Name: production of monoclonal antibodies targeting aminopeptidase n in the porcine intestinal mucosal epithelium
Uploaded: 2021-05-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium at JoVE.com

इस अध्ययन को चीनी राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान (संख्या 32072820, 31702242), विदेशी अध्ययन के लिए जियांग्सू सरकार छात्रवृत्ति (जेएस 20190246) और यंग्ज़हौ विश्वविद्यालय वैज्ञानिक अनुसंधान फाउंडेशन के उच्च-स्तरीय प्रतिभाओं से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, जो विकास जियांग्सू उच्च शिक्षा संस्थान के प्राथमिकता शैक्षणिक कार्यक्रम द्वारा स्थापित एक परियोजना है।

इस अध्ययन में सभी पशु प्रयोगों को यंग्ज़हौ विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (SYXK20200041) द्वारा अनुमोदित किया गया था।
1. पोर्सिन एपीएन प्रोटीन एंटीजन की तैयारी
नोट: पीईटी...

<ol>
	<li>Chen, L., Lin, Y. L., Peng, G., Li, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+multifunctional+roles+of+mammalian+aminopeptidase+N.">Structural basis for multifunctional roles of mammalian aminopeptidase N.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States Of America. 109 (44), 17966-17971 (2012).</li><li>Mina-Osorio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+moonlighting+enzyme+CD13:+old+and+new+functions+to+target.">The moonlighting enzyme CD13: old and new functions to target.</a> Trends in Molecular Medicine. 14 (8), 361-371 (2008).</li><li>Lu, C., Amin, M. A., Fox, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD13/Aminopeptidase+N+is+a+potential+therapeutic+target+for+inflammatory+disorders.">CD13/Aminopeptidase N is a potential therapeutic target for inflammatory disorders.</a> The Journal of Immunology. 204 (1), 3-11 (2020).</li><li>Villase&#241;or-Cardoso, M. I., Frausto-Del-R&#237;o, D. A., Ortega, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminopeptidase+N+(CD13)+is+involved+in+phagocytic+processes+in+human+dendritic+cells+and+macrophages.">Aminopeptidase N (CD13) is involved in phagocytic processes in human dendritic cells and macrophages.</a> BioMed Research International. 2013, 562984 (2013).</li><li>Melkebeek, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+aminopeptidase+N,+a+newly+identified+receptor+for+F4ac+fimbriae,+enhances+the+intestinal+mucosal+immune+response.">Targeting aminopeptidase N, a newly identified receptor for F4ac fimbriae, enhances the intestinal mucosal immune response.</a> Mucosal Immunology. 5 (6), 635-645 (2012).</li><li>Morgan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+aminopeptidase+N/CD13+produced+by+fibroblast-like+synoviocytes+in+rheumatoid+arthritis:+role+of+CD13+in+chemotaxis+of+cytokine-activated+T+cells+independent+of+enzymatic+activity.">Expression and function of aminopeptidase N/CD13 produced by fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis: role of CD13 in chemotaxis of cytokine-activated T cells independent of enzymatic activity.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 67 (1), 74-85 (2015).</li><li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+and+arthritogenic+properties+of+the+soluble+form+of+CD13.">Angiogenic and arthritogenic properties of the soluble form of CD13.</a> The Journal of Immunology. 203 (2), 360-369 (2019).</li><li>Rasschaert, K., Devriendt, B., Favoreel, H., Goddeeris, B. M., Cox, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin-mediated+endocytosis+and+transcytosis+of+enterotoxigenic+Escherichia+coli+F4+fimbriae+in+porcine+intestinal+epithelial+cells.">Clathrin-mediated endocytosis and transcytosis of enterotoxigenic Escherichia coli F4 fimbriae in porcine intestinal epithelial cells.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 137 (3-4), 243-250 (2010).</li><li>Reguera, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+bases+of+coronavirus+attachment+to+host+aminopeptidase+N+and+its+inhibition+by+neutralizing+antibodies.">Structural bases of coronavirus attachment to host aminopeptidase N and its inhibition by neutralizing antibodies.</a> PLoS Pathogens. 8 (8), 100859 (2012).</li><li>Delmas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminopeptidase+N+is+a+major+receptor+for+the+entero-pathogenic+coronavirus+TGEV.">Aminopeptidase N is a major receptor for the entero-pathogenic coronavirus TGEV.</a> Nature. 357 (6377), (1992).</li><li>Xia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+aminopeptidase+N+binds+to+F4++enterotoxigenic+Escherichia+coli+fimbriae.">Porcine aminopeptidase N binds to F4+ enterotoxigenic Escherichia coli fimbriae.</a> Veterinary Research. 47 (1), 24 (2016).</li><li>Nakamura, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies:+methods+and+clinical+laboratory+applications.">Monoclonal antibodies: methods and clinical laboratory applications.</a> Clinical Physiology and Biochemistry. 1 (2-5), 160-172 (1983).</li><li>Chan, C. E., Chan, A. H., Lim, A. P., Hanson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+efficiency+of+antibody+selection+from+semi-synthetic+scFv+and+non-immune+Fab+phage+display+libraries+against+protein+targets+for+rapid+development+of+diagnostic+immunoassays.">Comparison of the efficiency of antibody selection from semi-synthetic scFv and non-immune Fab phage display libraries against protein targets for rapid development of diagnostic immunoassays.</a> Journal of Immunological Methods. 373 (1-2), 79-88 (2011).</li><li>K&#246;hler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).</li><li>El Miedany, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MABS:+targeted+therapy+tailored+to+the+patient's+need.">MABS: targeted therapy tailored to the patient's need.</a> British Journal of Nursing. 24 (16), 4-13 (2015).</li><li>Castelli, M. S., McGonigle, P., Hornby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharmacology+and+therapeutic+applications+of+monoclonal+antibodies.">The pharmacology and therapeutic applications of monoclonal antibodies.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 7 (6), 00535 (2019).</li><li>Weiner, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+better+monoclonal+antibody-based+therapeutics.">Building better monoclonal antibody-based therapeutics.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).</li><li>Bakshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+single-domain+antibodies+as+carriers+for+targeted+vaccine+delivery+to+the+small+intestinal+epithelium.">Evaluating single-domain antibodies as carriers for targeted vaccine delivery to the small intestinal epithelium.</a> Journal of Controlled Release. 321, 416-429 (2020).</li><li>Kohler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> The Journal of Immunology. 174 (5), 2453-2455 (2005).</li><li>Chen, W., Liu, W. E., Li, Y. M., Luo, S., Zhong, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+preliminary+application+of+monoclonal+antibodies+to+the+receptor+binding+region+of+Clostridium+difficile+toxin+B.">Preparation and preliminary application of monoclonal antibodies to the receptor binding region of Clostridium difficile toxin B.</a> Molecular Medicine Reports. 12 (5), 7712-7720 (2015).</li><li>Levieux, D., Venien, A., Levieux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitopic+analysis+and+quantification+of+bovine+myoglobin+with+monoclonal+antibodies.">Epitopic analysis and quantification of bovine myoglobin with monoclonal antibodies.</a> Hybridoma. 14 (5), 435-442 (1995).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellin+and+F4+fimbriae+have+opposite+effects+on+biofilm+formation+and+quorum+sensing+in+F4ac++enterotoxigenic+Escherichia+coli.">Flagellin and F4 fimbriae have opposite effects on biofilm formation and quorum sensing in F4ac+ enterotoxigenic Escherichia coli.</a> Veterinary Microbiology. 168 (1), 148-153 (2014).</li><li>Heinrich, L., Tissot, N., Hartmann, D. J., Cohen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+results+obtained+by+ELISA+and+surface+plasmon+resonance+for+the+determination+of+antibody+affinity.">Comparison of the results obtained by ELISA and surface plasmon resonance for the determination of antibody affinity.</a> Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 13-22 (2010).</li><li>Vander Weken, H., Cox, E., Devriendt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+oral+subunit+vaccine+design.">Advances in oral subunit vaccine design.</a> Vaccines. 9, 1 (2020).</li><li>Baert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-glucan+microparticles+targeted+to+epithelial+APN+as+oral+antigen+delivery+system.">&#946;-glucan microparticles targeted to epithelial APN as oral antigen delivery system.</a> Journal of Controlled Release. 220, 149-159 (2015).</li><li>Neuberger, M. S., Williams, G. T., Fox, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+antibodies+possessing+novel+effector+functions.">Recombinant antibodies possessing novel effector functions.</a> Nature. 312 (5995), 604-608 (1984).</li></ol>

म्यूकोसल प्रतिरक्षा का प्रेरण रोगजनकों का मुकाबला करने और विभिन्न बीमारियों की रोकथाम और उपचार में सबसे प्रभावी तरीकों में से एक है। एपीएन, आंतों के श्लेष्म में एक अत्यधिक व्यक्त झिल्ली-बाध्य प्रोटी...

एमिनोपेप्टिडेस एन (एपीएन), एक चांदनी एंजाइम जो मेटालोप्रोटीनेज एम 1 परिवार से संबंधित है, एंजाइम-निर्भर और एंजाइम-स्वतंत्रमार्गों 1,2 के माध्यम से ट्यूमर मार्कर, रिसेप्टर और सिग्नलिंग अणु के रूप में कार्य करता है। अपनी जैविक गतिविधि के नियमन के लिए विभिन्न बायोएक्टिव पेप्टाइड्स के एन-टर्मिनल एमिनो-एसिड अवशेषों को छोड़ने के अलावा, एपीएन विभिन्न भड़काऊ रोगों के रोगजनन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एपीएन एंटीजन प्रसंस्करण और छंटनी पेप्टाइड्स द्वारा प्रस्तुति में भाग लेता है जो प्रमुख हिस्टोकम्पैटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स क्लास II अणुओं 2,3 से कसकर बंधते हैं। एपीएन कई सिग्नल ट्रांसडक्शन में भाग लेने वाले जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स के साथ बंधकर, साइटोकिन स्राव को संशोधित करके और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 4,5,6,7 में एफसी गामा रिसेप्टर-मध्यस्थता फागोसाइटोसिस में योगदान करके विरोधी भड़काऊ प्रभाव भी डालता है।
व्यापक रूप से वितरित झिल्ली-बाध्य एक्सोपेप्टिडेस के रूप में, एपीएन पोर्सिन छोटे आंतों के श्लेष्म में प्रचुर मात्रा में है और रिसेप्टर-मध्यस्थता एंडोसाइटोसिस 1,5,8 के साथ निकटता से जुड़ा हुआ है। एपीएन कोशिका प्रवेश के लिए पारगम्य गैस्ट्रोएंटेराइटिस वायरस के स्पाइक प्रोटीन को पहचानता है और बांधता है, और मेजबान कोशिकाओं9,10,11 के साथ बैक्टीरिया के पालन को प्रभावित करने के लिए सीधे एंटरोटॉक्सिजेनिक एस्चेरिचिया कोलाई एफ 4 फिम्ब्रिया के एफएईजी सबयूनिट के साथ बातचीत करता है। इस प्रकार, एपीएन वायरल और जीवाणु संक्रामक रोगों के उपचार में एक संभावित चिकित्सीय लक्ष्य है।
1975 में मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) उत्पादन के लिए हाइब्रिडोमा प्रौद्योगिकी और अन्य रणनीतियों के विकास के बाद से, एमएबी का व्यापक रूप से इम्यूनोथेरेपी, दवा वितरण और निदान12,13,14 में उपयोग किया गया है। वर्तमान में, एमएबी का उपयोग सफलतापूर्वक बीमारियों, जैसे कैंसर, सूजन आंत्र रोग और मल्टीपल स्केलेरोसिस12,15 के इलाज के लिए किया जाता है। उनकी मजबूत आत्मीयता और विशिष्टता के कारण, एमएबी एंटीबॉडी-ड्रग कंजुगेट (एडीसी) या नए टीकोंके विकास में आदर्श लक्ष्य हो सकते हैं। एपीएन प्रोटीन विशिष्ट कोशिकाओं को चुनिंदा एंटीजन देने के लिए महत्वपूर्ण है, और कम प्रोटीन अभिव्यक्ति, एंजाइम निष्क्रियता, या संरचनात्मक परिवर्तन 5,8,18 सहित किसी भी हस्तक्षेप के बिना रोगजनकों के खिलाफ एक विशिष्ट और मजबूत म्यूकोसल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्राप्त कर सकता है। इसलिए, एपीएन-विशिष्ट एमएबी पर आधारित चिकित्सीय उत्पाद बैक्टीरिया और वायरल संक्रमण के खिलाफ वादा दिखाते हैं। इस अध्ययन में, हम हाइब्रिडोमा तकनीक का उपयोग करके एपीएन-विशिष्ट एमएबी के उत्पादन का वर्णन करते हैं, और प्रोकैरियोटिक और यूकेरियोटिक वैक्टर का उपयोग करके एंटी-एपीएन पुनः संयोजक एंटीबॉडी (आरएबी) की अभिव्यक्ति करते हैं। परिणाम इंगित करता है कि एपीएन प्रोटीन को पीआईआरईएस 2-जेडएसग्रीन 1-आरएबीएस-एपीएन-सीएचओ कोशिकाओं और हाइब्रिडोमा-व्युत्पन्न एमएबीएस में व्यक्त दोनों आरएबी द्वारा पहचाना गया था।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Complete Freund&#8217;s adjuvant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5881</td>
			<td>Animal immunization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>C1002</td>
			<td>Nuclear counterstain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody</td>
			<td>Abbkine</td>
			<td>A23310</td>
			<td>Indirect immunofluorescence analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced Cell Counting Kit-8</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>C0042</td>
			<td>Measurement&#160;of&#160;cell&#160;viability and vitality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10091</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneticin&#8482; Selective Antibiotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11811098</td>
			<td>Selective antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAT Supplement (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21060017</td>
			<td>Cell selection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11067030</td>
			<td>Cell selection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incomplete Freund&#8217;s adjuvant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5506</td>
			<td>Animal immunization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl &#946;-d-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5502</td>
			<td>Protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>ST102</td>
			<td>Bactericidal antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 STED confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>&#160;SP8 STED</td>
			<td>Fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine&#174; 2000 Reagent</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa&#8482; fluorescence-activated cell sorting</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACS LSRFortessa</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BOX 998</td>
			<td>ELISA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Nano Drop one</td>
			<td>Nucleic acid concentration detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019308</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10002917</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985088</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 1500</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10783641001</td>
			<td>Cell fusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript&#8482; 1st strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>RR047</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein A agarose</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>P2006</td>
			<td>Antibody protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protino&#174; Ni+-TED 2000 Packed Columns</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>745120.5</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SBA Clonotyping System-HRP</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>May-00</td>
			<td>Isotyping of mouse monoclonal antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seamless Cloning Kit</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>D7010S</td>
			<td>Construction of plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shake flasks</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>E3285</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>C0221A</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>&#160;170-3940</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Homogenizer</td>
			<td>Ningbo Xinzhi Biotechnology</td>
			<td>JY92-IIN</td>
			<td>Sample homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of monoclonal antibodies targeting aminopeptidase n in the porcine intestinal mucosal epithelium

पोर्सिन एमिनोपेप्टिडेस एन (एपीएन), एक झिल्ली-बाध्य मेटालोपेप्टिडेस जो छोटे आंतों के श्लेष्म में प्रचुर मात्रा में मौजूद है, कम प्रोटीन अभिव्यक्ति, एंजाइम निष्क्रियता या संरचनात्मक परिवर्तनों जैसे किसी भी हस्तक्षेप के बिना एक म्यूकोसल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया शुरू कर सकता है। यह एपीएन को टीकों के विकास में एक आकर्षक उम्मीदवार बनाता है जो म्यूकोसल एपिथेलियम को चुनिंदा रूप से लक्षित करते हैं। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि एपीएन एंटरोटॉक्सिजेनिक एस्चेरिचिया कोलाई (ई कोलाई) एफ 4 और पारगम्य गैस्ट्रोएंटेराइटिस वायरस दोनों के लिए एक रिसेप्टर प्रोटीन है। इस प्रकार, एपीएन एपीएन-विशिष्ट एंटीबॉडी के आधार पर एंटीबॉडी-ड्रग संयुग्म या नए टीकों के विकास में वादा दिखाता है। इस अध्ययन में, हमने पारंपरिक हाइब्रिडोमा तकनीक और पुनः संयोजक एंटीबॉडी अभिव्यक्ति विधि का उपयोग करके एपीएन-विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (एमएबी) के उत्पादन की तुलना की। हमने पीआईआरईएस 2-जेडएसग्रीन 1-आरएबीएस-एपीएन और एक ई कोलाई अभिव्यक्ति बीएल 21 (डीई 3) तनाव का उपयोग करके एक स्थिर रूप से स्थानांतरित चीनी हैम्स्टर अंडाशय (सीएचओ) सेल लाइन भी स्थापित की, जो पीईटी 28 ए (+)-आरएबीएस-एपीएन वेक्टर को परेशान करती है। परिणाम बताते हैं कि हाइब्रिडोमा का उपयोग करके उत्पादित पीआईआरईएस 2-जेडएसग्रीन 1-आरएबीएस-एपीएन-सीएचओ कोशिकाओं और एमएबी में व्यक्त एंटीबॉडी एपीएन प्रोटीन को पहचान और बांध सकते हैं। यह विभिन्न एपीएन-विशिष्ट एपिटोप्स को लक्षित करने वाले चिकित्सीय विकास के लिए एपीएन रिसेप्टर फ़ंक्शन के आगे स्पष्टीकरण के लिए आधार प्रदान करता है।

इस अध्ययन में, माउस टीकाकरण के लिए शुद्ध घुलनशील एपीएन प्रोटीन (2.12 मिलीग्राम / एमएल) का उपयोग किया गया था। 14-दिन के अंतराल पर चार बार एपीएन प्रोटीन के साथ प्रतिरक्षित चूहों ने अपने सेरा में एपीएन के खिलाफ ?...

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Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium

पारंपरिक हाइब्रिडोमा तकनीक का उपयोग करके उत्पादित पीआईआरईएस 2-जेडएसग्रीन 1-आरएबीएस-एपीएन-सीएचओ कोशिकाओं और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी में व्यक्त पुनः संयोजक एंटीबॉडी पोर्सिन एमिनोपेप्टिडेस एन (एपीएन) प्रोटीन को पहचान और बांध सकते हैं।

पोर्सिन आंतों के म्यूकोसल एपिथेलियम में एमिनोपेप्टिडेस एन को लक्षित करने वाले मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उत्पादन

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response ...

व्युत्पन्न मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग मुख्य रूप से नैदानिक चिकित्सीय प्रतिरक्षा अभिकर्मकों में किया जाता है जो तैयार सीमित उत्पादन में स्थिर और विश्वसनीय एंटीबॉडी का उत्पादन करने की आवश्यकता पर प्रकाश डालता है। यहां वर्णित तरीकों ने साबित किया कि पुनः संयोजक एंटीबॉडी उत्पादन मोनोक्लोनल एंटीबॉडी उत्पादन दक्षता बढ़ा सकता है और श्रम और समय से संबंधित लागत को कम कर सकता है। विधियों का उपयोग एमिनोपेप्टिडेज़ और एंटीबॉडी-आधारित एंटीबॉडी दवा संयुग्म और अन्य चिकित्सीय उत्पादों को विकसित करने के लिए किया जाता है, जो बैक्टीरिया और वायरल संक्रमण की रोकथाम और उपचार में एपीएन की भूमिका को स्पष्ट करने में सहायता करता है।प्रक्रिया का प्रदर्शन यान ली, मेरी प्रयोगशाला से एक स्नातकोत्तर छात्र होगा। शुरू करने के लिए, इंट्रापरिटोनियल रूप से अंतिम एंटीजन बूस्ट के लिए चयनित वयस्क महिला चूहों में एपीएन प्रोटीन के 100 माइक्रोग्राम इंजेक्ट करें। इंजेक्शन के तीन दिनों के बाद, चूहों से तिल्ली एकत्र करें और रक्त और वसा कोशिकाओं को हटाने के लिए डीएमईएम से दो बार धोएं।तिल्ली झिल्ली को हटाने के लिए सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके ऊतक मलबे को हटाने और प्लीहा कोशिकाओं की कटाई के लिए 200 जाल तांबा ग्रिड का उपयोग करके प्लीहा सेल निलंबन को फ़िल्टर करें। माउस एसपी 20 मायलोमा कोशिकाओं को 25 वर्ग सेंटीमीटर फ्लास्क में बीज दें जिसमें पांच मिलीलीटर डीएमईएम होता है जो 6% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक होता है और सेल व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 6% कार्बन डाइऑक्साइड वातावरण में कल्चर करता है। संस्कृति के पांच से छह दिनों के बाद, कोशिकाओं को पुनर्जीवन के बाद 80 से 90% संगम तक पहुंचना चाहिए और माइक्रोस्कोप के नीचे गोल, उज्ज्वल और स्पष्ट दिखाई देना चाहिए।संकरण से एक दिन पहले, चूहों के पेरिटोनियल गुहाओं से मैक्रोफेज एकत्र करें। 96-वेल प्लेटों में 0.1 से 0.2 गुना 10 से पांचवें प्रति मिलीलीटर के घनत्व पर बीज पेरिटोनियल मैक्रोफेज, प्रत्येक में एचएटी माध्यम के 100 माइक्रोलीटर होते हैं और उन्हें रात भर इनक्यूबेट करते हैं। संकरण के लिए, धीरे से एसपी 20 कोशिकाओं को 8 से 10 बोतलों से पिपेट के साथ एस्पिरेट करें और उन्हें सीरम मुक्त डीएमईएम माध्यम के 10 मिलीलीटर में निलंबित करें।ताजा डीएमईएम के साथ कोशिकाओं को धोएं और उन्हें दो बार सेंट्रीफ्यूज करें, फिर उन्हें डीएमईएम के 10 मिलीलीटर में फिर से निलंबित करें। 10: 1 के अनुपात में एसबी 20 कोशिकाओं के साथ मात्रात्मक प्लीहा कोशिकाओं को मिलाएं और उन्हें 50 मिलीलीटर ट्यूबों में स्थानांतरित करें। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें और ट्यूबों के तल पर छर्रों को इकट्ठा करें।संकरण से पहले छर्रों को ढीला करने के लिए ट्यूब को टैप करें। एक ड्रॉपर का उपयोग करते हुए, ट्यूब के तल को धीरे से घुमाते हुए 45 सेकंड में ढीले सेल पेलेट में एक मिलीलीटर पॉलीथीन ग्लाइकोल 1500 को 37 डिग्री सेल्सियस ड्रॉपवाइज में मिलाएं। फिर धीरे-धीरे 90 सेकंड के लिए मिश्रण में 37 डिग्री सेल्सियस तक एक मिलीलीटर डीएमईएम जोड़ें, इसके बाद एक और 30 मिलीलीटर ताजा डीएमईएम डालें और फ्यूजन ट्यूब को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें।इनक्यूबेशन के बाद, कोशिकाओं की कटाई करें। पेरिटोनियल मैक्रोफेज के साथ टीका लगाए गए 96-वेल प्लेट में एचएटी माध्यम और संस्कृति को फिर से निलंबित करें। पांच दिनों के बाद, प्रत्येक कुएं में 100 माइक्रोलीटर ताजा एचएटी माध्यम जोड़ें।और फिर पांच दिनों के इनक्यूबेशन के बाद, माध्यम को एचएटी माध्यम से बदलें। एलिसा परख का उपयोग करके हाइब्रिडोमास सुपरनैटेंट में मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का विश्लेषण करने के लिए 0.05 मोलर पीबीएस में पतला पांच माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर एपीएन प्रोटीन के साथ लेपित माइक्रोटिटर प्लेट का उपयोग करें। पीईटी 28 ए प्लस पुनः संयोजक एंटीबॉडी एमिनोपेप्टिडेस एनबीएल 21 ने 10 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ऑर्बिटल शेकर में 0.4 मिलीमोलर बीटा-डी-1-थियोगैलेक्टोपायरानोसाइड की उपस्थिति में बैक्टीरिया को बदल दिया।बीज 100 माइक्रोलीटर 0.5 गुना 10 से पांचवें चीनी हैम्स्टर अंडाशय कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के लिए 96-वेल प्लेट में और 18 से 24 घंटे के लिए 6% कार्बन डाइऑक्साइड वातावरण में अच्छी तरह से रखें। जब कोशिकाएं 80 से 90% संगम तक पहुंच जाती हैं, तो पीआईआरईएस 2-जेडएस ग्रीन, एक पुनः संयोजक एंटीबॉडी एमिनोपेप्टिडेस और प्लास्मिड को ऑप्टी-एमईएम के साथ 0.1 माइक्रोग्राम प्रति माइक्रोलीटर की अंतिम एकाग्रता तक पतला करें। पांच मिनट के बाद, 50 माइक्रोलीटर पतला पीआईआरईएस 2-जेडएस ग्रीन, एक पुनः संयोजक एंटीबॉडी एमिनोपेप्टिडेस और प्लास्मिड को लिपोफेक्टामाइन 2000 के एक माइक्रोलीटर और ऑप्टी-एमईएम के 49 माइक्रोलीटर के साथ मिलाएं।20 मिनट की इनक्यूबेशन के बाद, सीएचओ कोशिकाओं वाले 96-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में मिश्रण के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। अभिकर्मक के चार से छह घंटे बाद, माध्यम को डीएमईएम एफ 12 के साथ 10% एफबीएस के साथ पूरक करें। 48 घंटे के इनक्यूबेशन के बाद, स्थिर रूप से स्थानांतरित कोशिकाओं का चयन करने के लिए प्रत्येक कुएं में 400 माइक्रोग्राम प्रति माइक्रोलीटर जी 418 जोड़ें।डीएमईएम एफ 12 माध्यम का उपयोग करके चयन के 10 दिनों के बाद, 10% एफबीएस और 400 माइक्रोग्राम प्रति माइक्रोलीटर जी 418 के साथ पूरक, प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग के साथ कोशिकाओं को क्रमबद्ध करें। काटे गए सकारात्मक कोशिकाओं को क्रमिक रूप से पतला करें। उन्हें 96-वेल प्लेट में प्रति कुएं औसतन 0.5 से 2 कोशिकाओं पर बीज दें और 37 डिग्री सेल्सियस, 6% कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में कल्चर करें।प्रतिनिधि सूक्ष्म विश्लेषण में, सभी हाइब्रिडोमास कोशिकाएं गोल, उज्ज्वल और स्पष्ट दिखाई दीं। शुद्ध मोनोक्लोनल एंटीबॉडी जिसमें भारी 50 किलोडाल्टन और हल्के 25 किलोडाल्टन चेन होते हैं, की पुष्टि एसडीएस-पेज द्वारा की गई थी और शुद्ध जलोदर में पाए गए थे। कल्चर सुपरनैटेंट और जलोदर में इन एंटी-एपीएन मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के टिटर्स यहां दिखाए गए हैं।माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी आइसोटाइपिंग से पता चला कि क्लोन 5बी31, 5बी36, 3सी48, 5सी51 और 6सी56 से प्राप्त एंटीबॉडी में इम्युनोग्लोबुलिन जी2बी उपवर्ग थे, जबकि एपीएन 2ए20 एक इम्युनोग्लोबुलिन जी2ए कप्पा टाइप एंटीबॉडी और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी एपीएन 3एफडी 9, 3एफ10 और 10एफ3 इम्युनोग्लोबुलिन एम प्रकार और प्रोसेस्ड कप्पा लाइट चेन से संबंधित थे। इनमें से अधिकांश मोनोक्लोनल एंटीबॉडी ने 50% से अधिक के एवी मान दिखाए, जो दर्शाता है कि उन्होंने एपीएन में विभिन्न एपिटोप्स को लक्षित किया, जबकि एपीएन 5 सी 51 एंटीबॉडी ने एपीएन 3 सी 48, 5 बी 31 और 6 सी 56 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी द्वारा मान्यता प्राप्त एंटीजेनिक एपिटोप्स को मान्यता दी। प्रवर्धित एपीएन 5बी36 वीएचवीएल जीन को क्रमशः पुनः संयोजक अभिव्यक्ति प्लास्मिड पीईटी 28 ए पॉजिटिव आरएबीएस एपीएन और पीआईआरईएस 2-जेडएस ग्रीन वन आरएबीएस एपीएन का निर्माण करने के लिए पीईटी 28 ए पॉजिटिव या पीआईआरईएस 2-जेडएस ग्रीन वन आरएबीएस एपीएन में मिलाया गया था।पीईटी 28 ए प्लस पुनः संयोजक एंटीबॉडी एमिनोपेप्टिडेस एनबीएल 21 और पीआईआरईएस 2-जेडएस ग्रीन एक पुनः संयोजक एंटीबॉडी एमिनोपेप्टिडेस एनसीएचओ कोशिकाओं द्वारा व्यक्त एंटीबॉडी को एलिसा और आईएफए परख का उपयोग करके शुद्ध और विश्लेषण किया गया था। हालांकि, केवल पीआईआरईएस 2-जेडएस ग्रीन के सुपरनैटेंट में व्यक्त एंटीबॉडी एक पुनः संयोजक एंटीबॉडी एमिनोपेप्टिडेस एनसीएचओ कोशिकाएं एपीएन प्रोटीन को पहचानती हैं। एपीएन प्रोटीन के लिए एपीएन 5 बी 36 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का बंधन पुनः संयोजक एंटीबॉडी की तुलना में एक संतुलन तक पहुंच गया।प्रोटीन ए अगारोस का उपयोग करके सुपरनैटेंट में मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का शुद्धिकरण संतृप्त अमोनिया सल्फेट वर्षा का उपयोग करने से बेहतर है।

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के निष्क्रिय खिलाफ प्रशासन एच. capsulatum और फफूंद रोगज़नक़ों दूसरों

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

इन विट्रो रोगजनक प्रेरित न्यूट्रोफिल ट्रांस-एपिथेलियल माइग्रेशन का आकलन करने के लिए कोकल्चर परख

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Swimbladder इंजेक्शन द्वारा लार्वा zebrafish में mucosal कैंडिडिआसिस मॉडलिंग

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

अमर छाँटे बी कोशिकाओं से पुनः संयोजक मानव आईजीजी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का सृजन

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

जीन या ड्रग थेरेपी में उपयोग के लिए लक्ष्य निर्धारण एचआईवी -1 उत्पादन प्रभावकारिता और आरएनए की विषाक्तता का मूल्यांकन

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

हाइब्रिडोमा प्रौद्योगिकी द्वारा Murine मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की पीढ़ी

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Vivo में ऊपरी Airway प्रतिरक्षा-मध्यस्थ स्तर की मात्रा का ठहराव के लिए Mucosal अस्तर द्रव का noninvasive नमूना

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

बचने इंफ्लूएंजा वायरस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के भागने के वेरिएंट की पीढ़ी

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

दुर्लभ प्रतिजन-विशिष्ट बी कोशिकाओं से रक्त में परिचालित में भेदभावपूर्ण मानव मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की पीढ़ी

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

प्राकृतिक उत्पादों के खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उत्पादन

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...