Name: production of monoclonal antibodies targeting aminopeptidase n in the porcine intestinal mucosal epithelium
Uploaded: 2021-05-18T13:00:00
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Este estudio fue apoyado por la Beca de la Fundación Nacional de Ciencias de China (No. 32072820, 31702242), subvenciones de la Beca del Gobierno de Jiangsu para Estudios en el Extranjero (JS20190246) y Talentos de Alto Nivel de la Fundación de Investigación Científica de la Universidad de Yangzhou, un proyecto fundado por el Programa Académico Prioritario de Desarrollo de la Institución de Educación Superior de Jiangsu.

Todos los experimentos con animales en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Yangzhou (SYXK20200041).
1. Preparación del antígeno de la proteína APN porcina
NOTA: La cepa pET28a (+)-APN-BL21 (DE3) y las células APN expresadas establemente pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 fueron construidas en un estudio previo11.
<ol><li>Recuperar bacterias de una cepa de glicerol congelada y ra...

<ol>
	<li>Chen, L., Lin, Y. L., Peng, G., Li, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+multifunctional+roles+of+mammalian+aminopeptidase+N.">Structural basis for multifunctional roles of mammalian aminopeptidase N.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States Of America. 109 (44), 17966-17971 (2012).</li><li>Mina-Osorio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+moonlighting+enzyme+CD13:+old+and+new+functions+to+target.">The moonlighting enzyme CD13: old and new functions to target.</a> Trends in Molecular Medicine. 14 (8), 361-371 (2008).</li><li>Lu, C., Amin, M. A., Fox, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD13/Aminopeptidase+N+is+a+potential+therapeutic+target+for+inflammatory+disorders.">CD13/Aminopeptidase N is a potential therapeutic target for inflammatory disorders.</a> The Journal of Immunology. 204 (1), 3-11 (2020).</li><li>Villase&#241;or-Cardoso, M. I., Frausto-Del-R&#237;o, D. A., Ortega, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminopeptidase+N+(CD13)+is+involved+in+phagocytic+processes+in+human+dendritic+cells+and+macrophages.">Aminopeptidase N (CD13) is involved in phagocytic processes in human dendritic cells and macrophages.</a> BioMed Research International. 2013, 562984 (2013).</li><li>Melkebeek, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+aminopeptidase+N,+a+newly+identified+receptor+for+F4ac+fimbriae,+enhances+the+intestinal+mucosal+immune+response.">Targeting aminopeptidase N, a newly identified receptor for F4ac fimbriae, enhances the intestinal mucosal immune response.</a> Mucosal Immunology. 5 (6), 635-645 (2012).</li><li>Morgan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+aminopeptidase+N/CD13+produced+by+fibroblast-like+synoviocytes+in+rheumatoid+arthritis:+role+of+CD13+in+chemotaxis+of+cytokine-activated+T+cells+independent+of+enzymatic+activity.">Expression and function of aminopeptidase N/CD13 produced by fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis: role of CD13 in chemotaxis of cytokine-activated T cells independent of enzymatic activity.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 67 (1), 74-85 (2015).</li><li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+and+arthritogenic+properties+of+the+soluble+form+of+CD13.">Angiogenic and arthritogenic properties of the soluble form of CD13.</a> The Journal of Immunology. 203 (2), 360-369 (2019).</li><li>Rasschaert, K., Devriendt, B., Favoreel, H., Goddeeris, B. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies:+methods+and+clinical+laboratory+applications.">Monoclonal antibodies: methods and clinical laboratory applications.</a> Clinical Physiology and Biochemistry. 1 (2-5), 160-172 (1983).</li><li>Chan, C. E., Chan, A. H., Lim, A. P., Hanson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+efficiency+of+antibody+selection+from+semi-synthetic+scFv+and+non-immune+Fab+phage+display+libraries+against+protein+targets+for+rapid+development+of+diagnostic+immunoassays.">Comparison of the efficiency of antibody selection from semi-synthetic scFv and non-immune Fab phage display libraries against protein targets for rapid development of diagnostic immunoassays.</a> Journal of Immunological Methods. 373 (1-2), 79-88 (2011).</li><li>K&#246;hler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).</li><li>El Miedany, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MABS:+targeted+therapy+tailored+to+the+patient's+need.">MABS: targeted therapy tailored to the patient's need.</a> British Journal of Nursing. 24 (16), 4-13 (2015).</li><li>Castelli, M. S., McGonigle, P., Hornby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharmacology+and+therapeutic+applications+of+monoclonal+antibodies.">The pharmacology and therapeutic applications of monoclonal antibodies.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 7 (6), 00535 (2019).</li><li>Weiner, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+better+monoclonal+antibody-based+therapeutics.">Building better monoclonal antibody-based therapeutics.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).</li><li>Bakshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+single-domain+antibodies+as+carriers+for+targeted+vaccine+delivery+to+the+small+intestinal+epithelium.">Evaluating single-domain antibodies as carriers for targeted vaccine delivery to the small intestinal epithelium.</a> Journal of Controlled Release. 321, 416-429 (2020).</li><li>Kohler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> The Journal of Immunology. 174 (5), 2453-2455 (2005).</li><li>Chen, W., Liu, W. E., Li, Y. M., Luo, S., Zhong, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+preliminary+application+of+monoclonal+antibodies+to+the+receptor+binding+region+of+Clostridium+difficile+toxin+B.">Preparation and preliminary application of monoclonal antibodies to the receptor binding region of Clostridium difficile toxin B.</a> Molecular Medicine Reports. 12 (5), 7712-7720 (2015).</li><li>Levieux, D., Venien, A., Levieux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitopic+analysis+and+quantification+of+bovine+myoglobin+with+monoclonal+antibodies.">Epitopic analysis and quantification of bovine myoglobin with monoclonal antibodies.</a> Hybridoma. 14 (5), 435-442 (1995).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellin+and+F4+fimbriae+have+opposite+effects+on+biofilm+formation+and+quorum+sensing+in+F4ac++enterotoxigenic+Escherichia+coli.">Flagellin and F4 fimbriae have opposite effects on biofilm formation and quorum sensing in F4ac+ enterotoxigenic Escherichia coli.</a> Veterinary Microbiology. 168 (1), 148-153 (2014).</li><li>Heinrich, L., Tissot, N., Hartmann, D. J., Cohen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+results+obtained+by+ELISA+and+surface+plasmon+resonance+for+the+determination+of+antibody+affinity.">Comparison of the results obtained by ELISA and surface plasmon resonance for the determination of antibody affinity.</a> Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 13-22 (2010).</li><li>Vander Weken, H., Cox, E., Devriendt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+oral+subunit+vaccine+design.">Advances in oral subunit vaccine design.</a> Vaccines. 9, 1 (2020).</li><li>Baert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-glucan+microparticles+targeted+to+epithelial+APN+as+oral+antigen+delivery+system.">&#946;-glucan microparticles targeted to epithelial APN as oral antigen delivery system.</a> Journal of Controlled Release. 220, 149-159 (2015).</li><li>Neuberger, M. S., Williams, G. T., Fox, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+antibodies+possessing+novel+effector+functions.">Recombinant antibodies possessing novel effector functions.</a> Nature. 312 (5995), 604-608 (1984).</li></ol>

La inducción de la inmunidad de la mucosa es uno de los enfoques más efectivos para contrarrestar los patógenos y en la prevención y el tratamiento de diversas enfermedades. La NPA, una proteína unida a la membrana altamente expresada en la mucosa intestinal, está implicada en la inducción de la respuesta inmune adaptativa y en la endocitosis viral y bacteriana mediada por receptores 1,5,8. La NPA se utiliza como partícu...

La aminopeptidasa N (APN), una enzima moonlighting que pertenece a la familia de la metaloproteinasa M1, actúa como marcador tumoral, receptor y molécula de señalización a través de vías dependientes de enzimas e independientes de enzimas 1,2. Además de escindir los residuos de aminoácidos N-terminales de varios péptidos bioactivos para la regulación de su actividad biológica, APN juega un papel importante en la patogénesis de diversas enfermedades inflamatorias. La NPA participa en el procesamiento y presentación de antígenos por péptidos recortados que se unen estrechamente a las principales moléculas del complejo de histocompatibilidad de clase II 2,3. La NPA también ejerce efectos antiinflamatorios al unirse con receptores acoplados a proteínas G que participan en la transducción de señales múltiples, modulando la secreción de citoquinas y contribuyendo a la fagocitosis mediada por el receptor gamma Fc en la respuesta inmune 4,5,6,7.
Como exopeptidasa unida a la membrana ampliamente distribuida, la NPA es abundante en la mucosa del intestino delgado porcino y está estrechamente asociada con la endocitosis mediada por receptores 1,5,8. La NPA reconoce y se une a la proteína espiga del virus de la gastroenteritis transmisible para la entrada celular, e interactúa directamente con la subunidad FaeG de las fimbrias enterotoxigénicas Escherichia coli F4 para afectar la adherencia bacteriana con las células huésped 9,10,11. Por lo tanto, la NPA es una potencial diana terapéutica en el tratamiento de enfermedades infecciosas virales y bacterianas.
Desde el desarrollo de la tecnología de hibridoma y otras estrategias para la producción de anticuerpos monoclonales (mAbs) en 1975, los mAbs se han utilizado ampliamente en inmunoterapia, administración de fármacos y diagnóstico12,13,14. Actualmente, los mAbs se utilizan con éxito para tratar enfermedades como el cáncer, la enfermedad inflamatoria intestinal y la esclerosis múltiple12,15. Debido a su fuerte afinidad y especificidad, los mAbs pueden ser objetivos ideales en el desarrollo de conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) o nuevas vacunas16,17. La proteína APN es crítica para la entrega selectiva de antígenos a células específicas, y puede provocar una respuesta inmune de la mucosa específica y fuerte contra patógenos sin ninguna interferencia, incluida la baja expresión de proteínas, la inactividad enzimática o los cambios estructurales 5,8,18. Por lo tanto, los productos terapéuticos basados en mAbs específicos de APN son prometedores contra las infecciones bacterianas y virales. En este estudio, describimos la producción de mAbs específicos de APN utilizando tecnología de hibridoma y la expresión de anticuerpos recombinantes anti-APN (rAbs) utilizando vectores procariotas y eucariotas. El resultado indica que la proteína APN fue reconocida tanto por rAbs expresados en células pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO como por mAbs derivadas de hibridomas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Complete Freund&#8217;s adjuvant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5881</td>
			<td>Animal immunization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>C1002</td>
			<td>Nuclear counterstain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody</td>
			<td>Abbkine</td>
			<td>A23310</td>
			<td>Indirect immunofluorescence analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced Cell Counting Kit-8</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>C0042</td>
			<td>Measurement&#160;of&#160;cell&#160;viability and vitality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10091</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneticin&#8482; Selective Antibiotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11811098</td>
			<td>Selective antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAT Supplement (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21060017</td>
			<td>Cell selection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11067030</td>
			<td>Cell selection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incomplete Freund&#8217;s adjuvant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5506</td>
			<td>Animal immunization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl &#946;-d-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5502</td>
			<td>Protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>ST102</td>
			<td>Bactericidal antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 STED confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>&#160;SP8 STED</td>
			<td>Fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine&#174; 2000 Reagent</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa&#8482; fluorescence-activated cell sorting</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACS LSRFortessa</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BOX 998</td>
			<td>ELISA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Nano Drop one</td>
			<td>Nucleic acid concentration detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019308</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10002917</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985088</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 1500</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10783641001</td>
			<td>Cell fusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript&#8482; 1st strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>RR047</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein A agarose</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>P2006</td>
			<td>Antibody protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protino&#174; Ni+-TED 2000 Packed Columns</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>745120.5</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SBA Clonotyping System-HRP</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>May-00</td>
			<td>Isotyping of mouse monoclonal antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seamless Cloning Kit</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>D7010S</td>
			<td>Construction of plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shake flasks</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>E3285</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>C0221A</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>&#160;170-3940</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Homogenizer</td>
			<td>Ningbo Xinzhi Biotechnology</td>
			<td>JY92-IIN</td>
			<td>Sample homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of monoclonal antibodies targeting aminopeptidase n in the porcine intestinal mucosal epithelium

La aminopeptidasa porcina N (APN), una metalopeptidasa unida a la membrana abundantemente presente en la mucosa del intestino delgado, puede iniciar una respuesta inmune de la mucosa sin ninguna interferencia, como baja expresión de proteínas, inactividad enzimática o cambios estructurales. Esto hace que APN sea un candidato atractivo en el desarrollo de vacunas que se dirigen selectivamente al epitelio de la mucosa. Estudios previos han demostrado que la APN es una proteína receptora tanto para la Escherichia coli enterotoxigénica (E. coli) F4 como para el virus de la gastroenteritis transmisible. Por lo tanto, APN se muestra prometedora en el desarrollo de conjugados anticuerpo-fármaco o nuevas vacunas basadas en anticuerpos específicos de APN. En este estudio, comparamos la producción de anticuerpos monoclonales específicos de APN (mAbs) utilizando la tecnología tradicional de hibridoma y el método de expresión de anticuerpos recombinantes. También establecimos una línea celular de ovario de hámster chino (CHO) transfectada de manera estable utilizando pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN y una cepa BL21 (DE3) de expresión de E. coli que alberga el vector pET28a (+)-rAbs-APN. Los resultados muestran que los anticuerpos expresados en células pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO y mAbs producidos mediante hibridomas podrían reconocer y unirse a la proteína APN. Esto proporciona la base para una mayor elucidación de la función del receptor de APN para el desarrollo de terapias dirigidas a diferentes epítopos específicos de APN.

En este estudio, la proteína APN soluble purificada (2,12 mg/ml) se utilizó para la inmunización con ratones. Los ratones inmunizados con la proteína APN cuatro veces a intervalos de 14 días exhibieron un título de anticuerpos más alto contra APN en sus sueros. Aunque se obtuvieron 14 hibridomas utilizando los experimentos de fusión, solo 9 hibridomas sobrevivieron a los tres ciclos continuos de congelación-descongelación, lo que resultó en 9 clones estables que secretaron anticuerpos contra APN. Todas estas c...

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Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium

La proteína de anticuerpo recombinante expresada en células pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO y anticuerpos monoclonales producidos utilizando la tecnología tradicional de hibridoma puede reconocer y unirse a la proteína N aminopeptidasa porcina (APN).

Producción de anticuerpos monoclonales dirigidos a la aminopeptidasa N en el epitelio de la mucosa intestinal porcina

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response ...

Los anticuerpos monoclonales derivados se utilizan principalmente en reactivos inmunes terapéuticos de diagnóstico destacando la necesidad de producir anticuerpos estables y confiables en preparación de producción limitada. Los métodos descritos aquí demostraron que la producción de anticuerpos recombinantes podría aumentar la eficiencia de la producción de anticuerpos monoclonales y minimizar los costos asociados con la mano de obra y el tiempo. Los métodos se utilizan para desarrollar conjugados de fármacos de aminopeptidasa y anticuerpos basados en anticuerpos y otros productos terapéuticos, lo que ayuda a aclarar el papel de la NPA en la prevención y el tratamiento de infecciones bacterianas y virales.Demostrando el procedimiento estará Yan Li, un estudiante de posgrado de mi laboratorio. Para comenzar, inyecte intraperitonealmente 100 microgramos de proteína APN en los ratones hembra adultos seleccionados para un refuerzo final del antígeno. Después de tres días de inyección, recoja el bazo de los ratones y lávese con DMEM dos veces para eliminar la sangre y las células grasas.Filtre la suspensión de las células del bazo con una rejilla de cobre de malla 200 para eliminar los restos de tejido y recolecte las células del bazo mediante centrifugación para eliminar la membrana del bazo. Sembrar las células de mieloma SP20 del ratón en un matraz de 25 centímetros cuadrados que contiene cinco mililitros de DMEM suplementado con 6% de suero bovino fetal y cultivar las células a 37 grados centígrados y 6% de atmósfera de dióxido de carbono para mantener la viabilidad celular. Después de cinco a seis días de cultivo, las células deben alcanzar el 80 al 90% de confluencia después de la reanimación y aparecer redondas, brillantes y claras bajo el microscopio.Un día antes de la hibridación, recolecte macrófagos de las cavidades peritoneales de los ratones. Siembre macrófagos peritoneales a una densidad de 0.1 a 0.2 veces de 10 a quinto por mililitro en placas de 96 pocillos, cada una con 100 microlitros de medio HAT e incubarlos durante la noche. Para la hibridación, aspire suavemente las células SP20 con una pipeta de 8 a 10 botellas y suspendalas en 10 mililitros de medio DMEM sin suero.Lave las células con DMEM fresco y centrifugarlas dos veces, luego resuspenderlas en 10 mililitros de DMEM. Mezcle las células del bazo cuantificadas con células SB20 en una proporción de 10: 1 y transfiéralas a tubos de 50 mililitros. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y recoja los gránulos en el fondo de los tubos.Golpee el tubo para aflojar los gránulos antes de la hibridación. Usando un gotero, agregue un mililitro de polietilenglicol 1500 precalentado a 37 grados centígrados gota a gota al pellet de celda aflojado durante 45 segundos mientras gira suavemente el fondo del tubo. Luego, agregue lentamente un mililitro de DMEM precalentado a 37 grados centígrados a la mezcla durante 90 segundos, seguido de otros 30 mililitros de DMEM fresco y coloque el tubo de fusión en un baño de agua de 37 grados centígrados durante 30 minutos.Después de la incubación, cosecha las células. Resuspender el medio HAT y cultivar en una placa de 96 pocillos inoculada con macrófagos peritoneales. Después de cinco días, agregue 100 microlitros de HAT medio fresco a cada pocillo.Y nuevamente después de cinco días de incubación, reemplace el medio con medio HAT. Utilice una placa de microtitulación recubierta con cinco microgramos por mililitro de proteína APN diluida en PBS molar 0,05 para analizar anticuerpos monoclonales en el sobrenadante de hibridomas mediante el ensayo ELISA. Cultivar la pET28a más anticuerpos recombinantes aminopeptidasa NBL21 transformó bacterias en presencia de 0,4 milimolares beta-d-1-tiogalactopiranosida en un agitador orbital a 37 grados centígrados durante 10 horas.Siembre 100 microlitros 0.5 veces 10 a la quinta célula de ovario de hámster chino por pocillo en una placa de 96 pocillos para incubación a 37 grados centígrados y una atmósfera de dióxido de carbono al 6% durante 18 a 24 horas. Cuando las células alcancen 80 a 90% de confluencia, diluir el pIRES2-zs Green uno anticuerpos recombinantes aminopeptidasa y plásmido con Opti-MEM a una concentración final de 0,1 microgramos por microlitro. Después de cinco minutos, mezclar los 50 microlitros de pIRES2-zs Green diluido uno anticuerpos recombinantes aminopeptidasas y plásmido con un microlitro de Lipofectamina 2000 y 49 microlitros de Opti-MEM.Después de 20 minutos de incubación, agregue 100 microlitros de la mezcla a cada pocillo de una placa de 96 pocillos que contenga células CHO. De cuatro a seis horas después de la transfección, reemplace el medio con DMEM F12 suplementado con 10% FBS. Después de 48 horas de incubación, agregue 400 microgramos por microlitro G418 a cada pocillo para seleccionar las células transfectadas de manera estable.Después de 10 días de selección usando DMEM F12 medio suplementado con 10% FBS y 400 microgramos por microlitro G418, clasifique las células con clasificación celular activada por fluorescencia. Diluir en serie las células positivas cosechadas. Sembrarlos a un promedio de 0.5 a 2 células por pozo en una placa de 96 pocillos y cultivar en una incubadora de dióxido de carbono al 6% de 37 grados centígrados.En un análisis microscópico representativo, todas las células de los hibridomas parecían redondas, brillantes y claras. Los anticuerpos monoclonales purificados que poseen cadenas pesadas de 50 kilodalton y ligeras de 25 kilodalton fueron confirmados por SDS-PAGE y se encontraron en la ascitis purificada. Los títulos de estos anticuerpos monoclonales anti-APN en sobrenadantes de cultivo y ascitis se muestran aquí.El isotipado de anticuerpos monoclonales de ratón reveló que los anticuerpos derivados de los clones 5B31, 5B36, 3C48, 5C51 y 6C56 poseían subclases de inmunoglobulina G2B, mientras que APN 2A20 era un anticuerpo tipo kappa de inmunoglobulina G2A y un anticuerpo monoclonal APN 3FD9, 3F10 y 10F3 pertenecían a cadenas ligeras kappa de tipo M de inmunoglobulina y procesadas. La mayoría de estos anticuerpos monoclonales mostraron valores AV de más del 50%, lo que indica que se dirigieron a diferentes epítopos en el APN, mientras que el anticuerpo APN 5C51 reconoció epítopos antigénicos como los reconocidos por los anticuerpos monoclonales APN 3C48, 5B31 y 6C56. El gen APN 5B36 VHVL amplificado se ligó en un vector pET28a positivo o pIRES2-zs Green one para construir los plásmidos de expresión recombinante pET28a positivo RABS APN y pIRES2-zs Green uno RABS APN respectivamente.Los anticuerpos expresados tanto por pET28a más anticuerpos recombinantes aminopeptidasa NBL21 y pIRES2-zs Green uno anticuerpos recombinantes aminopeptidasa células NCHO se purificaron y analizaron mediante ensayos ELISA e IFA. Sin embargo, sólo el anticuerpo expresado en el sobrenadante de pIRES2-zs Green uno anticuerpos recombinantes aminopeptidasa NCHO células reconocen la proteína APN. La unión de anticuerpos monoclonales APN 5B36 a proteínas APN alcanzó un equilibrio antes que los anticuerpos recombinantes.La purificación de los anticuerpos monoclonales en el sobrenadante utilizando agarosa de la proteína A es mejor que el uso de precipitación de sulfato de amoníaco saturado.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Administración pasiva de anticuerpos monoclonales contra H. capsulatum Y otros hongos patógenos

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

Investigación

Inmunología e Infección

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

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In vitro Ensayo de cocultivo para evaluar la migración transepitelial de neutrófilos inducida por patógenos

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Modelado de las mucosas Candidiasis en larvas de pez cebra por inyección de Swimbladder

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Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Generación de recombinante humano IgG anticuerpos monoclonales a partir de células inmortalizadas B Ordenada

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Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

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Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

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Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

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Muestreo no invasivo de revestimiento mucoso líquido para la cuantificación In Vivo de la vía aérea superior mediador inmune niveles

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Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Generación de anticuerpos monoclonales humanos discriminativo de células B antígeno específicas raras circulan en sangre

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The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...