Name: production of monoclonal antibodies targeting aminopeptidase n in the porcine intestinal mucosal epithelium
Uploaded: 2021-05-18T13:00:00
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Diese Studie wurde durch das Stipendium der Chinese National Science Foundation (Nr. 32072820, 31702242), Zuschüsse aus dem Jiangsu Government Scholarship for Overseas Studies (JS20190246) und High-Level Talents of Yangzhou University Scientific Research Foundation unterstützt, ein Projekt, das vom Priority Academic Program of Development der Jiangsu High Education Institution gegründet wurde.

Alle Tierversuche in dieser Studie wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Universität Yangzhou genehmigt (SYXK20200041).
1. Herstellung des porcinen APN-Protein-Antigens
ANMERKUNG: Der Stamm pET28a (+)-APN-BL21 (DE3) und die stabil exprimierten APN-Zellen pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 wurden in einer früheren Studie konstruiert11.
<ol><li>Bakterien aus einem gefrorenen Glycerinvorrat gewinnen und auf Luria-Bertani (LB)-Platten ...

<ol>
	<li>Chen, L., Lin, Y. L., Peng, G., Li, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+multifunctional+roles+of+mammalian+aminopeptidase+N.">Structural basis for multifunctional roles of mammalian aminopeptidase N.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States Of America. 109 (44), 17966-17971 (2012).</li><li>Mina-Osorio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+moonlighting+enzyme+CD13:+old+and+new+functions+to+target.">The moonlighting enzyme CD13: old and new functions to target.</a> Trends in Molecular Medicine. 14 (8), 361-371 (2008).</li><li>Lu, C., Amin, M. A., Fox, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD13/Aminopeptidase+N+is+a+potential+therapeutic+target+for+inflammatory+disorders.">CD13/Aminopeptidase N is a potential therapeutic target for inflammatory disorders.</a> The Journal of Immunology. 204 (1), 3-11 (2020).</li><li>Villase&#241;or-Cardoso, M. I., Frausto-Del-R&#237;o, D. A., Ortega, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminopeptidase+N+(CD13)+is+involved+in+phagocytic+processes+in+human+dendritic+cells+and+macrophages.">Aminopeptidase N (CD13) is involved in phagocytic processes in human dendritic cells and macrophages.</a> BioMed Research International. 2013, 562984 (2013).</li><li>Melkebeek, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+aminopeptidase+N,+a+newly+identified+receptor+for+F4ac+fimbriae,+enhances+the+intestinal+mucosal+immune+response.">Targeting aminopeptidase N, a newly identified receptor for F4ac fimbriae, enhances the intestinal mucosal immune response.</a> Mucosal Immunology. 5 (6), 635-645 (2012).</li><li>Morgan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+aminopeptidase+N/CD13+produced+by+fibroblast-like+synoviocytes+in+rheumatoid+arthritis:+role+of+CD13+in+chemotaxis+of+cytokine-activated+T+cells+independent+of+enzymatic+activity.">Expression and function of aminopeptidase N/CD13 produced by fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis: role of CD13 in chemotaxis of cytokine-activated T cells independent of enzymatic activity.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 67 (1), 74-85 (2015).</li><li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+and+arthritogenic+properties+of+the+soluble+form+of+CD13.">Angiogenic and arthritogenic properties of the soluble form of CD13.</a> The Journal of Immunology. 203 (2), 360-369 (2019).</li><li>Rasschaert, K., Devriendt, B., Favoreel, H., Goddeeris, B. M., Cox, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin-mediated+endocytosis+and+transcytosis+of+enterotoxigenic+Escherichia+coli+F4+fimbriae+in+porcine+intestinal+epithelial+cells.">Clathrin-mediated endocytosis and transcytosis of enterotoxigenic Escherichia coli F4 fimbriae in porcine intestinal epithelial cells.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 137 (3-4), 243-250 (2010).</li><li>Reguera, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+bases+of+coronavirus+attachment+to+host+aminopeptidase+N+and+its+inhibition+by+neutralizing+antibodies.">Structural bases of coronavirus attachment to host aminopeptidase N and its inhibition by neutralizing antibodies.</a> PLoS Pathogens. 8 (8), 100859 (2012).</li><li>Delmas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminopeptidase+N+is+a+major+receptor+for+the+entero-pathogenic+coronavirus+TGEV.">Aminopeptidase N is a major receptor for the entero-pathogenic coronavirus TGEV.</a> Nature. 357 (6377), (1992).</li><li>Xia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+aminopeptidase+N+binds+to+F4++enterotoxigenic+Escherichia+coli+fimbriae.">Porcine aminopeptidase N binds to F4+ enterotoxigenic Escherichia coli fimbriae.</a> Veterinary Research. 47 (1), 24 (2016).</li><li>Nakamura, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies:+methods+and+clinical+laboratory+applications.">Monoclonal antibodies: methods and clinical laboratory applications.</a> Clinical Physiology and Biochemistry. 1 (2-5), 160-172 (1983).</li><li>Chan, C. E., Chan, A. H., Lim, A. P., Hanson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+efficiency+of+antibody+selection+from+semi-synthetic+scFv+and+non-immune+Fab+phage+display+libraries+against+protein+targets+for+rapid+development+of+diagnostic+immunoassays.">Comparison of the efficiency of antibody selection from semi-synthetic scFv and non-immune Fab phage display libraries against protein targets for rapid development of diagnostic immunoassays.</a> Journal of Immunological Methods. 373 (1-2), 79-88 (2011).</li><li>K&#246;hler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).</li><li>El Miedany, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MABS:+targeted+therapy+tailored+to+the+patient's+need.">MABS: targeted therapy tailored to the patient's need.</a> British Journal of Nursing. 24 (16), 4-13 (2015).</li><li>Castelli, M. S., McGonigle, P., Hornby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharmacology+and+therapeutic+applications+of+monoclonal+antibodies.">The pharmacology and therapeutic applications of monoclonal antibodies.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 7 (6), 00535 (2019).</li><li>Weiner, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+better+monoclonal+antibody-based+therapeutics.">Building better monoclonal antibody-based therapeutics.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).</li><li>Bakshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+single-domain+antibodies+as+carriers+for+targeted+vaccine+delivery+to+the+small+intestinal+epithelium.">Evaluating single-domain antibodies as carriers for targeted vaccine delivery to the small intestinal epithelium.</a> Journal of Controlled Release. 321, 416-429 (2020).</li><li>Kohler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> The Journal of Immunology. 174 (5), 2453-2455 (2005).</li><li>Chen, W., Liu, W. E., Li, Y. M., Luo, S., Zhong, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+preliminary+application+of+monoclonal+antibodies+to+the+receptor+binding+region+of+Clostridium+difficile+toxin+B.">Preparation and preliminary application of monoclonal antibodies to the receptor binding region of Clostridium difficile toxin B.</a> Molecular Medicine Reports. 12 (5), 7712-7720 (2015).</li><li>Levieux, D., Venien, A., Levieux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitopic+analysis+and+quantification+of+bovine+myoglobin+with+monoclonal+antibodies.">Epitopic analysis and quantification of bovine myoglobin with monoclonal antibodies.</a> Hybridoma. 14 (5), 435-442 (1995).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellin+and+F4+fimbriae+have+opposite+effects+on+biofilm+formation+and+quorum+sensing+in+F4ac++enterotoxigenic+Escherichia+coli.">Flagellin and F4 fimbriae have opposite effects on biofilm formation and quorum sensing in F4ac+ enterotoxigenic Escherichia coli.</a> Veterinary Microbiology. 168 (1), 148-153 (2014).</li><li>Heinrich, L., Tissot, N., Hartmann, D. J., Cohen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+results+obtained+by+ELISA+and+surface+plasmon+resonance+for+the+determination+of+antibody+affinity.">Comparison of the results obtained by ELISA and surface plasmon resonance for the determination of antibody affinity.</a> Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 13-22 (2010).</li><li>Vander Weken, H., Cox, E., Devriendt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+oral+subunit+vaccine+design.">Advances in oral subunit vaccine design.</a> Vaccines. 9, 1 (2020).</li><li>Baert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-glucan+microparticles+targeted+to+epithelial+APN+as+oral+antigen+delivery+system.">&#946;-glucan microparticles targeted to epithelial APN as oral antigen delivery system.</a> Journal of Controlled Release. 220, 149-159 (2015).</li><li>Neuberger, M. S., Williams, G. T., Fox, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+antibodies+possessing+novel+effector+functions.">Recombinant antibodies possessing novel effector functions.</a> Nature. 312 (5995), 604-608 (1984).</li></ol>

Die Induktion der Schleimhautimmunität ist einer der effektivsten Ansätze zur Bekämpfung von Krankheitserregern und zur Vorbeugung und Behandlung verschiedener Krankheiten. APN, ein hochexprimiertes membrangebundenes Protein in der Darmschleimhaut, ist an der Induktion der adaptiven Immunantwort und an der rezeptorvermittelten viralen und bakteriellen Endozytose beteiligt 1,5,8. APN wird als Antigenpartikel in vielen Formaten...

Aminopeptidase N (APN), ein Schwarzlichtenzym, das zur Familie der Metalloproteinase M1 gehört, fungiert über enzymabhängige und enzymunabhängige Signalwege als Tumormarker, Rezeptor und Signalmolekül 1,2. Neben der Spaltung der N-terminalen Aminosäurereste verschiedener bioaktiver Peptide zur Regulation ihrer biologischen Aktivität spielt APN eine wichtige Rolle bei der Pathogenese verschiedener entzündlicher Erkrankungen. APN ist an der Antigenprozessierung und -präsentation durch getrimmte Peptide beteiligt, die fest an wichtige Histokompatibilitätskomplexe der Klasse II binden 2,3. APN übt auch entzündungshemmende Wirkungen aus, indem es an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren bindet, die an der multiplen Signaltransduktion beteiligt sind, die Zytokinsekretion moduliert und zur Fc-Gammarezeptor-vermittelten Phagozytose in der Immunantwort beiträgt 4,5,6,7.
Als weit verbreitete membrangebundene Exopeptidase ist APN in der Dünndarmschleimhaut des Schweins reichlich vorhanden und steht in engem Zusammenhang mit der rezeptorvermittelten Endozytose 1,5,8. APN erkennt und bindet das Spike-Protein des transmissiblen Gastroenteritis-Virus für den Zelleintritt und interagiert direkt mit der FaeG-Untereinheit der enterotoxigenen Escherichia coli F4-Fimbrien, um die bakterielle Adhärenz mit Wirtszellen zu beeinflussen 9,10,11. Damit ist APN ein potenzielles therapeutisches Ziel bei der Behandlung viraler und bakterieller Infektionskrankheiten.
Seit der Entwicklung der Hybridomtechnologie und anderer Strategien für die Produktion monoklonaler Antikörper (mAbs) im Jahr 1975 werden mAbs in großem Umfang in der Immuntherapie, der Verabreichung von Medikamenten und der Diagnose eingesetzt12,13,14. Derzeit werden mAbs erfolgreich zur Behandlung von Krankheiten wie Krebs, entzündlichen Darmerkrankungen und Multipler Sklerose eingesetzt12,15. Aufgrund ihrer starken Affinität und Spezifität können mAbs ideale Ziele bei der Entwicklung von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten (ADC) oder neuen Impfstoffen sein16,17. Das APN-Protein ist entscheidend für die selektive Abgabe von Antigenen an bestimmte Zellen und kann eine spezifische und starke mukosale Immunantwort gegen Krankheitserreger hervorrufen, ohne dass es zu Störungen kommt, einschließlich geringer Proteinexpression, Enzyminaktivität oder struktureller Veränderungen 5,8,18. Daher sind Therapeutika, die auf APN-spezifischen mAbs basieren, vielversprechend gegen bakterielle und virale Infektionen. In dieser Arbeit beschreiben wir die Produktion von APN-spezifischen mAbs mit Hilfe der Hybridomtechnologie und die Expression von anti-APN rekombinanten Antikörpern (rAbs) mit Hilfe von prokaryotischen und eukaryotischen Vektoren. Das Ergebnis deutet darauf hin, dass das APN-Protein sowohl von rAbs, die in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-Zellen exprimiert werden, als auch von Hybridom-abgeleiteten mAbs erkannt wurde.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Complete Freund&#8217;s adjuvant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5881</td>
			<td>Animal immunization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>C1002</td>
			<td>Nuclear counterstain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody</td>
			<td>Abbkine</td>
			<td>A23310</td>
			<td>Indirect immunofluorescence analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced Cell Counting Kit-8</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>C0042</td>
			<td>Measurement&#160;of&#160;cell&#160;viability and vitality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10091</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneticin&#8482; Selective Antibiotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11811098</td>
			<td>Selective antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAT Supplement (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21060017</td>
			<td>Cell selection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11067030</td>
			<td>Cell selection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incomplete Freund&#8217;s adjuvant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5506</td>
			<td>Animal immunization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl &#946;-d-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5502</td>
			<td>Protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>ST102</td>
			<td>Bactericidal antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 STED confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>&#160;SP8 STED</td>
			<td>Fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine&#174; 2000 Reagent</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa&#8482; fluorescence-activated cell sorting</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACS LSRFortessa</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BOX 998</td>
			<td>ELISA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Nano Drop one</td>
			<td>Nucleic acid concentration detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019308</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10002917</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985088</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 1500</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10783641001</td>
			<td>Cell fusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript&#8482; 1st strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>RR047</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein A agarose</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>P2006</td>
			<td>Antibody protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protino&#174; Ni+-TED 2000 Packed Columns</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>745120.5</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SBA Clonotyping System-HRP</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>May-00</td>
			<td>Isotyping of mouse monoclonal antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seamless Cloning Kit</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>D7010S</td>
			<td>Construction of plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shake flasks</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>E3285</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>C0221A</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>&#160;170-3940</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Homogenizer</td>
			<td>Ningbo Xinzhi Biotechnology</td>
			<td>JY92-IIN</td>
			<td>Sample homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of monoclonal antibodies targeting aminopeptidase n in the porcine intestinal mucosal epithelium

Porcine Aminopeptidase N (APN), eine membrangebundene Metallopeptidase, die reichlich in der Dünndarmschleimhaut vorkommt, kann eine mukosale Immunantwort auslösen, ohne dass es zu Störungen wie geringer Proteinexpression, Enzyminaktivität oder strukturellen Veränderungen kommt. Dies macht APN zu einem attraktiven Kandidaten für die Entwicklung von Impfstoffen, die selektiv auf das Schleimhautepithel abzielen. Frühere Studien haben gezeigt, dass APN ein Rezeptorprotein sowohl für enterotoxigene Escherichia coli (E. coli) F4 als auch für das übertragbare Gastroenteritisvirus ist. Daher ist APN vielversprechend bei der Entwicklung von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten oder neuartigen Impfstoffen auf Basis von APN-spezifischen Antikörpern. In dieser Studie verglichen wir die Produktion von APN-spezifischen monoklonalen Antikörpern (mAbs) unter Verwendung der traditionellen Hybridomtechnologie und der rekombinanten Antikörperexpressionsmethode. Wir etablierten auch eine stabil transfizierte Ovarialzelllinie des Chinesischen Hamsters (CHO) unter Verwendung von pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN und einem E. coli-Expressionsstamm BL21(DE3), der den pET28a (+)-rAbs-APN-Vektor beherbergt . Die Ergebnisse zeigen, dass Antikörper, die in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-Zellen exprimiert werden, und mAbs, die mit Hilfe von Hybridomen hergestellt werden, das APN-Protein erkennen und daran binden können. Dies bildet die Grundlage für die weitere Aufklärung der Funktion des APN-Rezeptors für die Entwicklung von Therapeutika, die auf verschiedene APN-spezifische Epitope abzielen.

In dieser Studie wurde das gereinigte lösliche APN-Protein (2,12 mg/ml) für die Immunisierung von Mäusen verwendet. Mäuse, die viermal im Abstand von 14 Tagen mit dem APN-Protein immunisiert wurden, wiesen in ihren Seren einen höheren Antikörpertiter gegen APN auf. Obwohl mit den Fusionsexperimenten 14 Hybridome gewonnen wurden, überlebten nur 9 Hybridome die drei kontinuierlichen Gefrier-Tau-Zyklen, was zu 9 stabilen Klonen führte, die Antikörper gegen APN sezernierten. Alle diese Zellen sind rund, hell und kla...

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Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium

Das rekombinante Antikörperprotein, das in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-Zellen und monoklonalen Antikörpern, die mit der traditionellen Hybridomtechnologie hergestellt werden, exprimiert wird, kann das porcine Aminopeptidase N (APN)-Protein erkennen und daran binden.

Produktion von monoklonalen Antikörpern gegen Aminopeptidase N im Darmschleimhautepithel des Schweins

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response ...

Abgeleitete monoklonale Antikörper werden hauptsächlich in diagnostischen therapeutischen Immunreagenzien verwendet, was die Notwendigkeit unterstreicht, stabile und zuverlässige Antikörper in begrenzter Produktion herzustellen. Die hier beschriebenen Methoden zeigten, dass die Produktion rekombinanter Antikörper die Effizienz der Produktion von monoklonalen Antikörpern steigern und die damit verbundenen Arbeits- und Zeitkosten minimieren kann. Die Methoden werden zur Entwicklung von Aminopeptidase- und Antikörper-basierten Antikörper-Wirkstoffkonjugaten und anderen therapeutischen Produkten verwendet, die zur Klärung der Rolle von APN bei der Prävention und Behandlung von bakteriellen und viralen Infektionen beitragen.Yan Li, ein Doktorand aus meinem Labor, wird das Verfahren vorführen. Zu Beginn werden den ausgewählten erwachsenen weiblichen Mäusen intraperitoneal 100 Mikrogramm APN-Protein injiziert, um einen endgültigen Antigen-Boost zu erhalten. Nach dreitägiger Injektion die Milz von Mäusen entnehmen und zweimal mit DMEM waschen, um Blut- und Fettzellen zu entfernen.Filtern Sie die Milzzellsuspension mit einem 200-Mesh-Kupfergitter, um Gewebetrümmer zu entfernen, und entnehmen Sie Milzzellen durch Zentrifugation, um die Milzmembran zu entfernen. Säen Sie die SP20-Myelomzellen der Maus in einen 25 Quadratzentimeter großen Kolben, der fünf Milliliter DMEM enthält, ergänzt mit 6 % fötalem Kälberserum, und kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 6 % Kohlendioxidatmosphäre, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten. Nach fünf bis sechs Tagen Kultur sollten die Zellen nach der Reanimation eine Konfluenz von 80 bis 90 % erreichen und unter dem Mikroskop rund, hell und klar erscheinen.Einen Tag vor der Hybridisierung sammeln Sie Makrophagen aus den Bauchhöhlen der Mäuse. Peritonealmakrophagen werden in einer Dichte von 0,1 bis 0,2 mal 10 bis fünf pro Milliliter in 96-Well-Platten mit jeweils 100 Mikrolitern HAT-Medium ausgesät und über Nacht inkubiert. Für die Hybridisierung werden SP20-Zellen vorsichtig mit einer Pipette von 8 bis 10 Flaschen abgesaugt und in 10 Millilitern serumfreiem DMEM-Medium suspendiert.Waschen Sie die Zellen mit frischem DMEM und zentrifugieren Sie sie zweimal, dann resuspendieren Sie sie in 10 Milliliter DMEM. Mischen Sie die quantifizierten Milzzellen mit SB20-Zellen im Verhältnis 10:1 und überführen Sie sie in 50-Milliliter-Röhrchen. Entsorgen Sie nach dem Zentrifugieren den Überstand und sammeln Sie die Pellets am Boden der Röhrchen.Klopfen Sie auf das Röhrchen, um die Pellets vor der Hybridisierung zu lösen. Geben Sie mit einer Pipette einen Milliliter auf 37 Grad Celsius vorgewärmtes Polyethylenglykol 1500 über 45 Sekunden tropfenweise in das gelöste Zellpellet, während Sie den Boden der Tube vorsichtig drehen. Geben Sie dann langsam einen Milliliter auf 37 Grad Celsius vorgewärmtes DMEM für 90 Sekunden in die Mischung, gefolgt von weiteren 30 Millilitern frischem DMEM und legen Sie das Fusionsröhrchen für 30 Minuten in ein 37 Grad Celsius warmes Wasserbad.Nach der Inkubation werden die Zellen geerntet. Resuspendieren Sie das HAT-Medium und die Kultur in einer 96-Well-Platte, die mit Peritonealmakrophagen inokuliert wurde. Geben Sie nach fünf Tagen 100 Mikroliter frisches HAT-Medium in jede Vertiefung.Ersetzen Sie das Medium nach fünf Tagen Inkubationszeit durch HAT-Medium. Verwenden Sie eine Mikrotiterplatte, die mit fünf Mikrogramm APN-Protein pro Milliliter beschichtet ist, das in 0,05 molaren PBS verdünnt ist, um monoklonale Antikörper im Hybridomüberstand mit einem ELISA-Assay zu analysieren. Züchten Sie die pET28a plus rekombinanten Antikörper Aminopeptidase NBL21 transformierten Bakterien in Gegenwart von 0,4 millimolaren beta-d-1-thiogalactopyranosid in einem orbitalen Shaker bei 37 Grad Celsius für 10 Stunden.Samen: 100 Mikroliter 0,5 mal 10 bis zum fünften Eierstockzellen des chinesischen Hamsters pro Vertiefung in eine 96-Well-Platte, um sie 18 bis 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und einer 6%igen Kohlendioxidatmosphäre zu inkubieren. Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80 bis 90 % erreicht haben, werden die rekombinanten pIRES2-zs Green one-Antikörper Aminopeptidase und Plasmid mit Opti-MEM auf eine Endkonzentration von 0,1 Mikrogramm pro Mikroliter verdünnt. Mischen Sie nach fünf Minuten die 50 Mikroliter verdünnte rekombinante pIRES2-zs Green one-Antikörper, Aminopeptidasen und Plasmid mit einem Mikroliter Lipofectamin 2000 und 49 Mikrolitern Opti-MEM.Nach 20-minütiger Inkubation geben Sie 100 Mikroliter der Mischung in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit CHO-Zellen. Vier bis sechs Stunden nach der Transfektion wird das Medium durch DMEM F12 ersetzt, das mit 10 % FBS ergänzt wird. Nach 48 Stunden Inkubation werden 400 Mikrogramm pro Mikroliter G418 in jede Vertiefung gegeben, um die stabil transfizierten Zellen auszuwählen.Nach 10-tägiger Selektion mit DMEM F12-Medium, ergänzt mit 10 % FBS und 400 Mikrogramm pro Mikroliter G418, werden die Zellen mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung sortiert. Verdünnen Sie die geernteten positiven Zellen seriell. Säen Sie sie mit durchschnittlich 0,5 bis 2 Zellen pro Vertiefung in einer 96-Well-Platte aus und kultivieren Sie sie in einem Inkubator mit 6 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius.In der repräsentativen mikroskopischen Analyse erschienen alle Hybridomzellen rund, hell und klar. Die gereinigten monoklonalen Antikörper mit schweren 50-Kilodalton- und leichten 25-Kilodalton-Ketten wurden durch SDS-PAGE bestätigt und in den gereinigten Aszites gefunden. Die Titer dieser monoklonalen Anti-APN-Antikörper in Kulturüberständen und Aszites sind hier dargestellt.Die Isotypisierung von monoklonalen Antikörpern in der Maus zeigte, dass Antikörper, die von den Klonen 5B31, 5B36, 3C48, 5C51 und 6C56 stammten, Immunglobulin-G2B-Subklassen besaßen, während APN 2A20 ein Immunglobulin-Antikörper vom G2A-Kappa-Typ und der monoklonale Antikörper APN 3FD9, 3F10 und 10F3 zum Immunglobulin-M-Typ und prozessierte Kappa-Leichtketten gehörten. Die meisten dieser monoklonalen Antikörper wiesen AV-Werte von über 50% auf, was darauf hindeutet, dass sie auf verschiedene Epitope im APN abzielten, während der APN 5C51-Antikörper antigene Epitope erkannte, wie sie von den monoklonalen APN-Antikörpern 3C48, 5B31 und 6C56 erkannt wurden. Das amplifizierte APN 5B36 VHVL-Gen wurde in einen pET28a-positiven oder pIRES2-zs-Green-Vektor ligiert, um die rekombinanten Expressionsplasmide pET28a-positives RABS-APN bzw. pIRES2-zs-Green-RABS-APN zu konstruieren.Die Antikörper, die sowohl von pET28a als auch von rekombinanten Antikörpern Aminopeptidase NBL21 und pIRES2-zs Green one rekombinanten Antikörpern exprimiert wurden, wurden aufgereinigt und mittels ELISA- und IFA-Assays analysiert. Allerdings erkennen nur die Antikörper, die im Überstand der pIRES2-zs Green exprimiert werden, rekombinante Antikörper, Aminopeptidase NCHO-Zellen, das APN-Protein. Die Bindung von monoklonalen APN 5B36-Antikörpern an APN-Proteine erreichte früher ein Gleichgewicht als rekombinante Antikörper.Die Aufreinigung der monoklonalen Antikörper im Überstand mit Protein-A-Agarose ist besser als die Verwendung von gesättigter Ammoniumsulfat-Fällung.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Passive Verwaltung von monoklonalen Antikörpern gegen H. capsulatum Ua Pilzpathogene

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

Forschung

Immunologie und Infektion

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay zur Bewertung pathogeninduzierter Neutrophiler Transepithelmigration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Modellierung Mucosal Candidiasis in Zebrafisch-Larven von Schwimmblase Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Erzeugung von rekombinanten humanen IgG monoklonalen Antikörpern aus Immortalisierte Sortiert B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNAs Targeting HIV-1-Produktion für den Einsatz in Gene oder Arzneimitteltherapie

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridomtechnologie

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Nicht-invasive Probenahme von Schleimhaut-Flüssigkeit für die Quantifizierung von In Vivo oberen Atemwegen immun-Mediator-Level

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Generation von Escape Varianten des Influenza-Virus Monoclonal Antikörper neutralisieren

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Generation von diskriminierendem menschlichen monoklonalen Antikörpern aus seltenen Antigen-spezifische B-Zellen im Blut zirkulierenden

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

Generierung von monoklonalen Antikörpern gegen Naturprodukte

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...