Name: production of monoclonal antibodies targeting aminopeptidase n in the porcine intestinal mucosal epithelium
Uploaded: 2021-05-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium at JoVE.com

Denna studie stöddes av Chinese National Science Foundation Grant (nr 32072820, 31702242), bidrag från Jiangsu Government Scholarship for Overseas Studies (JS20190246) och High-level Talents of Yangzhou University Scientific Research Foundation, ett projekt grundat av Priority Academic Program of Development Jiangsu High Education Institution.

Alla djurförsök i denna studie godkändes av Yangzhou University Institutional Animal Care and Use Committee (SYXK20200041).
1. Beredning av APN-proteinantigen från svin
OBS: Stammen pET28a (+)-APN-BL21 (DE3) och de APN stabilt uttryckta cellerna pEGFP-C1-APN-IPEC-J2 konstruerades i en tidigare studie11.
<ol><li>Extrahera bakterier från en fryst glycerolstam och stryk på Luria-Bertani (LB) plattor innehållande 50 μg/ml kanamycin (Km<...

<ol>
	<li>Chen, L., Lin, Y. L., Peng, G., Li, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+multifunctional+roles+of+mammalian+aminopeptidase+N.">Structural basis for multifunctional roles of mammalian aminopeptidase N.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States Of America. 109 (44), 17966-17971 (2012).</li><li>Mina-Osorio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+moonlighting+enzyme+CD13:+old+and+new+functions+to+target.">The moonlighting enzyme CD13: old and new functions to target.</a> Trends in Molecular Medicine. 14 (8), 361-371 (2008).</li><li>Lu, C., Amin, M. A., Fox, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD13/Aminopeptidase+N+is+a+potential+therapeutic+target+for+inflammatory+disorders.">CD13/Aminopeptidase N is a potential therapeutic target for inflammatory disorders.</a> The Journal of Immunology. 204 (1), 3-11 (2020).</li><li>Villase&#241;or-Cardoso, M. I., Frausto-Del-R&#237;o, D. A., Ortega, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminopeptidase+N+(CD13)+is+involved+in+phagocytic+processes+in+human+dendritic+cells+and+macrophages.">Aminopeptidase N (CD13) is involved in phagocytic processes in human dendritic cells and macrophages.</a> BioMed Research International. 2013, 562984 (2013).</li><li>Melkebeek, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+aminopeptidase+N,+a+newly+identified+receptor+for+F4ac+fimbriae,+enhances+the+intestinal+mucosal+immune+response.">Targeting aminopeptidase N, a newly identified receptor for F4ac fimbriae, enhances the intestinal mucosal immune response.</a> Mucosal Immunology. 5 (6), 635-645 (2012).</li><li>Morgan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+aminopeptidase+N/CD13+produced+by+fibroblast-like+synoviocytes+in+rheumatoid+arthritis:+role+of+CD13+in+chemotaxis+of+cytokine-activated+T+cells+independent+of+enzymatic+activity.">Expression and function of aminopeptidase N/CD13 produced by fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis: role of CD13 in chemotaxis of cytokine-activated T cells independent of enzymatic activity.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 67 (1), 74-85 (2015).</li><li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+and+arthritogenic+properties+of+the+soluble+form+of+CD13.">Angiogenic and arthritogenic properties of the soluble form of CD13.</a> The Journal of Immunology. 203 (2), 360-369 (2019).</li><li>Rasschaert, K., Devriendt, B., Favoreel, H., Goddeeris, B. M., Cox, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin-mediated+endocytosis+and+transcytosis+of+enterotoxigenic+Escherichia+coli+F4+fimbriae+in+porcine+intestinal+epithelial+cells.">Clathrin-mediated endocytosis and transcytosis of enterotoxigenic Escherichia coli F4 fimbriae in porcine intestinal epithelial cells.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 137 (3-4), 243-250 (2010).</li><li>Reguera, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+bases+of+coronavirus+attachment+to+host+aminopeptidase+N+and+its+inhibition+by+neutralizing+antibodies.">Structural bases of coronavirus attachment to host aminopeptidase N and its inhibition by neutralizing antibodies.</a> PLoS Pathogens. 8 (8), 100859 (2012).</li><li>Delmas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminopeptidase+N+is+a+major+receptor+for+the+entero-pathogenic+coronavirus+TGEV.">Aminopeptidase N is a major receptor for the entero-pathogenic coronavirus TGEV.</a> Nature. 357 (6377), (1992).</li><li>Xia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+aminopeptidase+N+binds+to+F4++enterotoxigenic+Escherichia+coli+fimbriae.">Porcine aminopeptidase N binds to F4+ enterotoxigenic Escherichia coli fimbriae.</a> Veterinary Research. 47 (1), 24 (2016).</li><li>Nakamura, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies:+methods+and+clinical+laboratory+applications.">Monoclonal antibodies: methods and clinical laboratory applications.</a> Clinical Physiology and Biochemistry. 1 (2-5), 160-172 (1983).</li><li>Chan, C. E., Chan, A. H., Lim, A. P., Hanson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+efficiency+of+antibody+selection+from+semi-synthetic+scFv+and+non-immune+Fab+phage+display+libraries+against+protein+targets+for+rapid+development+of+diagnostic+immunoassays.">Comparison of the efficiency of antibody selection from semi-synthetic scFv and non-immune Fab phage display libraries against protein targets for rapid development of diagnostic immunoassays.</a> Journal of Immunological Methods. 373 (1-2), 79-88 (2011).</li><li>K&#246;hler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).</li><li>El Miedany, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MABS:+targeted+therapy+tailored+to+the+patient's+need.">MABS: targeted therapy tailored to the patient's need.</a> British Journal of Nursing. 24 (16), 4-13 (2015).</li><li>Castelli, M. S., McGonigle, P., Hornby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharmacology+and+therapeutic+applications+of+monoclonal+antibodies.">The pharmacology and therapeutic applications of monoclonal antibodies.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 7 (6), 00535 (2019).</li><li>Weiner, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+better+monoclonal+antibody-based+therapeutics.">Building better monoclonal antibody-based therapeutics.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).</li><li>Bakshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+single-domain+antibodies+as+carriers+for+targeted+vaccine+delivery+to+the+small+intestinal+epithelium.">Evaluating single-domain antibodies as carriers for targeted vaccine delivery to the small intestinal epithelium.</a> Journal of Controlled Release. 321, 416-429 (2020).</li><li>Kohler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> The Journal of Immunology. 174 (5), 2453-2455 (2005).</li><li>Chen, W., Liu, W. E., Li, Y. M., Luo, S., Zhong, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+preliminary+application+of+monoclonal+antibodies+to+the+receptor+binding+region+of+Clostridium+difficile+toxin+B.">Preparation and preliminary application of monoclonal antibodies to the receptor binding region of Clostridium difficile toxin B.</a> Molecular Medicine Reports. 12 (5), 7712-7720 (2015).</li><li>Levieux, D., Venien, A., Levieux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitopic+analysis+and+quantification+of+bovine+myoglobin+with+monoclonal+antibodies.">Epitopic analysis and quantification of bovine myoglobin with monoclonal antibodies.</a> Hybridoma. 14 (5), 435-442 (1995).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellin+and+F4+fimbriae+have+opposite+effects+on+biofilm+formation+and+quorum+sensing+in+F4ac++enterotoxigenic+Escherichia+coli.">Flagellin and F4 fimbriae have opposite effects on biofilm formation and quorum sensing in F4ac+ enterotoxigenic Escherichia coli.</a> Veterinary Microbiology. 168 (1), 148-153 (2014).</li><li>Heinrich, L., Tissot, N., Hartmann, D. J., Cohen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+results+obtained+by+ELISA+and+surface+plasmon+resonance+for+the+determination+of+antibody+affinity.">Comparison of the results obtained by ELISA and surface plasmon resonance for the determination of antibody affinity.</a> Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 13-22 (2010).</li><li>Vander Weken, H., Cox, E., Devriendt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+oral+subunit+vaccine+design.">Advances in oral subunit vaccine design.</a> Vaccines. 9, 1 (2020).</li><li>Baert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-glucan+microparticles+targeted+to+epithelial+APN+as+oral+antigen+delivery+system.">&#946;-glucan microparticles targeted to epithelial APN as oral antigen delivery system.</a> Journal of Controlled Release. 220, 149-159 (2015).</li><li>Neuberger, M. S., Williams, G. T., Fox, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+antibodies+possessing+novel+effector+functions.">Recombinant antibodies possessing novel effector functions.</a> Nature. 312 (5995), 604-608 (1984).</li></ol>

Induktion av slemhinneimmunitet är ett av de mest effektiva tillvägagångssätten för att motverka patogener och förebygga och behandla olika sjukdomar. APN, ett starkt uttryckt membranbundet protein i tarmslemhinnan, är involverat i induktionen av adaptivt immunsvar och i receptormedierad viral och bakteriell endocytos 1,5,8. APN används som antigenpartiklar i många format av antigenladdning och vaccinleverans. Den orala...

Aminopeptidas N (APN), ett månskensenzym som tillhör metalloproteinas M1-familjen, fungerar som en tumörmarkör, receptor och signalmolekyl via enzymberoende och enzymoberoende vägar 1,2. Förutom att klyva N-terminala aminosyrarester av olika bioaktiva peptider för reglering av deras biologiska aktivitet spelar APN en viktig roll i patogenesen av olika inflammatoriska sjukdomar. APN deltar i antigenbearbetning och presentation av trimmade peptider som binder tätt till stora histokompatibilitetskomplexa klass II-molekyler 2,3. APN utövar också antiinflammatoriska effekter genom att binda med G-proteinkopplade receptorer som deltar i multipel signaltransduktion, modulerar cytokinsekretion och bidrar till Fc-gammareceptormedierad fagocytos i immunsvaret 4,5,6,7.
Som ett brett distribuerat membranbundet exopeptidas är APN rikligt i svinets tunntarmslimhinna och är nära associerad med receptormedierad endocytos 1,5,8. APN känner igen och binder spikproteinet hos det överförbara gastroenteritviruset för cellinträde och interagerar direkt med FaeG-underenheten av enterotoxinbildande Escherichia coli F4-fimbrier för att påverka bakteriell vidhäftning med värdceller 9,10,11. Således är APN ett potentiellt terapeutiskt mål vid behandling av virus- och bakterieinfektionssjukdomar.
Sedan utvecklingen av hybridomteknik och andra strategier för monoklonala antikroppar (mAbs) produktion 1975 har mAbs använts i stor utsträckning inom immunterapi, läkemedelsleverans och diagnos12,13,14. För närvarande används mAbs framgångsrikt för att behandla sjukdomar, såsom cancer, inflammatorisk tarmsjukdom och multipel skleros12,15. På grund av deras starka affinitet och specificitet kan mAbs vara idealiska mål vid utveckling av antikropps-läkemedelskonjugat (ADC) eller nya vacciner16,17. APN-proteinet är avgörande för att selektivt leverera antigener till specifika celler och kan framkalla ett specifikt och starkt mukosalt immunsvar mot patogener utan störningar inklusive lågt proteinuttryck, enzyminaktivitet eller strukturella förändringar 5,8,18. Därför visar terapeutiska produkter baserade på APN-specifika mAbs löfte mot bakteriella och virusinfektioner. I denna studie beskriver vi produktionen av APN-specifika mAbs med hjälp av hybridomteknik och uttryck av anti-APN-rekombinanta antikroppar (rAbs) med hjälp av prokaryota och eukaryota vektorer. Resultatet indikerar att APN-proteinet kändes igen av både rAbs uttryckt i pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-celler och hybridom-härledda mAbs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Complete Freund&#8217;s adjuvant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5881</td>
			<td>Animal immunization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>C1002</td>
			<td>Nuclear counterstain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody</td>
			<td>Abbkine</td>
			<td>A23310</td>
			<td>Indirect immunofluorescence analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced Cell Counting Kit-8</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>C0042</td>
			<td>Measurement&#160;of&#160;cell&#160;viability and vitality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10091</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneticin&#8482; Selective Antibiotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11811098</td>
			<td>Selective antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAT Supplement (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21060017</td>
			<td>Cell selection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11067030</td>
			<td>Cell selection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incomplete Freund&#8217;s adjuvant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5506</td>
			<td>Animal immunization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl &#946;-d-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5502</td>
			<td>Protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>ST102</td>
			<td>Bactericidal antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 STED confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>&#160;SP8 STED</td>
			<td>Fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine&#174; 2000 Reagent</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa&#8482; fluorescence-activated cell sorting</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACS LSRFortessa</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BOX 998</td>
			<td>ELISA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Nano Drop one</td>
			<td>Nucleic acid concentration detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019308</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10002917</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985088</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 1500</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10783641001</td>
			<td>Cell fusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript&#8482; 1st strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>RR047</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein A agarose</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>P2006</td>
			<td>Antibody protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protino&#174; Ni+-TED 2000 Packed Columns</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>745120.5</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SBA Clonotyping System-HRP</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>May-00</td>
			<td>Isotyping of mouse monoclonal antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seamless Cloning Kit</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>D7010S</td>
			<td>Construction of plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shake flasks</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>E3285</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>C0221A</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>&#160;170-3940</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Homogenizer</td>
			<td>Ningbo Xinzhi Biotechnology</td>
			<td>JY92-IIN</td>
			<td>Sample homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of monoclonal antibodies targeting aminopeptidase n in the porcine intestinal mucosal epithelium

Svinaminopeptidas N (APN), ett membranbundet metallopeptidas som finns rikligt i tunntarmslimhinnan, kan initiera ett slemhinneimmunsvar utan störningar såsom lågt proteinuttryck, enzyminaktivitet eller strukturella förändringar. Detta gör APN till en attraktiv kandidat i utvecklingen av vacciner som selektivt riktar sig mot slemhinneepitelet. Tidigare studier har visat att APN är ett receptorprotein för både enterotoxinproducerande Escherichia coli (E. coli) F4 och överförbart gastroenteritvirus. Således visar APN löfte i utvecklingen av antikropps-läkemedelskonjugat eller nya vacciner baserade på APN-specifika antikroppar. I denna studie jämförde vi produktion av APN-specifika monoklonala antikroppar (mAbs) med traditionell hybridomteknik och rekombinant antikroppsuttrycksmetod. Vi etablerade också en stabilt transfekterad kinesisk hamsteräggstockscellinje (CHO) med pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN och en E. coli-uttryck BL21 (DE3) stam som innehåller pET28a (+) -rAbs-APN-vektorn. Resultaten visar att antikroppar uttryckta i pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-celler och mAbs producerade med hybridom kunde känna igen och binda till APN-proteinet. Detta utgör grunden för ytterligare klarläggande av APN-receptorns funktion för utveckling av läkemedel riktade mot olika APN-specifika epitoper.

I denna studie användes det renade lösliga APN-proteinet (2.12 mg / ml) för immunisering av möss. Möss immuniserade med APN-proteinet fyra gånger med 14-dagars mellanrum uppvisade en högre antikroppstiter mot APN i deras serum. Även om 14 hybridom erhölls med hjälp av fusionsexperimenten, överlevde endast 9 hybridom de tre kontinuerliga frys-tina cyklerna, vilket resulterade i 9 stabila kloner som utsöndrade antikroppar mot APN. Alla dessa celler är runda, ljusa och klara (figur 1</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium at JoVE.com

Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium

Det rekombinanta antikroppsproteinet uttryckt i pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-celler och monoklonala antikroppar producerade med traditionell hybridomteknik kan känna igen och binda till svinaminopeptidas N (APN) -proteinet.

Produktion av monoklonala antikroppar riktade mot aminopeptidas N i svinets tarmslemhinneepitel

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response ...

Härledda monoklonala antikroppar används främst i diagnostiska terapeutiska immunreagens, vilket belyser behovet av att producera stabila och tillförlitliga antikroppar i begränsad produktion framställd. De metoder som beskrivs här visade att rekombinant antikroppsproduktion kan öka effektiviteten i monoklonal antikroppsproduktion och minimera arbets- och tidskostnader. Metoderna används för att utveckla aminopeptidas och antikroppsbaserade antikroppsläkemedelskonjugat och andra terapeutiska produkter, vilket hjälper till att klargöra APN: s roll vid förebyggande och behandling av bakteriella och virusinfektioner.Demonstrerar proceduren kommer att vara Yan Li, en doktorand från mitt laboratorium. Till att börja med injicera intraperitonealt 100 mikrogram APN-protein i de utvalda vuxna kvinnliga mössen för en slutlig antigenförstärkning. Efter tre dagars injektion, samla mjälten från möss och tvätta med DMEM två gånger för att avlägsna blod och fettceller.Filtrera mjältcellsuspensionen med ett 200 nät kopparnät för att avlägsna vävnadsskräp och skörda mjältceller med centrifugering för att avlägsna mjältmembranet. Frö musens SP20-myelomceller i en 25 kvadratcentimeter kolv innehållande fem milliliter DMEM kompletterat med 6% fetalt bovint serum och odla cellerna vid 37 grader Celsius och 6% koldioxidatmosfär för att bibehålla cellens livskraft. Efter fem till sex dagars odling bör cellerna nå 80 till 90% sammanflöde efter återupplivning och verka runda, ljusa och klara under mikroskopet.En dag före hybridisering, samla makrofager från mössens peritoneala hålrum. Frö peritoneala makrofager med en densitet av 0,1 till 0,2 gånger 10 till femte per milliliter i 96-brunnsplattor, vardera innehållande 100 mikroliter HAT-medium och inkubera dem över natten. För hybridisering, sug försiktigt SP20-celler med en pipett från 8 till 10 flaskor och suspendera dem i 10 ml serumfritt DMEM-medium.Tvätta cellerna med färsk DMEM och centrifugera dem två gånger och suspendera dem sedan igen i 10 ml DMEM. Blanda de kvantifierade mjältcellerna med SB20-celler i förhållandet 10: 1 och överför dem till 50 ml rör. Efter centrifugering, kassera supernatanten och samla pellets i botten av rören.Knacka på röret för att lossa pelletsen före hybridisering. Tillsätt med en droppare en milliliter polyetylenglykol 1500 förvärmd till 37 grader Celsius droppvis till den lossade cellpelleten under 45 sekunder medan du försiktigt roterar rörets botten. Tillsätt sedan långsamt en milliliter DMEM förvärmd till 37 grader Celsius till blandningen i 90 sekunder, följt av ytterligare 30 ml färsk DMEM och placera fusionsröret i ett 37 grader Celsius vattenbad i 30 minuter.Efter inkubation, skörda cellerna. Resuspendera HAT-mediet och kulturen i en 96-brunnsplatta inokulerad med peritoneala makrofager. Efter fem dagar, tillsätt 100 mikroliter färskt HAT-medium till varje brunn.Och igen efter fem dagars inkubation, byt ut mediet med HAT-medium. Använd en mikrotiterplatta belagd med fem mikrogram per milliliter APN-protein utspätt i 0,05 molar PBS för att analysera monoklonala antikroppar i hybridomsupernatanten med ELISA-analys. Odla pET28a plus rekombinanta antikroppar aminopeptidas NBL21-transformerade bakterier i närvaro av 0,4 millimolar beta-d-1-tiogalaktospyranosid i en orbitalskakare vid 37 grader Celsius i 10 timmar.Frö 100 mikroliter 0,5 gånger 10 till den femte kinesiska hamstern äggstocksceller per brunn i en 96-brunnsplatta för inkubation vid 37 grader Celsius och en 6% koldioxidatmosfär i 18 till 24 timmar. När cellerna når 80 till 90% sammanflöde, späd pIRES2-zs Green en rekombinant antikroppar aminopeptidas och plasmid med Opti-MEM till en slutlig koncentration av 0,1 mikrogram per mikroliter. Efter fem minuter, blanda 50 mikroliter utspädd pIRES2-zs Green, en rekombinant antikroppar, aminopeptidaser och plasmid med en mikroliter lipofectamin 2000 och 49 mikroliter Opti-MEM.Efter 20 minuters inkubation tillsätts 100 mikroliter av blandningen till varje brunn i en 96-brunnsplatta innehållande CHO-celler. Vid fyra till sex timmar efter transfektion, ersätt mediet med DMEM F12 kompletterat med 10% FBS. Efter 48 timmars inkubation, tillsätt 400 mikrogram per mikroliter G418 till varje brunn för att välja de stabilt transfekterade cellerna.Efter 10 dagars urval med DMEM F12-medium kompletterat med 10% FBS och 400 mikrogram per mikroliter G418, sortera cellerna med fluorescensaktiverad cellsortering. Späd de skördade positiva cellerna seriellt. Frö dem i genomsnitt 0,5 till 2 celler per brunn i en 96-brunnsplatta och odla i 37 grader Celsius, 6% koldioxidinkubator.I representativ mikroskopisk analys verkade alla hybridomceller runda, ljusa och klara. De renade monoklonala antikropparna med tunga 50 kilodalton- och lätta 25 kilodaltonkedjor bekräftades av SDS-PAGE och hittades i de renade ascitesna. Titrarna av dessa monoklonala antikroppar mot APN i odlingssupernatanter och ascites visas här.Monoklonal antikroppsisotypning hos möss avslöjade att antikroppar härledda från klonerna 5B31, 5B36, 3C48, 5C51 och 6C56 hade immunglobulin G2B-underklasser medan APN 2A20 var en immunoglobulin G2A-kappa-typ antikropp och monoklonal antikropp APN 3FD9, 3F10 och 10F3 tillhörde immunoglobulin M-typ och bearbetade kappaljuskedjor. De flesta av dessa monoklonala antikroppar visade AV-värden på över 50%, vilket indikerar att de riktade sig mot olika epitoper i APN medan APN 5C51-antikroppen kände igen antigena epitoper som de som känns igen av APN 3C48, 5B31 och 6C56 monoklonala antikroppar. Den förstärkta APN 5B36 VHVL-genen ligerades till en pET28a-positiv eller pIRES2-zs Green en vektor för att konstruera de rekombinanta expressionsplasmiderna pET28a-positiva RABS APN respektive pIRES2-zs Green en RABS APN.Antikropparna uttryckta av både pET28a plus rekombinanta antikroppar aminopeptidas NBL21 och pIRES2-zs Green one rekombinanta antikroppar aminopeptidas NCHO-celler renades och analyserades med ELISA- och IFA-analyser. Endast antikroppen uttryckt i supernatanten av pIRES2-zs Grön en rekombinant antikroppar aminopeptidas NCHO-celler känner igen APN-proteinet. Bindning av APN 5B36 monoklonala antikroppar till APN-proteiner nådde en jämvikt tidigare än rekombinanta antikroppar.Rening av de monoklonala antikropparna i supernatanten med användning av protein A-agaros är bättre än att använda mättad ammoniaksulfatutfällning.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Passiv Administrering av monoklonala antikroppar mot H. capsulatum M.fl. svamppatogener

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Kokulturanalys för att bedöma patogeninducerad neutrofil transeptelmigration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Modellering Mucosal candidiasis i larvZebraFish genom Swimbladder Injektion

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Framställning av rekombinant human IgG monoklonala antikroppar från Immortaliserade Sorterat B-celler

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Utvärdering av effekt och toxicitet av RNA Targeting HIV-1-produktion för användning i Gene eller Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Generering av murina monoklonala antikroppar genom hybridomteknik

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Icke-invasiv provtagning av slemhinna slemhinnan vätska för kvantifiering av In Vivo övre luftvägarna immun-medlare nivåer

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Generation av Escape varianter av neutraliserande influensa Virus monoklonala antikroppar

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Generation av diskriminerande humana monoklonala antikroppar från sällsynta Antigen-specifika B-celler som cirkulerar i blodet

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

Generation av monoklonala antikroppar mot naturliga produkter

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...