Name: production of monoclonal antibodies targeting aminopeptidase n in the porcine intestinal mucosal epithelium
Uploaded: 2021-05-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium at JoVE.com

Questo studio è stato sostenuto dalla Chinese National Science Foundation Grant (n. 32072820, 31702242), dalle sovvenzioni della borsa di studio del governo di Jiangsu per gli studi all'estero (JS20190246) e High-level Talents of Yangzhou University Scientific Research Foundation, un progetto fondato dal Priority Academic Program of Development Jiangsu High Education Institution.

Tutti gli esperimenti sugli animali in questo studio sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Yangzhou (SYXK20200041).
1. Preparazione dell'antigene della proteina APN suina
NOTA: Il ceppo pET28a (+)-APN-BL21 (DE3) e le cellule APN stabilmente espresse pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 sono stati costruiti in uno studio precedente11.
<ol><li>Recuperare i batteri da uno stock di glicerolo conge...

<ol>
	<li>Chen, L., Lin, Y. L., Peng, G., Li, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+multifunctional+roles+of+mammalian+aminopeptidase+N.">Structural basis for multifunctional roles of mammalian aminopeptidase N.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States Of America. 109 (44), 17966-17971 (2012).</li><li>Mina-Osorio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+moonlighting+enzyme+CD13:+old+and+new+functions+to+target.">The moonlighting enzyme CD13: old and new functions to target.</a> Trends in Molecular Medicine. 14 (8), 361-371 (2008).</li><li>Lu, C., Amin, M. A., Fox, D. 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A., Ortega, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminopeptidase+N+(CD13)+is+involved+in+phagocytic+processes+in+human+dendritic+cells+and+macrophages.">Aminopeptidase N (CD13) is involved in phagocytic processes in human dendritic cells and macrophages.</a> BioMed Research International. 2013, 562984 (2013).</li><li>Melkebeek, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+aminopeptidase+N,+a+newly+identified+receptor+for+F4ac+fimbriae,+enhances+the+intestinal+mucosal+immune+response.">Targeting aminopeptidase N, a newly identified receptor for F4ac fimbriae, enhances the intestinal mucosal immune response.</a> Mucosal Immunology. 5 (6), 635-645 (2012).</li><li>Morgan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+aminopeptidase+N/CD13+produced+by+fibroblast-like+synoviocytes+in+rheumatoid+arthritis:+role+of+CD13+in+chemotaxis+of+cytokine-activated+T+cells+independent+of+enzymatic+activity.">Expression and function of aminopeptidase N/CD13 produced by fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis: role of CD13 in chemotaxis of cytokine-activated T cells independent of enzymatic activity.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 67 (1), 74-85 (2015).</li><li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+and+arthritogenic+properties+of+the+soluble+form+of+CD13.">Angiogenic and arthritogenic properties of the soluble form of CD13.</a> The Journal of Immunology. 203 (2), 360-369 (2019).</li><li>Rasschaert, K., Devriendt, B., Favoreel, H., Goddeeris, B. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies:+methods+and+clinical+laboratory+applications.">Monoclonal antibodies: methods and clinical laboratory applications.</a> Clinical Physiology and Biochemistry. 1 (2-5), 160-172 (1983).</li><li>Chan, C. E., Chan, A. H., Lim, A. P., Hanson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+efficiency+of+antibody+selection+from+semi-synthetic+scFv+and+non-immune+Fab+phage+display+libraries+against+protein+targets+for+rapid+development+of+diagnostic+immunoassays.">Comparison of the efficiency of antibody selection from semi-synthetic scFv and non-immune Fab phage display libraries against protein targets for rapid development of diagnostic immunoassays.</a> Journal of Immunological Methods. 373 (1-2), 79-88 (2011).</li><li>K&#246;hler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).</li><li>El Miedany, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MABS:+targeted+therapy+tailored+to+the+patient's+need.">MABS: targeted therapy tailored to the patient's need.</a> British Journal of Nursing. 24 (16), 4-13 (2015).</li><li>Castelli, M. S., McGonigle, P., Hornby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharmacology+and+therapeutic+applications+of+monoclonal+antibodies.">The pharmacology and therapeutic applications of monoclonal antibodies.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 7 (6), 00535 (2019).</li><li>Weiner, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+better+monoclonal+antibody-based+therapeutics.">Building better monoclonal antibody-based therapeutics.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).</li><li>Bakshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+single-domain+antibodies+as+carriers+for+targeted+vaccine+delivery+to+the+small+intestinal+epithelium.">Evaluating single-domain antibodies as carriers for targeted vaccine delivery to the small intestinal epithelium.</a> Journal of Controlled Release. 321, 416-429 (2020).</li><li>Kohler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> The Journal of Immunology. 174 (5), 2453-2455 (2005).</li><li>Chen, W., Liu, W. E., Li, Y. M., Luo, S., Zhong, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+preliminary+application+of+monoclonal+antibodies+to+the+receptor+binding+region+of+Clostridium+difficile+toxin+B.">Preparation and preliminary application of monoclonal antibodies to the receptor binding region of Clostridium difficile toxin B.</a> Molecular Medicine Reports. 12 (5), 7712-7720 (2015).</li><li>Levieux, D., Venien, A., Levieux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitopic+analysis+and+quantification+of+bovine+myoglobin+with+monoclonal+antibodies.">Epitopic analysis and quantification of bovine myoglobin with monoclonal antibodies.</a> Hybridoma. 14 (5), 435-442 (1995).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellin+and+F4+fimbriae+have+opposite+effects+on+biofilm+formation+and+quorum+sensing+in+F4ac++enterotoxigenic+Escherichia+coli.">Flagellin and F4 fimbriae have opposite effects on biofilm formation and quorum sensing in F4ac+ enterotoxigenic Escherichia coli.</a> Veterinary Microbiology. 168 (1), 148-153 (2014).</li><li>Heinrich, L., Tissot, N., Hartmann, D. J., Cohen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+results+obtained+by+ELISA+and+surface+plasmon+resonance+for+the+determination+of+antibody+affinity.">Comparison of the results obtained by ELISA and surface plasmon resonance for the determination of antibody affinity.</a> Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 13-22 (2010).</li><li>Vander Weken, H., Cox, E., Devriendt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+oral+subunit+vaccine+design.">Advances in oral subunit vaccine design.</a> Vaccines. 9, 1 (2020).</li><li>Baert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-glucan+microparticles+targeted+to+epithelial+APN+as+oral+antigen+delivery+system.">&#946;-glucan microparticles targeted to epithelial APN as oral antigen delivery system.</a> Journal of Controlled Release. 220, 149-159 (2015).</li><li>Neuberger, M. S., Williams, G. T., Fox, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+antibodies+possessing+novel+effector+functions.">Recombinant antibodies possessing novel effector functions.</a> Nature. 312 (5995), 604-608 (1984).</li></ol>

L'induzione dell'immunità mucosale è uno degli approcci più efficaci nel contrastare gli agenti patogeni e nella prevenzione e nel trattamento di varie malattie. L'APN, una proteina legata alla membrana altamente espressa nella mucosa intestinale, è coinvolta nell'induzione della risposta immunitaria adattativa e nell'endocitosi virale e batterica mediata dai recettori 1,5,8. APN è usato come antigene particolato in molti f...

L'aminopeptidasi N (APN), un enzima che appartiene alla famiglia delle metalloproteinasi M1, agisce come marcatore tumorale, recettore e molecola di segnalazione attraverso vie enzima-dipendenti ed enzima-indipendenti 1,2. Oltre a scindere i residui aminoacidici N-terminali di vari peptidi bioattivi per la regolazione della loro attività biologica, l'APN svolge un ruolo importante nella patogenesi di varie malattie infiammatorie. APN partecipa all'elaborazione e alla presentazione dell'antigene da parte di peptidi tagliati che si legano strettamente alle principali molecole di classe II del complesso di istocompatibilità 2,3. APN esercita anche effetti antinfiammatori legandosi con i recettori accoppiati a proteine G che partecipano alla trasduzione del segnale multiplo, modulando la secrezione di citochine e contribuendo alla fagocitosi mediata dal recettore Fc gamma nella risposta immunitaria 4,5,6,7.
Come esopeptidasi legata alla membrana ampiamente distribuita, l'APN è abbondante nella mucosa dell'intestino tenue suino ed è strettamente associata all'endocitosi mediata dal recettore 1,5,8. APN riconosce e lega la proteina spike del virus della gastroenterite trasmissibile per l'ingresso cellulare e interagisce direttamente con la subunità FaeG delle fimbrie enterotossigeniche di Escherichia coli F4 per influenzare l'aderenza batterica con le cellule ospiti 9,10,11. Pertanto, APN è un potenziale bersaglio terapeutico nel trattamento delle malattie infettive virali e batteriche.
Dopo lo sviluppo della tecnologia dell'ibridoma e di altre strategie per la produzione di anticorpi monoclonali (mAbs) nel 1975, i mAb sono stati ampiamente utilizzati nell'immunoterapia, nella somministrazione di farmaci e nella diagnosi12,13,14. Attualmente, i mAbs sono usati con successo per trattare malattie come il cancro, le malattie infiammatorie intestinali e la sclerosi multipla12,15. A causa della loro forte affinità e specificità, i mAb possono essere bersagli ideali nello sviluppo di coniugati anticorpo-farmaco (ADC) o di nuovi vaccini16,17. La proteina APN è fondamentale per la somministrazione selettiva di antigeni a cellule specifiche e può suscitare una risposta immunitaria mucosa specifica e forte contro i patogeni senza alcuna interferenza, tra cui bassa espressione proteica, inattività enzimatica o cambiamenti strutturali 5,8,18. Pertanto, gli agenti terapeutici a base di mAbs specifici per APN mostrano risultati promettenti contro le infezioni batteriche e virali. In questo studio, descriviamo la produzione di mAbs APN-specifici utilizzando la tecnologia dell'ibridoma e l'espressione di anticorpi ricombinanti anti-APN (rAbs) utilizzando vettori procariotici ed eucariotici. Il risultato indica che la proteina APN è stata riconosciuta sia dagli rAbs espressi nelle cellule pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO che dai mAb derivati dall'ibridoma.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Complete Freund&#8217;s adjuvant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5881</td>
			<td>Animal immunization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>C1002</td>
			<td>Nuclear counterstain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody</td>
			<td>Abbkine</td>
			<td>A23310</td>
			<td>Indirect immunofluorescence analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced Cell Counting Kit-8</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>C0042</td>
			<td>Measurement&#160;of&#160;cell&#160;viability and vitality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10091</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneticin&#8482; Selective Antibiotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11811098</td>
			<td>Selective antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAT Supplement (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21060017</td>
			<td>Cell selection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11067030</td>
			<td>Cell selection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incomplete Freund&#8217;s adjuvant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5506</td>
			<td>Animal immunization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl &#946;-d-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5502</td>
			<td>Protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>ST102</td>
			<td>Bactericidal antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 STED confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>&#160;SP8 STED</td>
			<td>Fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine&#174; 2000 Reagent</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa&#8482; fluorescence-activated cell sorting</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACS LSRFortessa</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BOX 998</td>
			<td>ELISA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Nano Drop one</td>
			<td>Nucleic acid concentration detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019308</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10002917</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985088</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 1500</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10783641001</td>
			<td>Cell fusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript&#8482; 1st strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>RR047</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein A agarose</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>P2006</td>
			<td>Antibody protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protino&#174; Ni+-TED 2000 Packed Columns</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>745120.5</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SBA Clonotyping System-HRP</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>May-00</td>
			<td>Isotyping of mouse monoclonal antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seamless Cloning Kit</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>D7010S</td>
			<td>Construction of plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shake flasks</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>E3285</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>C0221A</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>&#160;170-3940</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Homogenizer</td>
			<td>Ningbo Xinzhi Biotechnology</td>
			<td>JY92-IIN</td>
			<td>Sample homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of monoclonal antibodies targeting aminopeptidase n in the porcine intestinal mucosal epithelium

L'aminopeptidasi suina N (APN), una metallopeptidasi legata alla membrana abbondantemente presente nella mucosa dell'intestino tenue, può avviare una risposta immunitaria della mucosa senza alcuna interferenza come bassa espressione proteica, inattività enzimatica o cambiamenti strutturali. Ciò rende APN un candidato interessante nello sviluppo di vaccini che colpiscono selettivamente l'epitelio della mucosa. Studi precedenti hanno dimostrato che l'APN è una proteina recettore sia per l'Escherichia coli enterotossigenico (E. coli) F4 che per il virus della gastroenterite trasmissibile. Pertanto, APN mostra risultati promettenti nello sviluppo di coniugati anticorpo-farmaco o nuovi vaccini basati su anticorpi APN-specifici. In questo studio, abbiamo confrontato la produzione di anticorpi monoclonali APN-specifici (mAbs) utilizzando la tecnologia tradizionale dell'ibridoma e il metodo di espressione degli anticorpi ricombinanti. Abbiamo anche stabilito una linea cellulare di ovaio di criceto cinese (CHO) stabilmente trasfettata utilizzando pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN e un ceppo di espressione BL21 (DE3) di E. coli che ospita il vettore pET28a (+)-rAbs-APN. I risultati mostrano che gli anticorpi espressi nelle cellule pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO e mAbs prodotti utilizzando ibridomi potrebbero riconoscere e legarsi alla proteina APN. Ciò fornisce la base per ulteriori chiarimenti sulla funzione del recettore APN per lo sviluppo di terapie mirate a diversi epitopi specifici dell'APN.

In questo studio, la proteina APN solubile purificata (2,12 mg / ml) è stata utilizzata per l'immunizzazione del topo. I topi immunizzati con la proteina APN quattro volte a intervalli di 14 giorni hanno mostrato un titolo anticorpale più elevato contro APN nei loro sieri. Sebbene siano stati ottenuti 14 ibridomi utilizzando gli esperimenti di fusione, solo 9 ibridomi sono sopravvissuti ai tre cicli continui di congelamento-disgelo, risultando in 9 cloni stabili che hanno secreto anticorpi contro APN. Tutte queste cell...

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Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium

La proteina anticorpale ricombinante espressa nelle cellule pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO e negli anticorpi monoclonali prodotti utilizzando la tecnologia tradizionale dell'ibridoma possono riconoscere e legarsi alla proteina N dell'aminopeptidasi suina (APN).

Produzione di anticorpi monoclonali contro l'aminopeptidasi N nell'epitelio della mucosa intestinale suina

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response ...

Gli anticorpi monoclonali derivati sono utilizzati principalmente nei reagenti immunitari terapeutici diagnostici, evidenziando la necessità di produrre anticorpi stabili e affidabili in produzione limitata preparata. I metodi qui descritti hanno dimostrato che la produzione di anticorpi ricombinanti potrebbe aumentare l'efficienza della produzione di anticorpi monoclonali e ridurre al minimo i costi associati al lavoro e al tempo. I metodi sono utilizzati per sviluppare coniugati di farmaci anticorpali a base di aminopeptidasi e anticorpi e altri prodotti terapeutici, che aiutano a chiarire il ruolo dell'APN nella prevenzione e nel trattamento delle infezioni batteriche e virali.A dimostrare la procedura sarà Yan Li, uno studente post-laurea del mio laboratorio. Per iniziare, iniettare per via intraperitoneale 100 microgrammi di proteina APN nei topi femmina adulti selezionati per un aumento finale dell'antigene. Dopo tre giorni di iniezione, raccogliere la milza dai topi e lavare con DMEM due volte per rimuovere il sangue e le cellule adipose.Filtrare la sospensione delle cellule della milza utilizzando una griglia di rame a 200 maglie per rimuovere i detriti tissutali e raccogliere le cellule della milza utilizzando la centrifugazione per rimuovere la membrana della milza. Seminare le cellule di mieloma SP20 del topo in un pallone di 25 centimetri quadrati contenente cinque millilitri di DMEM integrato con il 6% di siero bovino fetale e coltura delle cellule a 37 gradi Celsius e 6% di anidride carbonica in atmosfera per mantenere la vitalità cellulare. Dopo cinque-sei giorni di coltura, le cellule dovrebbero raggiungere l'80-90% di confluenza dopo la rianimazione e apparire rotonde, luminose e chiare al microscopio.Un giorno prima dell'ibridazione, raccogliere i macrofagi dalle cavità peritoneali dei topi. Seminare macrofagi peritoneali ad una densità da 0,1 a 0,2 volte 10 al quinto per millilitro in piastre da 96 pozzetti, ciascuna contenente 100 microlitri di mezzo HAT e incubarli durante la notte. Per l'ibridazione, aspirare delicatamente le cellule SP20 con una pipetta da 8 a 10 flaconi e sospenderle in 10 millilitri di mezzo DMEM senza siero.Lavare le cellule con DMEM fresco e centrifugarle due volte, quindi risospenderle in 10 millilitri di DMEM. Mescolare le cellule quantificate della milza con cellule SB20 in un rapporto di 10: 1 e trasferirle in tubi da 50 millilitri. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e raccogliere il pellet sul fondo dei tubi.Picchiettare il tubo per allentare il pellet prima dell'ibridazione. Utilizzando un contagocce, aggiungere un millilitro di polietilenglicole 1500 preriscaldato a 37 gradi Celsius goccia nel senso della goccia al pellet cellulare allentato per 45 secondi mentre si ruota delicatamente il fondo del tubo. Quindi aggiungere lentamente un millilitro di DMEM preriscaldato a 37 gradi Celsius alla miscela per 90 secondi, seguito da altri 30 millilitri di DMEM fresco e posizionare il tubo di fusione in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 30 minuti.Dopo l'incubazione, raccogliere le cellule. Risospendere il mezzo HAT e la coltura in una piastra a 96 pozzetti inoculata con macrofagi peritoneali. Dopo cinque giorni, aggiungere 100 microlitri di HAT fresco mezzo a ciascun pozzetto.E di nuovo dopo cinque giorni di incubazione, sostituire il mezzo con HAT medium. Utilizzare una piastra di microtitolazione rivestita con cinque microgrammi per millilitro di proteina APN diluita in PBS molare 0,05 per analizzare gli anticorpi monoclonali nell'ibridoma surnatante utilizzando il test ELISA. Coltivare i batteri trasformati dagli anticorpi ricombinanti pET28a più aminopeptidasi NBL21 in presenza di 0,4 millimolari beta-d-1-tiogalattopiranoside in uno shaker orbitale a 37 gradi Celsius per 10 ore.Seminare 100 microlitri 0,5 volte 10 al quinto criceto cinese cellule ovariche per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti per l'incubazione a 37 gradi Celsius e un'atmosfera di anidride carbonica del 6% per 18-24 ore. Quando le cellule raggiungono l'80-90% di confluenza, diluire gli anticorpi ricombinanti pIRES2-zs Green uno aminopeptidasi e plasmide con Opti-MEM ad una concentrazione finale di 0,1 microgrammi per microlitro. Dopo cinque minuti, mescolare i 50 microlitri di pIRES2-zs Green diluito uno anticorpi ricombinanti aminopeptidasi e plasmide con un microlitro di Lipofectamine 2000 e 49 microlitri di Opti-MEM.Dopo 20 minuti di incubazione, aggiungere 100 microlitri della miscela a ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti contenente cellule CHO. Da quattro a sei ore dopo la trasfezione, sostituire il mezzo con DMEM F12 integrato con 10% FBS. Dopo 48 ore di incubazione, aggiungere 400 microgrammi per microlitro G418 a ciascun pozzetto per selezionare le cellule stabilmente trasfettate.Dopo 10 giorni di selezione utilizzando il terreno DMEM F12 integrato con 10% FBS e 400 microgrammi per microlitro G418, ordinare le cellule con la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza. Diluire in serie le cellule positive raccolte. Seminarli in media da 0,5 a 2 cellule per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti e coltura in 37 gradi Celsius, incubatore di anidride carbonica al 6%.Nell'analisi microscopica rappresentativa, tutte le cellule degli ibridomi apparivano rotonde, luminose e chiare. Gli anticorpi monoclonali purificati contenenti catene pesanti da 50 kilodalton e catene leggere da 25 kilodalton sono stati confermati da SDS-PAGE e sono stati trovati nell'ascite purificata. I titoli di questi anticorpi monoclonali anti-APN nei supernatanti e nell'ascite di coltura sono mostrati qui.L'isotipizzazione degli anticorpi monoclonali di topo ha rivelato che gli anticorpi derivati dai cloni 5B31, 5B36, 3C48, 5C51 e 6C56 possedevano sottoclassi di immunoglobuline G2B mentre APN 2A20 era un anticorpo di tipo kappa di immunoglobuline G2A e l'anticorpo monoclonale APN 3FD9, 3F10 e 10F3 apparteneva al tipo di immunoglobulina M e alle catene leggere kappa trasformate. La maggior parte di questi anticorpi monoclonali ha mostrato valori AV superiori al 50%, indicando che hanno preso di mira epitopi diversi nell'APN, mentre l'anticorpo APN 5C51 ha riconosciuto epitopi antigenici come quelli riconosciuti dagli anticorpi monoclonali APN 3C48, 5B31 e 6C56. Il gene VHVL APN 5B36 amplificato è stato legato in un vettore pET28a positivo o pIRES2-zs Green uno per costruire rispettivamente i plasmidi di espressione ricombinante pET28a positivo RABS APN e pIRES2-zs Green uno RABS APN.Gli anticorpi espressi da pET28a più anticorpi ricombinanti aminopeptidasi NBL21 e pIRES2-zs Green uno anticorpi ricombinanti aminopeptidasi NCHO cellule NCHO sono stati purificati e analizzati utilizzando saggi ELISA e IFA. Tuttavia, solo l'anticorpo espresso nel surnatante di pIRES2-zs Green uno anticorpi ricombinanti aminopeptidasi NCHO cellule riconoscono la proteina APN. Il legame degli anticorpi monoclonali APN 5B36 alle proteine APN ha raggiunto un equilibrio prima degli anticorpi ricombinanti.La purificazione degli anticorpi monoclonali nel surnatante usando la proteina A agarosio è migliore rispetto all'uso della precipitazione satura di solfato di ammoniaca.

Research

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