Name: production of monoclonal antibodies targeting aminopeptidase n in the porcine intestinal mucosal epithelium
Uploaded: 2021-05-18T13:00:00
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Cette étude a été soutenue par la subvention de la Fondation nationale chinoise des sciences (n ° 32072820, 31702242), des subventions de la bourse du gouvernement du Jiangsu pour les études à l’étranger (JS20190246) et des talents de haut niveau de la Fondation de recherche scientifique de l’Université de Yangzhou, un projet fondé par le programme académique prioritaire du développement de l’établissement d’enseignement supérieur du Jiangsu.

Toutes les expériences sur les animaux de cette étude ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Yangzhou (SYXK20200041).
1. Préparation de l’antigène de la protéine APN porcine
NOTE: La souche pET28a (+)-APN-BL21 (DE3) et les cellules APN exprimées de manière stable pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 ont été construites dans une étude précédente11.
<ol><li>Récupérer le...

<ol>
	<li>Chen, L., Lin, Y. L., Peng, G., Li, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+multifunctional+roles+of+mammalian+aminopeptidase+N.">Structural basis for multifunctional roles of mammalian aminopeptidase N.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States Of America. 109 (44), 17966-17971 (2012).</li><li>Mina-Osorio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+moonlighting+enzyme+CD13:+old+and+new+functions+to+target.">The moonlighting enzyme CD13: old and new functions to target.</a> Trends in Molecular Medicine. 14 (8), 361-371 (2008).</li><li>Lu, C., Amin, M. A., Fox, D. 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A., Ortega, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminopeptidase+N+(CD13)+is+involved+in+phagocytic+processes+in+human+dendritic+cells+and+macrophages.">Aminopeptidase N (CD13) is involved in phagocytic processes in human dendritic cells and macrophages.</a> BioMed Research International. 2013, 562984 (2013).</li><li>Melkebeek, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+aminopeptidase+N,+a+newly+identified+receptor+for+F4ac+fimbriae,+enhances+the+intestinal+mucosal+immune+response.">Targeting aminopeptidase N, a newly identified receptor for F4ac fimbriae, enhances the intestinal mucosal immune response.</a> Mucosal Immunology. 5 (6), 635-645 (2012).</li><li>Morgan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+aminopeptidase+N/CD13+produced+by+fibroblast-like+synoviocytes+in+rheumatoid+arthritis:+role+of+CD13+in+chemotaxis+of+cytokine-activated+T+cells+independent+of+enzymatic+activity.">Expression and function of aminopeptidase N/CD13 produced by fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis: role of CD13 in chemotaxis of cytokine-activated T cells independent of enzymatic activity.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 67 (1), 74-85 (2015).</li><li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+and+arthritogenic+properties+of+the+soluble+form+of+CD13.">Angiogenic and arthritogenic properties of the soluble form of CD13.</a> The Journal of Immunology. 203 (2), 360-369 (2019).</li><li>Rasschaert, K., Devriendt, B., Favoreel, H., Goddeeris, B. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies:+methods+and+clinical+laboratory+applications.">Monoclonal antibodies: methods and clinical laboratory applications.</a> Clinical Physiology and Biochemistry. 1 (2-5), 160-172 (1983).</li><li>Chan, C. E., Chan, A. H., Lim, A. P., Hanson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+efficiency+of+antibody+selection+from+semi-synthetic+scFv+and+non-immune+Fab+phage+display+libraries+against+protein+targets+for+rapid+development+of+diagnostic+immunoassays.">Comparison of the efficiency of antibody selection from semi-synthetic scFv and non-immune Fab phage display libraries against protein targets for rapid development of diagnostic immunoassays.</a> Journal of Immunological Methods. 373 (1-2), 79-88 (2011).</li><li>K&#246;hler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).</li><li>El Miedany, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MABS:+targeted+therapy+tailored+to+the+patient's+need.">MABS: targeted therapy tailored to the patient's need.</a> British Journal of Nursing. 24 (16), 4-13 (2015).</li><li>Castelli, M. S., McGonigle, P., Hornby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharmacology+and+therapeutic+applications+of+monoclonal+antibodies.">The pharmacology and therapeutic applications of monoclonal antibodies.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 7 (6), 00535 (2019).</li><li>Weiner, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+better+monoclonal+antibody-based+therapeutics.">Building better monoclonal antibody-based therapeutics.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).</li><li>Bakshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+single-domain+antibodies+as+carriers+for+targeted+vaccine+delivery+to+the+small+intestinal+epithelium.">Evaluating single-domain antibodies as carriers for targeted vaccine delivery to the small intestinal epithelium.</a> Journal of Controlled Release. 321, 416-429 (2020).</li><li>Kohler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> The Journal of Immunology. 174 (5), 2453-2455 (2005).</li><li>Chen, W., Liu, W. E., Li, Y. M., Luo, S., Zhong, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+preliminary+application+of+monoclonal+antibodies+to+the+receptor+binding+region+of+Clostridium+difficile+toxin+B.">Preparation and preliminary application of monoclonal antibodies to the receptor binding region of Clostridium difficile toxin B.</a> Molecular Medicine Reports. 12 (5), 7712-7720 (2015).</li><li>Levieux, D., Venien, A., Levieux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitopic+analysis+and+quantification+of+bovine+myoglobin+with+monoclonal+antibodies.">Epitopic analysis and quantification of bovine myoglobin with monoclonal antibodies.</a> Hybridoma. 14 (5), 435-442 (1995).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellin+and+F4+fimbriae+have+opposite+effects+on+biofilm+formation+and+quorum+sensing+in+F4ac++enterotoxigenic+Escherichia+coli.">Flagellin and F4 fimbriae have opposite effects on biofilm formation and quorum sensing in F4ac+ enterotoxigenic Escherichia coli.</a> Veterinary Microbiology. 168 (1), 148-153 (2014).</li><li>Heinrich, L., Tissot, N., Hartmann, D. J., Cohen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+results+obtained+by+ELISA+and+surface+plasmon+resonance+for+the+determination+of+antibody+affinity.">Comparison of the results obtained by ELISA and surface plasmon resonance for the determination of antibody affinity.</a> Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 13-22 (2010).</li><li>Vander Weken, H., Cox, E., Devriendt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+oral+subunit+vaccine+design.">Advances in oral subunit vaccine design.</a> Vaccines. 9, 1 (2020).</li><li>Baert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-glucan+microparticles+targeted+to+epithelial+APN+as+oral+antigen+delivery+system.">&#946;-glucan microparticles targeted to epithelial APN as oral antigen delivery system.</a> Journal of Controlled Release. 220, 149-159 (2015).</li><li>Neuberger, M. S., Williams, G. T., Fox, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+antibodies+possessing+novel+effector+functions.">Recombinant antibodies possessing novel effector functions.</a> Nature. 312 (5995), 604-608 (1984).</li></ol>

L’induction de l’immunité muqueuse est l’une des approches les plus efficaces pour contrer les agents pathogènes et pour prévenir et traiter diverses maladies. L’APN, une protéine membranaire fortement exprimée dans la muqueuse intestinale, est impliquée dans l’induction de la réponse immunitaire adaptative et dans l’endocytose virale et bactérienne médiée par les récepteurs 1,5,8. L’APN est utilisé com...

L’aminopeptidase N (APN), une enzyme de travail au noir appartenant à la famille des métalloprotéinases M1, agit comme marqueur tumoral, récepteur et molécule de signalisation via des voies dépendant des enzymes et indépendantes des enzymes 1,2. En plus de cliver les résidus d’acides aminés N-terminaux de divers peptides bioactifs pour la régulation de leur activité biologique, l’APN joue un rôle important dans la pathogenèse de diverses maladies inflammatoires. L’APN participe au traitement et à la présentation des antigènes par des peptides parés qui se lient étroitement aux molécules majeures du complexe d’histocompatibilité de classe II 2,3. L’APN exerce également des effets anti-inflammatoires en se liant aux récepteurs couplés aux protéines G participant à la transduction de signaux multiples, modulant la sécrétion de cytokines et contribuant à la phagocytose médiée par le récepteur gamma Fc dans la réponse immunitaire 4,5,6,7.
En tant qu’exopeptidase membranaire largement distribuée, l’APN est abondante dans la muqueuse intestinale grêle porcine et est étroitement associée à l’endocytose médiée par les récepteurs 1,5,8. L’APN reconnaît et lie la protéine de pointe du virus de la gastro-entérite transmissible pour l’entrée cellulaire, et interagit directement avec la sous-unité FaeG des fimbriae entérotoxinogènes Escherichia coli F4 pour affecter l’adhérence bactérienne avec les cellules hôtes 9,10,11. Ainsi, l’APN est une cible thérapeutique potentielle dans le traitement des maladies infectieuses virales et bactériennes.
Depuis le développement de la technologie des hybridomes et d’autres stratégies pour la production d’anticorps monoclonaux (mAbs) en 1975, les AcM ont été largement utilisés en immunothérapie, en administration de médicaments et en diagnostic12,13,14. Actuellement, les AcM sont utilisés avec succès pour traiter des maladies telles que le cancer, les maladies inflammatoires de l’intestin et la sclérose en plaques12,15. En raison de leur forte affinité et spécificité, les AcM peuvent être des cibles idéales dans le développement de conjugués anticorps-médicament (ADC) ou de nouveaux vaccins16,17. La protéine APN est essentielle pour délivrer sélectivement des antigènes à des cellules spécifiques et peut provoquer une réponse immunitaire muqueuse spécifique et forte contre les agents pathogènes sans aucune interférence, y compris une faible expression protéique, une inactivité enzymatique ou des changements structurels 5,8,18. Par conséquent, les produits thérapeutiques à base d’anticorps monoclonaux spécifiques de l’APN sont prometteurs contre les infections bactériennes et virales. Dans cette étude, nous décrivons la production d’anticorps monoclonaux spécifiques de l’APN à l’aide de la technologie de l’hybridome et l’expression d’anticorps recombinants anti-APN (rAbs) à l’aide de vecteurs procaryotes et eucaryotes. Le résultat indique que la protéine APN a été reconnue à la fois par les AcR exprimés dans les cellules pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO et les mAbs dérivés d’hybridomes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Complete Freund&#8217;s adjuvant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5881</td>
			<td>Animal immunization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>C1002</td>
			<td>Nuclear counterstain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody</td>
			<td>Abbkine</td>
			<td>A23310</td>
			<td>Indirect immunofluorescence analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced Cell Counting Kit-8</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>C0042</td>
			<td>Measurement&#160;of&#160;cell&#160;viability and vitality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10091</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneticin&#8482; Selective Antibiotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11811098</td>
			<td>Selective antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAT Supplement (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21060017</td>
			<td>Cell selection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11067030</td>
			<td>Cell selection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incomplete Freund&#8217;s adjuvant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5506</td>
			<td>Animal immunization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl &#946;-d-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5502</td>
			<td>Protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>ST102</td>
			<td>Bactericidal antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 STED confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>&#160;SP8 STED</td>
			<td>Fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine&#174; 2000 Reagent</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa&#8482; fluorescence-activated cell sorting</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACS LSRFortessa</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BOX 998</td>
			<td>ELISA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Nano Drop one</td>
			<td>Nucleic acid concentration detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019308</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10002917</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985088</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 1500</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10783641001</td>
			<td>Cell fusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript&#8482; 1st strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>RR047</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein A agarose</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>P2006</td>
			<td>Antibody protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protino&#174; Ni+-TED 2000 Packed Columns</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>745120.5</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SBA Clonotyping System-HRP</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>May-00</td>
			<td>Isotyping of mouse monoclonal antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seamless Cloning Kit</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>D7010S</td>
			<td>Construction of plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shake flasks</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>E3285</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>C0221A</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>&#160;170-3940</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Homogenizer</td>
			<td>Ningbo Xinzhi Biotechnology</td>
			<td>JY92-IIN</td>
			<td>Sample homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of monoclonal antibodies targeting aminopeptidase n in the porcine intestinal mucosal epithelium

L’aminopeptidase porcine N (APN), une métallopeptidase membranaire abondamment présente dans la muqueuse intestinale grêle, peut déclencher une réponse immunitaire muqueuse sans aucune interférence telle qu’une faible expression protéique, une inactivité enzymatique ou des changements structurels. Cela fait de l’APN un candidat attrayant dans le développement de vaccins qui ciblent sélectivement l’épithélium muqueux. Des études antérieures ont montré que l’APN est une protéine réceptrice à la fois pour Escherichia coli entérotoxinogène (E. coli) F4 et pour le virus de la gastro-entérite transmissible. Ainsi, l’APN est prometteur dans le développement de conjugués anticorps-médicament ou de nouveaux vaccins basés sur des anticorps spécifiques de l’APN. Dans cette étude, nous avons comparé la production d’anticorps monoclonaux spécifiques de l’APN (mAbs) en utilisant la technologie traditionnelle de l’hybridome et la méthode d’expression des anticorps recombinants. Nous avons également établi une lignée cellulaire d’ovaire de hamster chinois (CHO) à transfectation stable en utilisant pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN et une souche d’expression d’E. coli BL21(DE3) hébergeant le vecteur pET28a (+)-rAbs-APN. Les résultats montrent que les anticorps exprimés dans les cellules pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO et les AcM produits à l’aide d’hybridomes pourraient reconnaître et se lier à la protéine APN. Cela fournit la base pour une élucidation plus poussée de la fonction du récepteur APN pour le développement de thérapies ciblant différents épitopes spécifiques de l’APN.

Dans cette étude, la protéine APN soluble purifiée (2,12 mg/mL) a été utilisée pour l’immunisation des souris. Les souris immunisées avec la protéine APN quatre fois à des intervalles de 14 jours présentaient un titre d’anticorps plus élevé contre l’APN dans leurs sérums. Bien que 14 hybridomes aient été obtenus à l’aide des expériences de fusion, seulement 9 hybridomes ont survécu aux trois cycles continus de gel-dégel, ce qui a donné 9 clones stables qui ont sécrété des anticorps contre l...

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Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium

La protéine d’anticorps recombinante exprimée dans les cellules pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO et les anticorps monoclonaux produits à l’aide de la technologie traditionnelle de l’hybridome peut reconnaître et se lier à la protéine porcine aminopeptidase N (APN).

Production d’anticorps monoclonaux ciblant l’aminopeptidase N dans l’épithélium de la muqueuse intestinale porcine

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response ...

Les anticorps monoclonaux dérivés sont principalement utilisés dans les réactifs immunitaires thérapeutiques diagnostiques, ce qui souligne la nécessité de produire des anticorps stables et fiables en production limitée préparés. Les méthodes décrites ici ont prouvé que la production d’anticorps recombinants pouvait augmenter l’efficacité de la production d’anticorps monoclonaux et minimiser les coûts associés à la main-d’œuvre et au temps. Les méthodes sont utilisées pour développer l’aminopeptidase et les conjugués anticorps-médicament à base d’anticorps et d’autres produits thérapeutiques, ce qui aide à clarifier le rôle de l’APN dans la prévention et le traitement des infections bactériennes et virales.La démonstration de la procédure sera Yan Li, un étudiant de troisième cycle de mon laboratoire. Pour commencer, injectez par voie intrapéritonéale 100 microgrammes de protéine APN dans les souris femelles adultes sélectionnées pour un regain d’antigène final. Après trois jours d’injection, prélever la rate des souris et laver avec DMEM deux fois pour éliminer le sang et les cellules graisseuses.Filtrer la suspension de cellules de rate à l’aide d’une grille de cuivre de 200 mailles pour éliminer les débris tissulaires et récolter les cellules de la rate en utilisant la centrifugation pour enlever la membrane de la rate. Ensemencer les cellules myélomateuses SP20 de la souris dans une fiole de 25 centimètres carrés contenant cinq millilitres de DMEM complétée par 6% de sérum bovin fœtal et cultiver les cellules à 37 degrés Celsius et 6% de dioxyde de carbone dans une atmosphère pour maintenir la viabilité cellulaire. Après cinq à six jours de culture, les cellules devraient atteindre 80 à 90% de confluence après la réanimation et apparaître rondes, brillantes et claires au microscope.Un jour avant l’hybridation, prélever des macrophages dans les cavités péritonéales des souris. Ensemencez les macrophages péritonéaux à une densité de 0,1 à 0,2 fois 10 à la cinquième par millilitre dans des plaques de 96 puits, contenant chacune 100 microlitres de milieu HAT et les incuber pendant la nuit. Pour l’hybridation, aspirez doucement les cellules SP20 avec une pipette de 8 à 10 bouteilles et suspendez-les dans 10 millilitres de milieu DMEM sans sérum.Lavez les cellules avec du DMEM frais et centrifugez-les deux fois, puis remettez-les en suspension dans 10 millilitres de DMEM. Mélanger les cellules quantifiées de la rate avec des cellules SB20 dans un rapport de 10:1 et les transférer dans des tubes de 50 millilitres. Après centrifugation, jeter le surnageant et recueillir les pastilles au fond des tubes.Tapotez le tube pour desserrer les granulés avant l’hybridation. À l’aide d’un compte-gouttes, ajoutez un millilitre de polyéthylèneglycol 1500 préchauffé à 37 degrés Celsius goutte à goutte à la pastille de cellule desserrée pendant 45 secondes tout en tournant doucement le fond du tube. Ensuite, ajoutez lentement un millilitre de DMEM préchauffé à 37 degrés Celsius au mélange pendant 90 secondes, suivi de 30 millilitres supplémentaires de DMEM frais et placez le tube de fusion dans un bain-marie de 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.Après l’incubation, récoltez les cellules. Resuspendre le milieu HAT et la culture dans une plaque de 96 puits inoculée avec des macrophages péritonéaux. Après cinq jours, ajoutez 100 microlitres de milieu HAT frais à chaque puits.Et encore une fois après cinq jours d’incubation, remplacez le milieu par un milieu HAT. Utiliser une plaque de microtitrage recouverte de cinq microgrammes par millilitre de protéine APN diluée dans 0,05 molaire PBS pour analyser les anticorps monoclonaux dans le surnageant de l’hybridome à l’aide du test ELISA. Cultiver les anticorps pET28a plus les anticorps recombinants aminopeptidase NBL21 transformés bactéries en présence de bêta-d-1-thiogalactopyranoside millimolaire dans un agitateur orbital à 37 degrés Celsius pendant 10 heures.Ensemencez 100 microlitres 0,5 fois 10 à la cinquième cellule ovarienne de hamster chinois par puits dans une plaque de 96 puits pour l’incubation à 37 degrés Celsius et une atmosphère de dioxyde de carbone à 6% pendant 18 à 24 heures. Lorsque les cellules atteignent 80 à 90% de confluence, diluer les anticorps recombinants pIRES2-zs Green one aminopeptidase et plasmide avec Opti-MEM jusqu’à une concentration finale de 0,1 microgramme par microlitre. Après cinq minutes, mélanger les 50 microlitres de pIRES2-zs Green dilué un anticorps recombinant aminopeptidases et plasmide avec un microlitre de Lipofectamine 2000 et 49 microlitres d’Opti-MEM.Après 20 minutes d’incubation, ajouter 100 microlitres du mélange à chaque puits d’une plaque de 96 puits contenant des cellules CHO. Quatre à six heures après la transfection, remplacer le milieu par du DMEM F12 complété par 10%FBS. Après 48 heures d’incubation, ajoutez 400 microgrammes par microlitre G418 à chaque puits pour sélectionner les cellules transfectées de manière stable.Après 10 jours de sélection à l’aide d’un milieu DMEM F12 complété par 10% FBS et 400 microgrammes par microlitre G418, triez les cellules avec un tri cellulaire activé par fluorescence. Diluer en série les cellules positives récoltées. Ensemencez-les en moyenne à 0,5 à 2 cellules par puits dans une plaque de 96 puits et cultivez-les dans un incubateur de dioxyde de carbone à 6% à 37 degrés Celsius.Dans une analyse microscopique représentative, toutes les cellules d’hybridomes apparaissaient rondes, brillantes et claires. Les anticorps monoclonaux purifiés possédant des chaînes lourdes de 50 kilodaltons et légères de 25 kilodaltons ont été confirmés par SDS-PAGE et ont été trouvés dans l’ascite purifiée. Les titres de ces anticorps monoclonaux anti-APN dans les surnageants de culture et l’ascite sont présentés ici.L’isotypage des anticorps monoclonaux de souris a révélé que les anticorps dérivés des clones 5B31, 5B36, 3C48, 5C51 et 6C56 possédaient des sous-classes d’immunoglobuline G2B tandis que l’APN 2A20 était un anticorps de type immunoglobuline G2A kappa et que l’anticorps monoclonal APN 3FD9, 3F10 et 10F3 appartenait à l’immunoglobuline de type M et traitait les chaînes légères kappa. La plupart de ces anticorps monoclonaux présentaient des valeurs AV supérieures à 50%, ce qui indique qu’ils ciblaient différents épitopes dans l’APN, tandis que l’anticorps APN 5C51 reconnaissait des épitopes antigéniques comme ceux reconnus par les anticorps monoclonaux APN 3C48, 5B31 et 6C56. Le gène APN 5B36 VHVL amplifié a été ligaturé en un vecteur pET28a positif ou pIRES2-zs Green pour construire les plasmides d’expression recombinants pET28a positif RABS APN et pIRES2-zs Green un RABS APN respectivement.Les anticorps exprimés par pET28a plus les anticorps recombinants aminopeptidase NBL21 et pIRES2-zs Green un anticorps recombinant aminopeptidase cellules NCHO ont été purifiés et analysés à l’aide de tests ELISA et IFA. Cependant, seul l’anticorps exprimé dans le surnageant des anticorps recombinants pIRES2-zs Green one aminopeptidase des cellules NCHO reconnaît la protéine APN. La liaison des anticorps monoclonaux APN 5B36 aux protéines APN a atteint un équilibre plus tôt que les anticorps recombinants.La purification des anticorps monoclonaux dans le surnageant à l’aide de la protéine A agarose est meilleure que l’utilisation de la précipitation saturée de sulfate d’ammoniac.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

Recherche

Immunologie et infection

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