Name: production of monoclonal antibodies targeting aminopeptidase n in the porcine intestinal mucosal epithelium
Uploaded: 2021-05-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium at JoVE.com

Denne studien ble støttet av Chinese National Science Foundation Grant (nr. 32072820, 31702242), tilskudd fra Jiangsu Government Scholarship for Overseas Studies (JS20190246) og Talents på høyt nivå fra Yangzhou University Scientific Research Foundation, et prosjekt grunnlagt av Priority Academic Program of Development Jiangsu High Education Institution.

Alle dyreforsøk i denne studien ble godkjent av Yangzhou University Institutional Animal Care and Use Committee (SYXK20200041).
1. Fremstilling av svinekjøtt APN protein antigen
MERK: pET28a (+)-APN-BL21 (DE3)-stammen og APN-stabilt uttrykte celler pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 ble konstruert i en tidligere studie11.
<ol><li>Gjenopprett bakterier fra en frossen glyserolbestand og strek på Luria-Bertani (LB) plater som inneholder 50 μg / ml kanam...

<ol>
	<li>Chen, L., Lin, Y. L., Peng, G., Li, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+multifunctional+roles+of+mammalian+aminopeptidase+N.">Structural basis for multifunctional roles of mammalian aminopeptidase N.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States Of America. 109 (44), 17966-17971 (2012).</li><li>Mina-Osorio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+moonlighting+enzyme+CD13:+old+and+new+functions+to+target.">The moonlighting enzyme CD13: old and new functions to target.</a> Trends in Molecular Medicine. 14 (8), 361-371 (2008).</li><li>Lu, C., Amin, M. A., Fox, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD13/Aminopeptidase+N+is+a+potential+therapeutic+target+for+inflammatory+disorders.">CD13/Aminopeptidase N is a potential therapeutic target for inflammatory disorders.</a> The Journal of Immunology. 204 (1), 3-11 (2020).</li><li>Villase&#241;or-Cardoso, M. I., Frausto-Del-R&#237;o, D. A., Ortega, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminopeptidase+N+(CD13)+is+involved+in+phagocytic+processes+in+human+dendritic+cells+and+macrophages.">Aminopeptidase N (CD13) is involved in phagocytic processes in human dendritic cells and macrophages.</a> BioMed Research International. 2013, 562984 (2013).</li><li>Melkebeek, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+aminopeptidase+N,+a+newly+identified+receptor+for+F4ac+fimbriae,+enhances+the+intestinal+mucosal+immune+response.">Targeting aminopeptidase N, a newly identified receptor for F4ac fimbriae, enhances the intestinal mucosal immune response.</a> Mucosal Immunology. 5 (6), 635-645 (2012).</li><li>Morgan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+aminopeptidase+N/CD13+produced+by+fibroblast-like+synoviocytes+in+rheumatoid+arthritis:+role+of+CD13+in+chemotaxis+of+cytokine-activated+T+cells+independent+of+enzymatic+activity.">Expression and function of aminopeptidase N/CD13 produced by fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis: role of CD13 in chemotaxis of cytokine-activated T cells independent of enzymatic activity.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 67 (1), 74-85 (2015).</li><li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+and+arthritogenic+properties+of+the+soluble+form+of+CD13.">Angiogenic and arthritogenic properties of the soluble form of CD13.</a> The Journal of Immunology. 203 (2), 360-369 (2019).</li><li>Rasschaert, K., Devriendt, B., Favoreel, H., Goddeeris, B. M., Cox, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin-mediated+endocytosis+and+transcytosis+of+enterotoxigenic+Escherichia+coli+F4+fimbriae+in+porcine+intestinal+epithelial+cells.">Clathrin-mediated endocytosis and transcytosis of enterotoxigenic Escherichia coli F4 fimbriae in porcine intestinal epithelial cells.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 137 (3-4), 243-250 (2010).</li><li>Reguera, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+bases+of+coronavirus+attachment+to+host+aminopeptidase+N+and+its+inhibition+by+neutralizing+antibodies.">Structural bases of coronavirus attachment to host aminopeptidase N and its inhibition by neutralizing antibodies.</a> PLoS Pathogens. 8 (8), 100859 (2012).</li><li>Delmas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminopeptidase+N+is+a+major+receptor+for+the+entero-pathogenic+coronavirus+TGEV.">Aminopeptidase N is a major receptor for the entero-pathogenic coronavirus TGEV.</a> Nature. 357 (6377), (1992).</li><li>Xia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+aminopeptidase+N+binds+to+F4++enterotoxigenic+Escherichia+coli+fimbriae.">Porcine aminopeptidase N binds to F4+ enterotoxigenic Escherichia coli fimbriae.</a> Veterinary Research. 47 (1), 24 (2016).</li><li>Nakamura, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies:+methods+and+clinical+laboratory+applications.">Monoclonal antibodies: methods and clinical laboratory applications.</a> Clinical Physiology and Biochemistry. 1 (2-5), 160-172 (1983).</li><li>Chan, C. E., Chan, A. H., Lim, A. P., Hanson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+efficiency+of+antibody+selection+from+semi-synthetic+scFv+and+non-immune+Fab+phage+display+libraries+against+protein+targets+for+rapid+development+of+diagnostic+immunoassays.">Comparison of the efficiency of antibody selection from semi-synthetic scFv and non-immune Fab phage display libraries against protein targets for rapid development of diagnostic immunoassays.</a> Journal of Immunological Methods. 373 (1-2), 79-88 (2011).</li><li>K&#246;hler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).</li><li>El Miedany, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MABS:+targeted+therapy+tailored+to+the+patient's+need.">MABS: targeted therapy tailored to the patient's need.</a> British Journal of Nursing. 24 (16), 4-13 (2015).</li><li>Castelli, M. S., McGonigle, P., Hornby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharmacology+and+therapeutic+applications+of+monoclonal+antibodies.">The pharmacology and therapeutic applications of monoclonal antibodies.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 7 (6), 00535 (2019).</li><li>Weiner, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+better+monoclonal+antibody-based+therapeutics.">Building better monoclonal antibody-based therapeutics.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).</li><li>Bakshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+single-domain+antibodies+as+carriers+for+targeted+vaccine+delivery+to+the+small+intestinal+epithelium.">Evaluating single-domain antibodies as carriers for targeted vaccine delivery to the small intestinal epithelium.</a> Journal of Controlled Release. 321, 416-429 (2020).</li><li>Kohler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> The Journal of Immunology. 174 (5), 2453-2455 (2005).</li><li>Chen, W., Liu, W. E., Li, Y. M., Luo, S., Zhong, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+preliminary+application+of+monoclonal+antibodies+to+the+receptor+binding+region+of+Clostridium+difficile+toxin+B.">Preparation and preliminary application of monoclonal antibodies to the receptor binding region of Clostridium difficile toxin B.</a> Molecular Medicine Reports. 12 (5), 7712-7720 (2015).</li><li>Levieux, D., Venien, A., Levieux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitopic+analysis+and+quantification+of+bovine+myoglobin+with+monoclonal+antibodies.">Epitopic analysis and quantification of bovine myoglobin with monoclonal antibodies.</a> Hybridoma. 14 (5), 435-442 (1995).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellin+and+F4+fimbriae+have+opposite+effects+on+biofilm+formation+and+quorum+sensing+in+F4ac++enterotoxigenic+Escherichia+coli.">Flagellin and F4 fimbriae have opposite effects on biofilm formation and quorum sensing in F4ac+ enterotoxigenic Escherichia coli.</a> Veterinary Microbiology. 168 (1), 148-153 (2014).</li><li>Heinrich, L., Tissot, N., Hartmann, D. J., Cohen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+results+obtained+by+ELISA+and+surface+plasmon+resonance+for+the+determination+of+antibody+affinity.">Comparison of the results obtained by ELISA and surface plasmon resonance for the determination of antibody affinity.</a> Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 13-22 (2010).</li><li>Vander Weken, H., Cox, E., Devriendt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+oral+subunit+vaccine+design.">Advances in oral subunit vaccine design.</a> Vaccines. 9, 1 (2020).</li><li>Baert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-glucan+microparticles+targeted+to+epithelial+APN+as+oral+antigen+delivery+system.">&#946;-glucan microparticles targeted to epithelial APN as oral antigen delivery system.</a> Journal of Controlled Release. 220, 149-159 (2015).</li><li>Neuberger, M. S., Williams, G. T., Fox, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+antibodies+possessing+novel+effector+functions.">Recombinant antibodies possessing novel effector functions.</a> Nature. 312 (5995), 604-608 (1984).</li></ol>

Induksjon av slimhinneimmunitet er en av de mest effektive tilnærmingene for å motvirke patogener og i forebygging og behandling av ulike sykdommer. APN, et sterkt uttrykt membranbundet protein i tarmslimhinnen, er involvert i induksjon av adaptiv immunrespons og i reseptormediert viral og bakteriell endocytose 1,5,8. APN brukes som antigenpartikler i mange formater av antigenbelastning og vaksinelevering. Den orale administra...

Aminopeptidase N (APN), et måneskinnsenzym som tilhører metalloproteinase M1-familien, fungerer som en tumormarkør, reseptor og signalmolekyl via enzymavhengige og enzymuavhengige veier 1,2. I tillegg til å spalte de N-terminale aminosyrerester av forskjellige bioaktive peptider for regulering av deres biologiske aktivitet, spiller APN en viktig rolle i patogenesen av ulike inflammatoriske sykdommer. APN deltar i antigenbehandling og presentasjon av trimmede peptider som binder tett til store histokompatibilitetskompleks klasse II-molekyler 2,3. APN utøver også antiinflammatoriske effekter ved å binde seg til G-proteinkoblede reseptorer som deltar i multippel signaltransduksjon, modulerer cytokinsekresjon og bidrar til Fc gammareseptormediert fagocytose i immunresponsen 4,5,6,7.
Som en vidt distribuert membranbundet eksopeptidase er APN rikelig i svinens tynntarmslimhinne og er nært forbundet med reseptormediert endocytose 1,5,8. APN gjenkjenner og binder piggproteinet til det overførbare gastroenterittviruset for celleinngang, og interagerer direkte med FaeG-underenheten av enterotoksigene Escherichia coli F4 fimbriae for å påvirke bakteriell adherens med vertsceller 9,10,11. Dermed er APN et potensielt terapeutisk mål i behandlingen av virale og bakterielle infeksjonssykdommer.
Siden utviklingen av hybridoma-teknologi og andre strategier for monoklonale antistoffer (mAbs) produksjon i 1975, har mAbs blitt mye brukt i immunterapi, legemiddellevering og diagnose12,13,14. For tiden brukes mAbs med hell til å behandle sykdommer, som kreft, inflammatorisk tarmsykdom og multippel sklerose12,15. På grunn av deres sterke affinitet og spesifisitet kan mAbs være ideelle mål i utviklingen av antistoff-legemiddelkonjugater (ADC) eller nye vaksiner16,17. APN-proteinet er kritisk for selektivt å levere antigener til spesifikke celler, og kan fremkalle en spesifikk og sterk slimhinneimmunrespons mot patogener uten forstyrrelser, inkludert lavt proteinuttrykk, enzyminaktivitet eller strukturelle endringer 5,8,18. Derfor viser terapeutiske produkter basert på APN-spesifikke mAbs løfte mot bakterielle og virusinfeksjoner. I denne studien beskriver vi produksjon av APN-spesifikke mAbs ved hjelp av hybridoma-teknologi, og ekspresjon av anti-APN rekombinante antistoffer (rAbs) ved bruk av prokaryote og eukaryote vektorer. Resultatet indikerer at APN-proteinet ble gjenkjent av både rAbs uttrykt i pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-celler og hybridomavledede mAbs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Complete Freund&#8217;s adjuvant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5881</td>
			<td>Animal immunization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>C1002</td>
			<td>Nuclear counterstain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody</td>
			<td>Abbkine</td>
			<td>A23310</td>
			<td>Indirect immunofluorescence analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced Cell Counting Kit-8</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>C0042</td>
			<td>Measurement&#160;of&#160;cell&#160;viability and vitality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10091</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneticin&#8482; Selective Antibiotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11811098</td>
			<td>Selective antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAT Supplement (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21060017</td>
			<td>Cell selection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11067030</td>
			<td>Cell selection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incomplete Freund&#8217;s adjuvant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5506</td>
			<td>Animal immunization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl &#946;-d-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5502</td>
			<td>Protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>ST102</td>
			<td>Bactericidal antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 STED confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>&#160;SP8 STED</td>
			<td>Fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine&#174; 2000 Reagent</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa&#8482; fluorescence-activated cell sorting</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACS LSRFortessa</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BOX 998</td>
			<td>ELISA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Nano Drop one</td>
			<td>Nucleic acid concentration detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019308</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10002917</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985088</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 1500</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10783641001</td>
			<td>Cell fusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript&#8482; 1st strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>RR047</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein A agarose</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>P2006</td>
			<td>Antibody protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protino&#174; Ni+-TED 2000 Packed Columns</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>745120.5</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SBA Clonotyping System-HRP</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>May-00</td>
			<td>Isotyping of mouse monoclonal antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seamless Cloning Kit</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>D7010S</td>
			<td>Construction of plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shake flasks</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>E3285</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>C0221A</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>&#160;170-3940</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Homogenizer</td>
			<td>Ningbo Xinzhi Biotechnology</td>
			<td>JY92-IIN</td>
			<td>Sample homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of monoclonal antibodies targeting aminopeptidase n in the porcine intestinal mucosal epithelium

Svineaminopeptidase N (APN), en membranbundet metallopeptidase som er rikelig tilstede i tynntarmslimhinnen, kan initiere en mukosal immunrespons uten forstyrrelser som lavt proteinuttrykk, enzyminaktivitet eller strukturelle endringer. Dette gjør APN til en attraktiv kandidat i utviklingen av vaksiner som selektivt retter seg mot slimhinneepitelet. Tidligere studier har vist at APN er et reseptorprotein for både enterotoksigene Escherichia coli (E. coli) F4 og overførbart gastroenterittvirus. Dermed viser APN løfte om utvikling av antistoff-legemiddelkonjugater eller nye vaksiner basert på APN-spesifikke antistoffer. I denne studien sammenlignet vi produksjon av APN-spesifikke monoklonale antistoffer (mAbs) ved bruk av tradisjonell hybridoma-teknologi og rekombinant antistoffekspresjonsmetode. Vi etablerte også en stabilt transfektert kinesisk hamsterovarie (CHO) cellelinje ved bruk av pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN og en E. coli-uttrykk BL21 (DE3) stamme som inneholder pET28a (+) -rAbs-APN-vektoren. Resultatene viser at antistoffer uttrykt i pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-celler og mAbs produsert ved hjelp av hybridomer kunne gjenkjenne og binde seg til APN-proteinet. Dette gir grunnlag for videre belysing av APN-reseptorfunksjonen for utvikling av terapeutika rettet mot ulike APN-spesifikke epitoper.

I denne studien ble det rensede, løselige APN-proteinet (2,12 mg/ml) brukt til immunisering av mus. Mus immunisert med APN-proteinet fire ganger med 14-dagers intervaller viste en høyere antistofftiter mot APN i sera. Selv om 14 hybridomer ble oppnådd ved hjelp av fusjonseksperimentene, overlevde bare 9 hybridomer de tre kontinuerlige fryse-tine-syklusene, noe som resulterte i 9 stabile kloner som utskilte antistoffer mot APN. Alle disse cellene er runde, lyse og klare (figur 1). De rense...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium at JoVE.com

Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium

Det rekombinante antistoffproteinet uttrykt i pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-celler og monoklonale antistoffer produsert ved hjelp av tradisjonell hybridoma-teknologi kan gjenkjenne og binde seg til porcinaminopeptidase N (APN) proteinet.

Produksjon av monoklonale antistoffer rettet mot aminopeptidase N i tarmslimhinneepitelet hos svin

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response ...

Deriverte monoklonale antistoffer brukes primært i diagnostiske terapeutiske immunreagenser, noe som understreker behovet for å produsere stabile og pålitelige antistoffer i begrenset produksjon forberedt. Metodene beskrevet her viste at rekombinant antistoffproduksjon kunne øke monoklonalt antistoff produksjonseffektivitet og minimere arbeidskraft og tidsrelaterte kostnader. Metodene brukes til å utvikle aminopeptidase og antistoffbaserte antistoffmedikamentkonjugater og andre terapeutiske produkter, som hjelper til med å klargjøre APNs rolle i forebygging og behandling av bakterielle og virusinfeksjoner.Demonstrere prosedyren vil være Yan Li, en postgrad student fra laboratoriet mitt. For å begynne, injiser intraperitonealt 100 mikrogram APN-protein i de utvalgte voksne kvinnelige musene for en endelig antigenforsterkning. Etter tre dager med injeksjon, samle milten fra mus og vask med DMEM to ganger for å fjerne blod og fettceller.Filtrer miltcellesuspensjonen ved hjelp av et 200-nett kobbergitter for å fjerne vevsrester og høste miltceller ved hjelp av sentrifugering for å fjerne miltmembranen. Frø musen SP20 myelom celler i en 25 kvadratcentimeter kolbe inneholdende fem milliliter DMEM supplert med 6% føtal storfe serum og kultur cellene ved 37 grader Celsius og 6% karbondioksid atmosfære for å opprettholde celle levedyktighet. Etter fem til seks dager med kultur, bør cellene nå 80 til 90% sammenløp etter gjenopplivning og vises runde, lyse og klare under mikroskopet.En dag før hybridisering, samle makrofager fra peritoneale hulrom av musene. Frø peritoneale makrofager med en tetthet på 0,1 til 0,2 ganger 10 til femte per milliliter i 96-brønnplater, som hver inneholder 100 mikroliter HAT-medium og inkuberer dem over natten. For hybridisering, aspirer SP20-celler forsiktig med en pipette fra 8 til 10 flasker og oppheng dem i 10 ml serumfritt DMEM-medium.Vask cellene med fersk DMEM og sentrifuge dem to ganger, og deretter resuspendere dem i 10 ml DMEM. Bland de kvantifiserte miltcellene med SB20-celler i forholdet 10: 1 og overfør dem til 50 milliliter rør. Etter sentrifugering, kast supernatanten og samle pellets på bunnen av rørene.Trykk på røret for å løsne pellets før hybridisering. Bruk en dråpeteller, tilsett en milliliter polyetylenglykol 1500 forvarmet til 37 grader Celsius dråpevis til den løsnede cellepelleten over 45 sekunder mens du forsiktig roterer bunnen av røret. Deretter sakte tilsett en milliliter DMEM forvarmet til 37 grader Celsius til blandingen i 90 sekunder, etterfulgt av ytterligere 30 ml fersk DMEM og legg fusjonsrøret i et 37 grader Celsius vannbad i 30 minutter.Etter inkubering, høst cellene. Resuspender HAT-mediet og kulturen i en 96-brønns plate inokulert med peritoneale makrofager. Etter fem dager, tilsett 100 mikroliter ferskt HAT-medium til hver brønn.Og igjen etter fem dager med inkubasjon, erstatt mediet med HAT-medium. Bruk en mikrotiterplate belagt med fem mikrogram per milliliter APN-protein fortynnet i 0,05 molar PBS for å analysere monoklonale antistoffer i hybridomas supernatant ved bruk av ELISA-analyse. Vokse pET28a pluss rekombinante antistoffer aminopeptidase NBL21 transformerte bakterier i nærvær av 0,4 millimolar beta-d-1-tiogalaktopyranosid i en orbital shaker ved 37 grader Celsius i 10 timer.Frø 100 mikroliter 0,5 ganger 10 til den femte kinesiske hamster eggstokkceller per brønn i en 96-brønnplate for inkubasjon ved 37 grader Celsius og en 6% karbondioksid atmosfære i 18 til 24 timer. Når cellene når 80 til 90% konfluens, fortynn pIRES2-zs Green en rekombinante antistoffer aminopeptidase og plasmid med Opti-MEM til en endelig konsentrasjon på 0,1 mikrogram per mikroliter. Etter fem minutter, bland 50 mikroliter fortynnet pIRES2-zs Green en rekombinante antistoffer aminopeptidaser og plasmid med en mikroliter Lipofectamine 2000 og 49 mikroliter Opti-MEM.Etter 20 minutters inkubasjon, tilsett 100 mikroliter av blandingen til hver brønn i en 96-brønnplate inneholdende CHO-celler. Ved fire til seks timer etter transfeksjon, erstatt mediet med DMEM F12 supplert med 10% FBS. Etter 48 timers inkubasjon, tilsett 400 mikrogram per mikroliter G418 til hver brønn for å velge de stabilt transfekterte cellene.Etter 10 dagers valg ved bruk av DMEM F12-medium supplert med 10% FBS og 400 mikrogram per mikroliter G418, sorter cellene med fluorescensaktivert cellesortering. Serielt fortynne de høstede positive cellene. Frø dem i gjennomsnitt 0,5 til 2 celler per brønn i en 96-brønnplate og kultur i 37 grader Celsius, 6% karbondioksidinkubator.I representativ mikroskopisk analyse virket alle hybridomeceller runde, lyse og klare. De rensede monoklonale antistoffene med tunge 50 kilodalton og lette 25 kilodaltonkjeder ble bekreftet av SDS-PAGE og ble funnet i de rensede ascites. Titere av disse anti-APN monoklonale antistoffene i kultursupernatanter og ascites er vist her.Musemonoklonalt antistoff isotyping viste at antistoffer avledet fra kloner 5B31, 5B36, 3C48, 5C51 og 6C56 hadde immunoglobulin G2B subklasser mens APN 2A20 var et immunoglobulin G2A kappa type antistoff og monoklonalt antistoff APN 3FD9, 3F10 og 10F3 tilhørte immunoglobulin M-type og bearbeidede kappa lette kjeder. De fleste av disse monoklonale antistoffene viste AV-verdier på over 50%, noe som indikerer at de målrettet mot forskjellige epitoper i APN, mens APN 5C51-antistoffet gjenkjente antigene epitoper som de som ble anerkjent av APN 3C48, 5B31 og 6C56 monoklonale antistoffer. Det amplifiserte APN 5B36 VHVL-genet ble ligert til en pET28a-positiv eller pIRES2-zs grønn envektor for å konstruere henholdsvis de rekombinante ekspresjonsplasmidene pET28a positiv RABS APN og pIRES2-zs Green one RABS APN.Antistoffene uttrykt av både pET28a pluss rekombinante antistoffer aminopeptidase NBL21 og pIRES2-zs Green one rekombinante antistoffer aminopeptidase NCHO-celler ble renset og analysert ved hjelp av ELISA- og IFA-analyser. Imidlertid gjenkjenner bare antistoffet uttrykt i supernatanten av pIRES2-zs Green one rekombinante antistoffer aminopeptidase NCHO-celler APN-proteinet. Binding av APN 5B36 monoklonale antistoffer til APN-proteiner nådde en likevekt tidligere enn rekombinante antistoffer.Rensing av de monoklonale antistoffene i supernatanten ved bruk av protein A-agarose er bedre enn å bruke mettet ammoniakksulfatutfelling.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Introduksjon Kokulturanalyse for å vurdere patogenindusert nøytrofil transepiteriemigrasjon

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Modellering candidiasis i slimhinner i Larvesebrafisk av Swimbladder Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Generasjon av rekombinant humant IgG monoklonale antistoffer fra udødelig Ordnet B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Evaluering av effekt og toksisitet av RNA Targeting HIV-1 Produksjon for bruk i Gene eller Medikamentell behandling

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Generering av monoklonale antistoffer fra mus ved Hybridoma Technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasiv prøvetaking slimhinnene slimhinnen væske for kvantifisering av In Vivo øvre luftveier immun-megler nivåer

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Generasjon av Escape varianter av nøytralisere influensa Virus monoklonale antistoffer

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Generasjon av Discriminative menneskelige monoklonale antistoffer fra sjeldne Antigen-spesifikke B celler i blodet

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

Generasjon av monoklonale antistoffer mot naturlige produkter

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...