptidase en plasmide met Opti-MEM tot een uiteindelijke concentratie van 0,1 microgram per microliter. Meng na vijf minuten de 50 microliter verdunde pIRES2-zs Green één recombinante antilichamen aminopeptidasen en plasmide met één microliter Lipofectamine 2000 en 49 microliter Opti-MEM.Voeg na 20 minuten incubatie 100 microliter van het mengsel toe aan elke put van een 96-putplaat met CHO-cellen. Vervang het medium vier tot zes uur na de transfectie door DMEM F12 aangevuld met 10% FBS. Voeg na 48 uur incubatie 400 microgram per microliter G418 toe aan elke put om de stabiel getransfecteerde cellen te selecteren.Na 10 dagen selectie met DMEM F12 medium aangevuld met 10% FBS en 400 microgram per microliter G418, sorteert u de cellen met fluorescentie-geactiveerde celsortering. Verdun de geoogste positieve cellen serieel. Zaai ze uit met gemiddeld 0,5 tot 2 cellen per put in een 96-well plaat en kweek ze in 37 graden Celsius, 6% koolstofdioxide-incubator.In representatieve microscopische analyse leken alle hybridomacellen rond, helder en helder. De gezuiverde monoklonale antilichamen met zware ketens van 50 kilodalton en lichte ketens van 25 kilodalton werden bevestigd door SDS-PAGE en werden gevonden in de gezuiverde ascites. De titers van deze anti-APN monoklonale antilichamen in kweeksupernatanten en ascites worden hier getoond.Isotypering van monoklonale antilichamen bij muizen onthulde dat antilichamen afgeleid van klonen 5B31, 5B36, 3C48, 5C51 en 6C56 immunoglobuline G2B-subklassen bezaten, terwijl APN 2A20 een immunoglobuline G2A-kappa-type antilichaam en monoklonaal antilichaam APN 3FD9, 3F10 en 10F3 behoorden tot immunoglobuline M-type en verwerkte kappa-lichte ketens. De meeste van deze monoklonale antilichamen vertoonden AV-waarden van meer dan 50%, wat aangeeft dat ze zich richtten op verschillende epitopen in de APN, terwijl het APN 5C51-antilichaam antigene epitopen herkende zoals die worden herkend door APN 3C48, 5B31 en 6C56 monoklonale antilichamen. Het versterkte APN 5B36 VHVL-gen werd geligeerd in een pET28a-positieve of pIRES2-zs Green-vector om respectievelijk de recombinante expressieplasmiden pET28a-positieve RABS APN en pIRES2-zs Green te construeren.De antilichamen uitgedrukt door zowel pET28a plus recombinante antilichamen aminopeptidase NBL21 en pIRES2-zs Green one recombinant antilichamen aminopeptidase NCHO cellen werden gezuiverd en geanalyseerd met behulp van ELISA- en IFA-assays. Echter, alleen het antilichaam uitgedrukt in het supernatant van pIRES2-zs Green een recombinant antilichamen aminopeptidase NCHO cellen herkennen het APN eiwit. De binding van APN 5B36 monoklonale antilichamen aan APN-eiwitten bereikte eerder een evenwicht dan recombinante antilichamen.Zuivering van de monoklonale antilichamen in het supernatant met behulp van eiwit A agarose is beter dan het gebruik van verzadigde ammoniaksulfaatprecipitatie.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Passieve Toediening van monoklonale antilichamen tegen H. capsulatum Ea schimmels

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay om pathogene geïnduceerde neutrofiele trans-epitheliale migratie te beoordelen

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Modelleren candidiasis van de slijmvliezen in larvale zebravis door zwemblaas Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Generering van recombinant humaan IgG Monoclonal Antibodies uit Onsterfelijk gesorteerde B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Evaluatie van de effectiviteit en toxiciteit van RNA&#39;s Targeting HIV-1 productie voor gebruik in Gene of Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Genereren van monoklonale muizenantilichamen door Hybridoma Technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive bemonstering van Mucosal voering vloeistof voor de kwantificering van In Vivo bovenste luchtwegen immuun-bemiddelaar niveaus

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Generatie van Escape varianten van het Influenza Virus monoklonale antistoffen neutraliseren

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Generatie van discriminatoire menselijke monoklonale antistoffen uit zeldzame antigeen-specifieke B-cellen in bloed circuleert

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

Generatie van monoklonale antistoffen tegen natuurlijke producten

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...