Name: production of monoclonal antibodies targeting aminopeptidase n in the porcine intestinal mucosal epithelium
Uploaded: 2021-05-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium at JoVE.com

Bu çalışma, Çin Ulusal Bilim Vakfı Hibesi (No. 32072820, 31702242), Jiangsu Hükümeti Denizaşırı Çalışmalar Bursu (JS20190246) ve Yangzhou Üniversitesi Bilimsel Araştırma Vakfı'nın Üst Düzey Yetenekleri tarafından desteklenmiştir.

Bu çalışmadaki tüm hayvan deneyleri Yangzhou Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (SYXK20200041) tarafından onaylanmıştır.
1. Domuz APN protein antijeninin hazırlanması
NOT: pET28a (+)-APN-BL21 (DE3) suşu ve APN kararlı bir şekilde eksprese edilen hücreler pEGFP-C1-APN-IPEC-J2, önceki bir çalışmadainşa edilmiştir 11.
<ol><li>Dondurulmuş bir gliserol stoğundan bakterileri geri kazanın ve tek k...

<ol>
	<li>Chen, L., Lin, Y. L., Peng, G., Li, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+multifunctional+roles+of+mammalian+aminopeptidase+N.">Structural basis for multifunctional roles of mammalian aminopeptidase N.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States Of America. 109 (44), 17966-17971 (2012).</li><li>Mina-Osorio, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+moonlighting+enzyme+CD13:+old+and+new+functions+to+target.">The moonlighting enzyme CD13: old and new functions to target.</a> Trends in Molecular Medicine. 14 (8), 361-371 (2008).</li><li>Lu, C., Amin, M. A., Fox, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD13/Aminopeptidase+N+is+a+potential+therapeutic+target+for+inflammatory+disorders.">CD13/Aminopeptidase N is a potential therapeutic target for inflammatory disorders.</a> The Journal of Immunology. 204 (1), 3-11 (2020).</li><li>Villase&#241;or-Cardoso, M. I., Frausto-Del-R&#237;o, D. A., Ortega, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminopeptidase+N+(CD13)+is+involved+in+phagocytic+processes+in+human+dendritic+cells+and+macrophages.">Aminopeptidase N (CD13) is involved in phagocytic processes in human dendritic cells and macrophages.</a> BioMed Research International. 2013, 562984 (2013).</li><li>Melkebeek, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+aminopeptidase+N,+a+newly+identified+receptor+for+F4ac+fimbriae,+enhances+the+intestinal+mucosal+immune+response.">Targeting aminopeptidase N, a newly identified receptor for F4ac fimbriae, enhances the intestinal mucosal immune response.</a> Mucosal Immunology. 5 (6), 635-645 (2012).</li><li>Morgan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+function+of+aminopeptidase+N/CD13+produced+by+fibroblast-like+synoviocytes+in+rheumatoid+arthritis:+role+of+CD13+in+chemotaxis+of+cytokine-activated+T+cells+independent+of+enzymatic+activity.">Expression and function of aminopeptidase N/CD13 produced by fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis: role of CD13 in chemotaxis of cytokine-activated T cells independent of enzymatic activity.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 67 (1), 74-85 (2015).</li><li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+and+arthritogenic+properties+of+the+soluble+form+of+CD13.">Angiogenic and arthritogenic properties of the soluble form of CD13.</a> The Journal of Immunology. 203 (2), 360-369 (2019).</li><li>Rasschaert, K., Devriendt, B., Favoreel, H., Goddeeris, B. M., Cox, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin-mediated+endocytosis+and+transcytosis+of+enterotoxigenic+Escherichia+coli+F4+fimbriae+in+porcine+intestinal+epithelial+cells.">Clathrin-mediated endocytosis and transcytosis of enterotoxigenic Escherichia coli F4 fimbriae in porcine intestinal epithelial cells.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 137 (3-4), 243-250 (2010).</li><li>Reguera, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+bases+of+coronavirus+attachment+to+host+aminopeptidase+N+and+its+inhibition+by+neutralizing+antibodies.">Structural bases of coronavirus attachment to host aminopeptidase N and its inhibition by neutralizing antibodies.</a> PLoS Pathogens. 8 (8), 100859 (2012).</li><li>Delmas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminopeptidase+N+is+a+major+receptor+for+the+entero-pathogenic+coronavirus+TGEV.">Aminopeptidase N is a major receptor for the entero-pathogenic coronavirus TGEV.</a> Nature. 357 (6377), (1992).</li><li>Xia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+aminopeptidase+N+binds+to+F4++enterotoxigenic+Escherichia+coli+fimbriae.">Porcine aminopeptidase N binds to F4+ enterotoxigenic Escherichia coli fimbriae.</a> Veterinary Research. 47 (1), 24 (2016).</li><li>Nakamura, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies:+methods+and+clinical+laboratory+applications.">Monoclonal antibodies: methods and clinical laboratory applications.</a> Clinical Physiology and Biochemistry. 1 (2-5), 160-172 (1983).</li><li>Chan, C. E., Chan, A. H., Lim, A. P., Hanson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+efficiency+of+antibody+selection+from+semi-synthetic+scFv+and+non-immune+Fab+phage+display+libraries+against+protein+targets+for+rapid+development+of+diagnostic+immunoassays.">Comparison of the efficiency of antibody selection from semi-synthetic scFv and non-immune Fab phage display libraries against protein targets for rapid development of diagnostic immunoassays.</a> Journal of Immunological Methods. 373 (1-2), 79-88 (2011).</li><li>K&#246;hler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).</li><li>El Miedany, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MABS:+targeted+therapy+tailored+to+the+patient's+need.">MABS: targeted therapy tailored to the patient's need.</a> British Journal of Nursing. 24 (16), 4-13 (2015).</li><li>Castelli, M. S., McGonigle, P., Hornby, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pharmacology+and+therapeutic+applications+of+monoclonal+antibodies.">The pharmacology and therapeutic applications of monoclonal antibodies.</a> Pharmacology Research &amp; Perspectives. 7 (6), 00535 (2019).</li><li>Weiner, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+better+monoclonal+antibody-based+therapeutics.">Building better monoclonal antibody-based therapeutics.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).</li><li>Bakshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+single-domain+antibodies+as+carriers+for+targeted+vaccine+delivery+to+the+small+intestinal+epithelium.">Evaluating single-domain antibodies as carriers for targeted vaccine delivery to the small intestinal epithelium.</a> Journal of Controlled Release. 321, 416-429 (2020).</li><li>Kohler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> The Journal of Immunology. 174 (5), 2453-2455 (2005).</li><li>Chen, W., Liu, W. E., Li, Y. M., Luo, S., Zhong, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+preliminary+application+of+monoclonal+antibodies+to+the+receptor+binding+region+of+Clostridium+difficile+toxin+B.">Preparation and preliminary application of monoclonal antibodies to the receptor binding region of Clostridium difficile toxin B.</a> Molecular Medicine Reports. 12 (5), 7712-7720 (2015).</li><li>Levieux, D., Venien, A., Levieux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitopic+analysis+and+quantification+of+bovine+myoglobin+with+monoclonal+antibodies.">Epitopic analysis and quantification of bovine myoglobin with monoclonal antibodies.</a> Hybridoma. 14 (5), 435-442 (1995).</li><li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellin+and+F4+fimbriae+have+opposite+effects+on+biofilm+formation+and+quorum+sensing+in+F4ac++enterotoxigenic+Escherichia+coli.">Flagellin and F4 fimbriae have opposite effects on biofilm formation and quorum sensing in F4ac+ enterotoxigenic Escherichia coli.</a> Veterinary Microbiology. 168 (1), 148-153 (2014).</li><li>Heinrich, L., Tissot, N., Hartmann, D. J., Cohen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+results+obtained+by+ELISA+and+surface+plasmon+resonance+for+the+determination+of+antibody+affinity.">Comparison of the results obtained by ELISA and surface plasmon resonance for the determination of antibody affinity.</a> Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 13-22 (2010).</li><li>Vander Weken, H., Cox, E., Devriendt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+oral+subunit+vaccine+design.">Advances in oral subunit vaccine design.</a> Vaccines. 9, 1 (2020).</li><li>Baert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-glucan+microparticles+targeted+to+epithelial+APN+as+oral+antigen+delivery+system.">&#946;-glucan microparticles targeted to epithelial APN as oral antigen delivery system.</a> Journal of Controlled Release. 220, 149-159 (2015).</li><li>Neuberger, M. S., Williams, G. T., Fox, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+antibodies+possessing+novel+effector+functions.">Recombinant antibodies possessing novel effector functions.</a> Nature. 312 (5995), 604-608 (1984).</li></ol>

Mukozal immünitenin indüklenmesi, patojenlere karşı koymada ve çeşitli hastalıkların önlenmesinde ve tedavisinde en etkili yaklaşımlardan biridir. Bağırsak mukozasında yüksek oranda eksprese edilen membrana bağlı bir protein olan APN, adaptif immün yanıtın indüklenmesinde ve reseptör aracılı viral ve bakteriyel endositozda rol oynar 1,5,8. APN, antijen yüklemesi ve aşı dağıtımının birçok formatı...

Metalloproteinaz M1 ailesine ait bir ay ışığı enzimi olan Aminopeptidaz N (APN), enzime bağımlı ve enzimden bağımsız yollar1,2 aracılığıyla bir tümör belirteci, reseptör ve sinyal molekülü olarak işlev görür. APN, biyolojik aktivitelerinin düzenlenmesi için çeşitli biyoaktif peptitlerin N-terminal amino-asit kalıntılarını ayırmanın yanı sıra, çeşitli enflamatuar hastalıkların patogenezinde önemli bir rol oynamaktadır. APN, majör histokompatibilite kompleksi sınıf II molekülleri 2,3'e sıkıca bağlanan kesilmiş peptitler tarafından antijen işleme ve sunumuna katılır. APN ayrıca çoklu sinyal iletimine katılan G proteinine bağlı reseptörlere bağlanarak, sitokin sekresyonunu modüle ederek ve immün yanıtta Fc gama reseptörü aracılı fagositoza katkıda bulunarak anti-enflamatuar etkiler gösterir 4,5,6,7.
Yaygın olarak dağılmış membrana bağlı bir ekzopeptidaz olarak APN, domuz ince bağırsak mukozasında bol miktarda bulunur ve reseptör aracılı endositoz 1,5,8 ile yakından ilişkilidir. APN, hücre girişi için bulaşıcı gastroenterit virüsünün başak proteinini tanır ve bağlar ve konakçı hücrelerle bakteriyel uyumu etkilemek için enterotoksijenik Escherichia coli F4 fimbriae'nin FaeG alt birimi ile doğrudan etkileşime girer 9,10,11. Bu nedenle APN, viral ve bakteriyel enfeksiyon hastalıklarının tedavisinde potansiyel bir terapötik hedeftir.
1975 yılında hibridoma teknolojisinin ve monoklonal antikorların (mAbs) üretimi için diğer stratejilerin geliştirilmesinden bu yana, mAbs immünoterapi, ilaç dağıtımı ve tanıda yaygın olarak kullanılmaktadır12,13,14. Şu anda, mAbs kanser, enflamatuar bağırsak hastalığı ve multipl skleroz gibi hastalıkları tedavi etmek için başarıyla kullanılmaktadır12,15. Güçlü afiniteleri ve özgüllükleri nedeniyle, mAb'ler antikor-ilaç konjugatlarının (ADC) veya yeni aşıların geliştirilmesinde ideal hedefler olabilir16,17. APN proteini, antijenleri spesifik hücrelere seçici olarak vermek için kritik öneme sahiptir ve düşük protein ekspresyonu, enzim hareketsizliği veya yapısal değişiklikler dahil olmak üzere herhangi bir müdahale olmaksızın patojenlere karşı spesifik ve güçlü bir mukozal bağışıklık tepkisi ortaya çıkarabilir 5,8,18. Bu nedenle, APN'ye özgü mAb'lere dayanan terapötik ürünler, bakteriyel ve viral enfeksiyonlara karşı umut vaat etmektedir. Bu çalışmada, hibridoma teknolojisi kullanılarak APN'ye özgü mAbs üretimi ve prokaryotik ve ökaryotik vektörler kullanılarak anti-APN rekombinant antikorların (rAbs) ekspresyonu anlatılmaktadır. Sonuç, APN proteininin hem pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO hücrelerinde hem de hibriddom türevi mAbs'de eksprese edilen rAbs tarafından tanındığını göstermektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Complete Freund&#8217;s adjuvant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5881</td>
			<td>Animal immunization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>C1002</td>
			<td>Nuclear counterstain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965092</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody</td>
			<td>Abbkine</td>
			<td>A23310</td>
			<td>Indirect immunofluorescence analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enhanced Cell Counting Kit-8</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>C0042</td>
			<td>Measurement&#160;of&#160;cell&#160;viability and vitality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10091</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneticin&#8482; Selective Antibiotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11811098</td>
			<td>Selective antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HAT Supplement (50X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21060017</td>
			<td>Cell selection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HT Supplement (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11067030</td>
			<td>Cell selection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incomplete Freund&#8217;s adjuvant</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F5506</td>
			<td>Animal immunization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl &#946;-d-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5502</td>
			<td>Protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>ST102</td>
			<td>Bactericidal antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica TCS SP8 STED confocal microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>&#160;SP8 STED</td>
			<td>Fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine&#174; 2000 Reagent</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>11668019</td>
			<td>Transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa&#8482; fluorescence-activated cell sorting</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACS LSRFortessa</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BOX 998</td>
			<td>ELISA analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Nano Drop one</td>
			<td>Nucleic acid concentration detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10019308</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent</td>
			<td>10002917</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985088</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 1500</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>10783641001</td>
			<td>Cell fusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript&#8482; 1st strand cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>RR047</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein A agarose</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>P2006</td>
			<td>Antibody protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protino&#174; Ni+-TED 2000 Packed Columns</td>
			<td>MACHEREY-NAGEL</td>
			<td>745120.5</td>
			<td>Protein purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SBA Clonotyping System-HRP</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>May-00</td>
			<td>Isotyping of mouse monoclonal antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seamless Cloning Kit</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>D7010S</td>
			<td>Construction of plasmids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shake flasks</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>E3285</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer</td>
			<td>Beyotime&#160; Biotechnology</td>
			<td>C0221A</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>&#160;170-3940</td>
			<td>Western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0042</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Homogenizer</td>
			<td>Ningbo Xinzhi Biotechnology</td>
			<td>JY92-IIN</td>
			<td>Sample homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0021</td>
			<td>Culture broth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of monoclonal antibodies targeting aminopeptidase n in the porcine intestinal mucosal epithelium

İnce bağırsak mukozasında bol miktarda bulunan membrana bağlı bir metallopeptidaz olan domuz aminopeptidaz N (APN), düşük protein ekspresyonu, enzim hareketsizliği veya yapısal değişiklikler gibi herhangi bir müdahale olmaksızın mukozal bir bağışıklık tepkisi başlatabilir. Bu, APN'yi mukozal epiteli seçici olarak hedef alan aşıların geliştirilmesinde çekici bir aday haline getirmektedir. Önceki çalışmalar, APN'nin hem enterotoksijenik Escherichia coli (E. coli) F4 hem de bulaşıcı gastroenterit virüsü için bir reseptör proteini olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, APN, antikor-ilaç konjugatlarının veya APN'ye özgü antikorlara dayanan yeni aşıların geliştirilmesinde umut vaat etmektedir. Bu çalışmada, APN'ye özgü monoklonal antikorların (mAbs) üretimini geleneksel hibridoma teknolojisi ve rekombinant antikor ekspresyon yöntemi kullanılarak karşılaştırdık. Ayrıca, pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN ve pET28a (+)-rAbs-APN vektörünü barındıran bir E. coli ekspresyonu BL21 (DE3) suşu kullanarak kararlı bir şekilde transfekte edilmiş bir Çin hamster yumurtalık (CHO) hücre hattı oluşturduk. Sonuçlar, pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO hücrelerinde eksprese edilen antikorların ve hibridomlar kullanılarak üretilen mAbs'nin APN proteinini tanıyabileceğini ve bağlanabileceğini göstermektedir. Bu, farklı APN'ye özgü epitopları hedef alan terapötiklerin geliştirilmesi için APN reseptör fonksiyonunun daha fazla aydınlatılması için temel sağlar.

Bu çalışmada, fare bağışıklaması için saflaştırılmış çözünür APN proteini (2.12 mg / mL) kullanılmıştır. APN proteini ile 14 günlük aralıklarla dört kez aşılanan fareler, serumlarında APN'ye karşı daha yüksek bir antikor titresi sergiledi. Füzyon deneyleri kullanılarak 14 hibridom elde edilmesine rağmen, üç sürekli donma-çözülme döngüsünden sadece 9 hibridoma hayatta kaldı ve APN'ye karşı antikor salgılayan 9 kararlı klon ile sonuçlandı. Tüm bu hücreler yuvarlak, parla...

Watch this Scientific Journal Video about Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium at JoVE.com

Production of Monoclonal Antibodies Targeting Aminopeptidase N in the Porcine Intestinal Mucosal Epithelium

pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO hücrelerinde eksprese edilen rekombinant antikor proteini ve geleneksel hibridoma teknolojisi kullanılarak üretilen monoklonal antikorlar, domuz aminopeptidaz N (APN) proteinini tanıyabilir ve bağlanabilir.

Domuz Bağırsak Mukozal Epitelinde Aminopeptidaz N'yi Hedef Alan Monoklonal Antikorların Üretimi

Porcine aminopeptidase N (APN), a membrane-bound metallopeptidase abundantly present in small intestinal mucosa, can initiate a mucosal immune response ...

Elde edilen monoklonal antikorlar öncelikle tanısal terapötik immün reaktiflerde kullanılır ve hazırlanan sınırlı üretimde stabil ve güvenilir antikorların üretilmesi gerekliliğini vurgular. Burada açıklanan yöntemler, rekombinant antikor üretiminin monoklonal antikor üretim verimliliğini artırabileceğini ve işçilik ve zamanla ilişkili maliyetleri en aza indirebileceğini kanıtlamıştır. Yöntemler, bakteriyel ve viral enfeksiyonların önlenmesinde ve tedavisinde APN'nin rolünün açıklığa kavuşturulmasına yardımcı olan aminopeptidaz ve antikor bazlı antikor ilaç konjugatları ve diğer terapötik ürünleri geliştirmek için kullanılır.Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Yan Li olacak. Başlamak için, son bir antijen artışı için seçilen yetişkin dişi farelere intraperitoneal olarak 100 mikrogram APN proteini enjekte edin. Üç günlük enjeksiyondan sonra, dalakları farelerden toplayın ve kan ve yağ hücrelerini çıkarmak için DMEM ile iki kez yıkayın.Doku kalıntılarını gidermek için 200 örgülü bir bakır ızgara kullanarak dalak hücresi süspansiyonunu filtreleyin ve dalak zarını çıkarmak için santrifüjleme kullanarak dalak hücrelerini toplayın. Fare SP20 miyelom hücrelerini,% 6 fetal sığır serumu ile desteklenmiş beş mililitre DMEM içeren 25 santimetrekarelik bir şişeye yerleştirin ve hücre canlılığını korumak için hücreleri 37 santigrat derece ve% 6 karbondioksit atmosferinde kültürleyin. Beş ila altı günlük kültürden sonra, hücreler resüsitasyon sonrası% 80 ila% 90 birleşmeye ulaşmalı ve mikroskop altında yuvarlak, parlak ve net görünmelidir.Hibridizasyondan bir gün önce, farelerin periton boşluklarından makrofajları toplayın. Periton makrofajlarını, her biri 100 mikrolitre HAT ortamı içeren 96 delikli plakalarda mililitre başına 0.1 ila 0.2 kat 10 ila beşinci yoğunlukta tohumlayın ve gece boyunca inkübe edin. Hibridizasyon için, SP20 hücrelerini 8 ila 10 şişe pipetle nazikçe aspire edin ve 10 mililitre serumsuz DMEM ortamında askıya alın.Hücreleri taze DMEM ile yıkayın ve iki kez santrifüj edin, ardından 10 mililitre DMEM'de tekrar askıya alın. Kantifiye dalak hücrelerini SB20 hücreleri ile 10: 1 oranında karıştırın ve 50 mililitrelik tüplere aktarın. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın ve topakları tüplerin dibinde toplayın.Hibridizasyondan önce topakları gevşetmek için tüpe dokunun. Bir damlalık kullanarak, tüpün tabanını yavaşça döndürürken, gevşemiş hücre peletine 45 saniye boyunca damla damla 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış bir mililitre polietilen glikol 1500 ekleyin. Daha sonra yavaşça 90 saniye boyunca karışıma önceden 37 santigrat dereceye ısıtılmış bir mililitre DMEM ekleyin, ardından 30 mililitre taze DMEM ekleyin ve füzyon tüpünü 30 dakika boyunca 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirin.Kuluçkadan sonra, hücreleri toplayın. HAT ortamını ve kültürünü, periton makrofajları ile aşılanmış 96 delikli bir plakada yeniden askıya alın. Beş gün sonra, her bir kuyucuğa 100 mikrolitre taze HAT ortamı ekleyin.Ve yine beş günlük inkübasyondan sonra, ortamı HAT ortamı ile değiştirin. ELISA testi kullanarak hibridomas süpernatantındaki monoklonal antikorları analiz etmek için 0.05 molar PBS'de seyreltilmiş mililitre başına beş mikrogram APN proteini ile kaplanmış bir mikrotitre plakası kullanın. pET28a artı rekombinant antikorlar aminopeptidaz NBL21 dönüştürülmüş bakterileri, 10 saat boyunca 37 santigrat derecede bir orbital çalkalayıcıda 0.4 milimolar beta-d-1-tiogalaktopiranosid varlığında büyütün.Kuyu başına 100 mikrolitre 0.5 kez 10 ila beşinci Çin hamster yumurtalık hücrelerini, 37 santigrat derecede inkübasyon için 96 delikli bir plakaya ve 18 ila 24 saat boyunca% 6'lık bir karbondioksit atmosferine tohumlayın. Hücreler% 80 ila% 90 birleşmeye ulaştığında, pIRES2-zs Green bir rekombinant antikorlar aminopeptidaz ve plazmidi Opti-MEM ile mikrolitre başına 0.1 mikrogramlık nihai bir konsantrasyona seyreltin. Beş dakika sonra, 50 mikrolitre seyreltilmiş pIRES2-zs Green bir rekombinant antikor, aminopeptidaz ve plazmidi bir mikrolitre Lipofectamine 2000 ve 49 mikrolitre Opti-MEM ile karıştırın.20 dakikalık inkübasyondan sonra, CHO hücreleri içeren 96 delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna 100 mikrolitre karışım ekleyin. Transfeksiyondan dört ila altı saat sonra, ortamı% 10 FBS ile desteklenmiş DMEM F12 ile değiştirin. 48 saatlik inkübasyondan sonra, kararlı bir şekilde transfekte edilmiş hücreleri seçmek için her bir kuyucuğa mikrolitre G418 başına 400 mikrogram ekleyin.Mikrolitre G12 başına %10 FBS ve 400 mikrogram ile desteklenmiş 418 mikrogram kullanılarak 10 günlük seçimden sonra, floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama ile hücreleri sıralayın. Hasat edilen pozitif hücreleri seri olarak seyreltin. Onları 96 delikli bir plakada kuyu başına ortalama 0,5 ila 2 hücrede tohumlayın ve 37 santigrat derece,% 6 karbondioksit inkübatöründe kültüre alın.Temsili mikroskobik analizde, tüm hibridom hücreleri yuvarlak, parlak ve net görünüyordu. Ağır 50 kilodalton ve hafif 25 kilodalton zincirlere sahip saflaştırılmış monoklonal antikorlar SDS-PAGE tarafından doğrulandı ve saflaştırılmış asitlerde bulundu. Bu anti-APN monoklonal antikorların kültür süpernatantları ve asitlerindeki titreleri burada gösterilmiştir.Fare monoklonal antikor izotiplemesi, 5B31, 5B36, 3C48, 5C51 ve 6C56 klonlarından türetilen antikorların immünoglobulin G2B alt sınıflarına sahip olduğunu, APN 2A20'nin ise immünoglobulin G2A kappa tipi bir antikor ve monoklonal antikor APN 3FD9, 3F10 ve 10F3'ün immünoglobulin M tipine ait olduğunu ve kappa hafif zincirlerini işlediğini ortaya koymuştur. Bu monoklonal antikorların çoğu, APN'deki farklı epitopları hedef aldıklarını gösteren% 50'nin üzerinde AV değerleri gösterirken, APN 5C51 antikoru, APN 3C48, 5B31 ve 6C56 monoklonal antikorları tarafından tanınanlar gibi antijenik epitopları tanıdı. Güçlendirilmiş APN 5B36 VHVL geni, sırasıyla pET28a pozitif RABS APN ve pIRES2-zs Yeşil bir RABS APN rekombinant ekspresyon plazmidlerini oluşturmak için bir pET28a pozitif veya pIRES2-zs Yeşil bir vektöre bağlandı.Hem pET28a artı rekombinant antikorlar aminopeptidaz NBL21 hem de pIRES2-zs Green bir rekombinant antikorlar aminopeptidaz NCHO hücreleri tarafından eksprese edilen antikorlar saflaştırıldı ve ELISA ve IFA testleri kullanılarak analiz edildi. Bununla birlikte, sadece pIRES2-zs Green bir rekombinant antikorları aminopeptidaz NCHO hücrelerinin süpernatantında eksprese edilen antikor APN proteinini tanır. APN 5B36 monoklonal antikorlarının APN proteinlerine bağlanması, rekombinant antikorlardan daha erken bir dengeye ulaşmıştır.Süpernatanttaki monoklonal antikorların protein A agaroz kullanılarak saflaştırılması, doymuş amonyak sülfat çökeltmesi kullanmaktan daha iyidir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Karşı Monoklonal Antikorlar Pasif Yönetim H. capsulatum Ve Diğerleri Fungal Patojenler

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Tüp bebek Patojen Kaynaklı Nötrofil Trans-epitel Göçünü Değerlendirmek için Coculture Tahlili

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Swimbladder Enjeksiyon ile Larva Zebra balığı Mukozal Candidiazis Modelleme

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Ölümsüzleştirilmiştir Sıralama B hücrelerinden Rekombinant İnsan IgG Monoklonal Antikorlarının Üretimi

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Bir gen ya da ilaç terapisinde kullanım için, HIV-1 üretim yapan RNA&#39;lar etkinlik ve toksisite Değerlendirilmesi

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Hibridoma teknolojisi ile murin monoklonal antikorlar üretilmesi

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

Mukozal astar sıvı noninvaziv örnekleme için In Vivo üst solunum yolu bağışıklık arabulucu düzeyleri miktar

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Grip virüsü monoklonal antikorları nötralize kaçış türevleri üretimi

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Kanda dolaşan nadir antijen spesifik B hücreleri Discriminative insan monoklonal antikorların üretimi

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

Doğal ürünler karşı monoklonal antikorların üretimi

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...