Name: establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids
Uploaded: 2022-02-12T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids at JoVE.com

نشكر البروفيسور هانز ذكيز على التكرم بتوفير خطوط الخلية لإنتاج R-spondin1 المؤتلف. وقد دعم هذا العمل المنح المقدمة من البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2019YFA0111400)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31970779) إلى H.H.، ومجموعة أبحاث صناديق الشباب متعددة التخصصات والابتكار في جامعة شاندونغ (2020QNQT003) إلى H.H.

وقد وافقت لجنة رعاية الحيوان واستخدامه التابعة لكلية العلوم الطبية الاساسية بجامعة شاندونغ على جميع تجارب الفئران وتم تنفيذها وفقا للترخيص بموجب الخطوط العامة واللوائح الداخلية ( رقم 1000 / . ECSBMSSDU2019-2-079).
ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول بشكل رئيسي لزراعة الأجهزة العضوية ثلاثية...

<ol>
	<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 124-125 (2014).</li><li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+regenerative+medicine:+organogenesis+from+stem+cells+in+3D+culture.">Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Paola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+brain+organoids+reproducibly+form+cell+diversity+of+the+human+cerebral+cortex.">Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex.</a> Nature. 570, 523-527 (2019).</li><li>Atsuhiro, T., Ryuichi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-Order+Kidney+Organogenesis+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Higher-Order Kidney Organogenesis from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Wang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Expansion+of+Pancreatic+Islet+Organoids+from+Resident+Procr+++Progenitors.">Long-Term Expansion of Pancreatic Islet Organoids from Resident Procr + Progenitors.</a> Cell. 180 (6), 1198-1211 (2020).</li><li>Jarno, D., Hans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18, 407-418 (2018).</li><li>Hans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Forbes, S. J., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration-mechanisms+and+models+to+clinical+application.">Liver regeneration-mechanisms and models to clinical application.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13 (8), 473-485 (2016).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Expansion+of+Primary+Human+Hepatocytes+with+Efficient+Liver+Repopulation+Capacity.">In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 806-819 (2018).</li><li>Katsuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+Terminally+Committed+Hepatocytes+to+Culturable+Bipotent+Progenitor+Cells+with+Regenerative+Capacity.">Conversion of Terminally Committed Hepatocytes to Culturable Bipotent Progenitor Cells with Regenerative Capacity.</a> Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).</li><li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Expansion+of+Functional+Mouse+and+Human+Hepatocytes+as+3D+Organoids.">Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li><li>Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Cytokine+TNFalpha+Promotes+the+Long-Term+Expansion+of+Primary+Hepatocytes+in+3D+Culture.">Inflammatory Cytokine TNFalpha Promotes the Long-Term Expansion of Primary Hepatocytes in 3D Culture.</a> Cell. 175 (6), 1607-1619 (2018).</li><li>Xiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+maintenance+of+primary+human+hepatocytes+in+vitro.">Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro.</a> Science. 364 (6438), 399-402 (2019).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver.">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocol. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li></ol>

القدرة على زراعة خلايا الكبد الناضجة على مدى فترات طويلة أمر أساسي في دراسة العلوم الأساسية للكبد، وعلم السموم المخدرات والتهابات الميكروبيولوجيا المضيفة الهباتوتروبية مثل الملاريا وفيروسات التهاب الكبد. مع مكانة محددة جيدا ، يضع البروتوكول هنا نظاما ثقافة للخلايا الكبدية. يدفع هذا ال?...

الأجهزة العضوية هي ذاتية التنظيم وثلاثية الأبعاد (3D) في مجموعات المختبر التي تشمل الخلايا الجذعية ذاتية التجديد والخلايا المتباينة متعددة النسب1,2. تم إنشاء الأعضاء العضوية للعديد من الأعضاء إما من خلايا جذعية متعددة القدرات أو بالغة من خلال عوامل متخصصة محددة جيدا بما في ذلك الأمعاء والدماغ والقولون والكلى والكبد والبنكرياس والغدة الدرقية والمعدة والجلد والرئة3،4،5،6،7 . تقوم الأجهزة العضوية بتلخيص وظائف الخلايا الفيزيائية عن طريق محاكاة التطور (الناشئ عن الخلايا الجذعية الجنينية أو المستحثة متعددة القدرات ، PSCs) أو تطور التوازن / التجديد (نشأت من الخلايا الجذعية البالغة ، ASCs) ، مما يفتح آفاقا جديدة في أبحاث الأمراض والعلاج 8،9.
كأكبر عضو في الثدييات ، فإن الكبد مسؤول بشكل رئيسي عن التخزين والتمثيل الغذائي وإزالة السموم. نوعين من أنواع الخلايا الظهارية، خلايا الكبد وcholeangiocytes، وبناء الوحدة الأساسية لفصيص الكبد. خلايا الكبد هي المسؤولة عن 70-80٪ من وظائف الكبد10. على الرغم من أن الكبد لديه قدرة تجديد ملحوظة ، إلا أن الخسارة السريعة لميزات الخلايا الكبدية تحدث أثناء زراعة أحادية الطبقة التقليدية عن طريق استقطاب الخلايا غير التنظيمية والتمايز ، مما يزيد من حاجة الباحثين والأطباء لبناء نماذج الكبد "لسد الفجوة" في الطبق. ومع ذلك ، حتى وقت قريب لم تكن نماذج توسع الجسم الحي السابق من خلايا الكبد الأولية راسخة 11،12،13،14،15. يمكن إنشاء أعضاء الكبد من الخلايا الجذعية الجنينية / المستحثة متعددة القدرات ، وتحويل الخلايا الليفية إلى خلايا تشبه خلايا الكبد ، والخلايا المشتقة من الأنسجة. تطوير organoids الكبد يعزز تطبيق نموذج في المختبر لشاشات المخدرات وسمية الكبد المقايسات16,17.
هنا، ونحن نصف بروتوكول مفصل لإنشاء organoids الكبد من خلايا الكبد مورين الأولية. باستخدام هذا البروتوكول، وضعنا نظام ثقافة في المختبر من organoids الكبدية مع اثنين من perfusions من الكولاجيناز. يمكن تمرير هذه الأجهزة العضوية للتوسع على المدى الطويل لعدة أشهر. وظيفتها الفسيولوجية تتفق إلى حد كبير مع خلايا الكبد. علاوة على ذلك، نقدم أيضا وصفا مفصلا لكيفية إجراء التلاعب الجيني، مثل عدوى الفيروس العدسي، ونقل سيرنا، والهندسة CRISPR-Cas9 باستخدام الأجهزة العضوية. انتشار الخلايا الكبدية organoids تسليط الضوء على إمكانية استخدام organoids لفهم بيولوجيا الكبد وتطوير نهج الطب الشخصية والترجمة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Perfusion Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A600077-0100</td>
			<td>3.50 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100188-0500</td>
			<td>9.00 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100395-0500</td>
			<td>4.00 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>1.51 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501218-0001</td>
			<td>80.0 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A610404-0500</td>
			<td>0.78 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A500873-0500</td>
			<td>3.50 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100882-0025</td>
			<td>0.06 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501330-0005</td>
			<td>0.50 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1639</td>
			<td>0.10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>C621110-0010</td>
			<td>23.80 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100395-0500</td>
			<td>4.00 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>1.51 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501218-0001</td>
			<td>80.0 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A610404-0500</td>
			<td>0.78 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A500873-0500</td>
			<td>3.50 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip-wash Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10091148</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C14190500BT0</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>&#160;A600135-0025</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>Stock concentration 500 &#181;M, final 
			concentration 2 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement 50x, minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1704-044</td>
			<td>50 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chir 99021</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td>Stock concentration 30 mM, final 
			concentration 3 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330032</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin I</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3006</td>
			<td>Stock concentration 100 mM, final 
			concentration 10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel martix</td>
			<td>BD</td>
			<td>356231</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Stock concentration 500 mM, final 
			concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nictinamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>&#160;A600135-0025</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml,final concentration 50 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human HGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 25 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TGF-&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-16A</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-&#945;</td>
			<td>Origene</td>
			<td>TP750007-1000</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho kinase inhibitor Y-27632</td>
			<td>Abmole Bioscience</td>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspondin-1conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPT01RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 # silicone tube</td>
			<td>LangerPump</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well, suspension</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>GN662102-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C Water Bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m filter</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>stemcell</td>
			<td>AT-104</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CTNNB1</td>
			<td>BD</td>
			<td>610154</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH</td>
			<td>CST</td>
			<td>5174S</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HDAC7</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab50212</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KI67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15580</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>542700097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>AC2-4S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>&#160;A100231</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Color Imaging Systems</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AME4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hdac3 siRNA</td>
			<td>Guangzhou RiboBio Co., Ltd.</td>
			<td>siG2003180909192555</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hdac7 lentivirus</td>
			<td>ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd</td>
			<td>LV2020-2364</td>
			<td>stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitrans G A</td>
			<td>Shanghai Genechem Co.,Ltd.</td>
			<td>REVG004</td>
			<td>Increased virus infection efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Pro Plus software</td>
			<td>Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>version 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778150</td>
			<td>Increased virus infection efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live cell dye</td>
			<td>Luna</td>
			<td>F23001</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-speed desktop centrifuge</td>
			<td>cence</td>
			<td>TD5A-WS/TD5AWS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofactor-&#945; 2b Device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>F621006-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>LangerPump</td>
			<td>BT100-2J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Activate with methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX458</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>48138</td>
			<td>stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific Heraeus</td>
			<td>Labofuge 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSL3</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-100218A</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 4 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibico</td>
			<td>25200072</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wee1 siRNA</td>
			<td>Guangzhou RiboBio Co., Ltd.</td>
			<td>siG2003180909205971</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids

الكبد هو أكبر عضو في الثدييات. وهو يلعب دورا هاما في تخزين الجلوكوز، إفراز البروتين، والتمثيل الغذائي وإزالة السموم. كمنفذ لمعظم وظائف الكبد، خلايا الكبد الأولية لديها قدرة محدودة على الانتشار. وهذا يتطلب إنشاء نماذج التوسع في خلايا الكبد في الجسم الحي السابق للبحوث الفسيولوجية والمرضية الكبد. هنا، قمنا بعزل خلايا الكبد المورين بخطوتين من التشوش الكولاجيني وأنشأنا ثقافة عضوية ثلاثية الأبعاد ك "الكبد المصغر" لتلخيص التفاعلات بين الخلايا الخلوية والوظائف الفيزيائية. تتكون الأجهزة العضوية من مجموعات خلايا غير متجانسة بما في ذلك السلف والخلايا الكبدية الناضجة. نحن نقدم هذه العملية بالتفصيل لعزل وثقافة خلايا الكبد مورين أو خلايا الكبد الجنينية لتشكيل organoids في غضون 2-3 أسابيع وتبين كيفية تمريرها عن طريق الأنابيب ميكانيكيا صعودا وهبوطا. وبالإضافة إلى ذلك، سوف نقدم أيضا كيفية هضم organoids في خلايا واحدة لعدوى الفيروس العدسي من shRNA / البناء خارج الرحم، سيرنا transfection و CRISPR-Cas9 الهندسة. يمكن استخدام الأجهزة العضوية لشاشات الأدوية ونمذجة الأمراض وأبحاث الكبد الأساسية من خلال نمذجة بيولوجيا الكبد وعلم الأحياء المرضية.

الأجهزة الكبدية من أنثى Alb-Cre; وقد لوحظ فأر Rosa26-GFP (8 أسابيع) بعد خمسة أيام من البذر (الشكل 1A). وتنتشر الأجهزة العضوية مع تلطيخ إيجابي Ki67 (الشكل 1B). التدخل في التعبير عن الجينات التمثيلية في organoids خلايا الكبد إما عن طريق العدوى سيرنا أو عدوى الفيروس العدسي تم فحصه?...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids at JoVE.com

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

تم إنشاء نظام ثقافة عضوية ثلاثية الأبعاد سابقة طويلة الأجل من خلايا الكبد الماوس. يمكن تمرير هذه organoids والتلاعب بها وراثيا عن طريق عدوى الفيروس العدسي من بناء shRNA / خارج الرحم ، انتقال الحمض النووي الريبي والهندسة CRISPR-Cas9.

إنشاء والتلاعب الجيني من الأورجانويدات مورين الكبدية

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

الكبد هو أكبر عضو في الثدييات. يلعب دورا هاما جدا في عملية التمثيل الغذائي وإزالة السموم. على الرغم من أن الكبد لديه قدرات تجديد ملحوظة في المختبر، فإنه لا يزال تحديا كبيرا جدا على المدى الطويل لثقافة الكبد في المختبر.هنا، ونحن إنشاء الخلايا الكبدية organoids من خلايا الكبد ناضجة. فإنه يحتفظ السمات الرئيسية للخلايا الكبدية في مورفولوجيا ووظيفة. في هذا الفيديو، سوف نقدم كيفية زراعة وتمرير هذه organoids وكيفية إجراء التعديل الوراثي لهذه organoids في التفاصيل.أولا، تغلغل الكبد والهضم. إعداد جميع المناطق والأدوات وجعلها عقيمة. غسل الماوس وفتح البشرة والجلد، ومن ثم محاولة العثور على فرن الحقيبة من الكبد.حقن الإبر في ذلك، ومن ثم التقاط هذا. القيام التشوه بسرعة خمسة ملليلتر في الدقيقة الواحدة، حتى يصبح الكبد شاحب. تغييرها إلى المخزن المؤقت للتشويش، ضع بعناية، ومشاهدة الكبد، حتى يصبح لينة.عادة ما يستغرق الأمر من ثلاث إلى خمس دقائق، ثم يقطع الكبد ويضعه في الصفائح، ويقطع إلى قطع صغيرة بالمقص. بيب صعودا وهبوطا في كثير من الأحيان. عادة، يستغرق 10 إلى 15 دقيقة لجعلها في خلية واحدة.ومن ثم بيب صعودا وهبوطا مع 10 إلى 15 دقيقة وإطعامهم من خلال صالح. جعلها في خلايا واحدة. جمع جميع الخلايا في أنبوب 50 ملليلتر، والطرد المركزي لهم، مع السرعة ومن ثم جمع كل لوحات.حاول أن تبقيهم دائما في الجليد البارد جعل تعليق خلية واحدة والعد لهم مع عداد الخلية. عادة ما تكون خلايا الكبد إذا سعيدة، فقد الفلورسنت حية.الجزء الثاني، ونحن نحاول الجلوس الخلايا والقيام ثقافة organoid. نجمع كل تعليق الخلايا ونحسب الخلايا مع إندماج محاري معين ومن ثم نخلط (ميتروجلز) و وسط التعليمات البرمجية.عادة ما نأخذ، مع المتوسطة وmetrogels، في نسبة 1 إلى 2 أو 1 إلى 3. بعد خلط بعناية لهم، ونحن نجلس لهم على لوحات التدرج. عادة ما نضيف 100 ميكرولتر في 24 لوحة جيدا.وضعها في الحاضنة في درجة حرارة 37 درجة. بعد 20 دقيقة، وضعناها عكس إلى الأمام مع أسفل في الجزء السفلي ومن ثم في الوسط. مع يومين أو ثلاثة أيام مضادة، ونحن عادة ما نرى organoids يخرج.هذه هي الصورة النموذجية للأعضاء لدينا. نحن عادة بحاجة إلى خلايا واحدة من organoids إذا كنا نريد أن نفعل مرور أو القيام ببعض طريقة التعديل الجيني نجمع جميع organoids من لوحات مضادة مع العازلة غسل معطف. نسقط الناطقة، ثم في مخزن غسيل المعطف في الطبق، نخلطها، لذا نهزها صعودا وهبوطا.ومن ثم نحن عادة ما قبل غسل جميع النصائح مع المخزن المؤقت للأشرطة غسل. لتجنب كل تلميح organoids على نصائح. وبعد ذلك مع، دفعة جديدة على الجليد أو بدونه، نجمع كل الأجهزة العضوية عن طريق الانصهار المركزي.نعالجهم، هناك أشعة الخداع لإزالة جميع ال المتروجيل. بعد 20 إلى 30 دقيقة من الحضانة على الجليد تتم إزالة جميع المتروجيلات. نحن جمع جميع organoids نظيفة وإضافة تريبسين لجعلها في خلايا واحدة.بعد إضافة التريبسين ، نعالج الأعضاء العضوية في الحاضنة. يستغرق 5 إلى 10 دقائق لالأعضاء الكبد لتصبح خلايا واحدة. نضيف المزيد من مخازن الغسيل لوقف تريبلاتين.ومن ثم حماسه صعودا وهبوطا نحوهم. لعملية الخيار، يمكنك غسلها مرة أخرى لإزالة كل تريبسين. بعد غسلها عن طريق ال سنتروفوسيون، يمكننا عدها تحت عداد الخلية.ثم سوف نظهر كيفية القيام بالمعاملات أو العدوى من هذه الخلايا الكبدية organoids. أولا، قم بتسمية أنابيب ما ستفعله، ثم سنقوم بتعصير البصر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تحتاج، الوصي على حقيقة ليبويل ترويض INI MaX.نضيف. السيطرة والجينات محددة siRNA، واحتضان لهم مع الأمثل، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ومن ثم وفقا لتركيز الخلية نضيف الحد الأقصى RAN ومزجها جيدا.ثم نضيف أيضا الحد الأقصى RAN مع الأمثل بشكل منفصل ووضعها على الجليد. بعد 5 دقائق، ونحن بيب حتى منفصلة RAN ماكس خليط مع siRNAs مختلفة، جين محدد RANi والتحكم الثاني بشكل منفصل ومزجها بدقة. وضعها على الجليد مرة أخرى، ومن ثم نجمع كل organoids، والقنطور بطيئة، وإسقاط كل supernatant، نضيف ماكس RNAI، خليط سيرنا في هذه اللوحة الخلية وبيب عليه صعودا وهبوطا بدقة.لفترة وجيزة، كانت الخلايا وتسمية RNAI ماكس وخليط سيرنا التحسين واحتضان لمدة 4 إلى 5 ساعات في 37 درجة. الجزء الأخير، هذه الخلايا الكبدية organoids يمكن أيضا أن تكون مصابة بفيروس لينتي. تم تنفيذ رسالة مماثلة كما نقل سيرنا.تم إعداد أنابيب التحكم وفيروس siRNA بشكل جيد ، وتم إضافة الأمثل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ثم مع مناطق العدوى مثل بولي الأخضر ومن ثم نضيف فيروس لينتي مختلفة، وفقا لدستور تعليمات الشركة المصنعة. الجمع بين تعليق خلية واحدة في ثقافة organoids والجسيمات المختلفة في أنابيب eppendorf 1.5 ملليلتر، إضافة، حسنا، مزيج منهم لوحة هذا الخليط، وتركيزها لمدة 1 ساعة في 32 درجة.سيتم إجراء الانصهار التركيز في 500 G.And بعد 4 إلى 5 ساعات حضانة في 37 درجة تعليق الخلية ثم سيتم جمعها والجلوس في المتروجيل. ووضعها في الحاضنة مرة أخرى. الجهاز على كفاءة تشكيل أو تحليل وظيفي آخر يمكن أن يؤديها 7 إلى 10 أيام في وقت لاحق.وهنا نتائجنا التمثيلية. في الشكل 1A، هل يمكن أن نرى لدينا ALB-Cre Rosa 26-GFP أو الخلايا الكبدية RFP organoid من الماوس. في الشكل 1B يمكنك أن ترى إشارة إيجابية Ki67 في تلطيخ، والتي أظهرت أن لدينا organoids خلايا الكبد تتكاثر.في الشكل 2A و 2B هنا هو تعبير جيني تمثيلي عن تعبيرنا التدخلي لجيناتنا. بعد التلاعب الجيني في الخلايا الكبدية organoids ، فإن التدخل الفعال فعال للغاية. هنا الشكل 2C، هل يمكن أن نرى بعد التلاعب الجيني مع التكنولوجيا كارسونيت في organoids مورين لدينا.الاستنتاج، أظهرت نتائجنا أن الخلايا الكبدية العضوية يمكن توسيعها في المختبر والتلاعب بها وراثيا. باختصار، في هذا الفيديو نعرض كيفية القيام بتشوه الكبد والهضم للحصول على خلايا الكبد. كيفية التقاط خلايا الكبد والمرور organoids خلايا الكبد.أيضا، أظهرنا كيفية القيام سيرنا وناقل العدوى أو عدوى فيروس ليندي للقيام بتعديل الوراثية من هذه organoids. أيضا، لدينا نقصان في الأعضاء لدينا. أولا، لم نستخدم كل نواة أو نواة فرو لتنقية خلايا الكبد.وثانيا أعتقد أن المزيد من عوامل النمو والإشارات يجب أن تحاول تحسين الوقت المتزايد organoids.

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

طريقة لثقافة الفرخ المبكر فيفو السابقين الأجنة (الثقافة الجديدة)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

الجامعة جبل مزدوجة في الموقع التهجين لافراخ الدجاج في وقت مبكر

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

العزلة والتلاعب الجيني لأمراض القلب للبالغين Myocytes التصوير متحد البؤر

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Electroporation لل، عزل والتصوير من Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation

بروتوكول محسن فعال من حيث الوقت والعمل لعزل خلايا الكبد الأولية للماوس

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on ...

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

تحليل الإجهاد التأكسدي في المواد العضوية المعوية الفئرانية باستخدام مسبار الفلوروجينيك الحساس لأنواع الأكسجين التفاعلية

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

The Establishment of a Murine Mandibular Molar Extraction Socket Healing Model

إنشاء نموذج شفاء تجويف استخراج ضرس الفك السفلي

This study introduces the development of a molar extraction model in the murine mandible to provide a practicable model for studying alveolar bone ...

Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids

إنشاء وصيانة وتمايز والتلاعب الجيني وزرع عضويات الغدة الدمعية البشرية والفأر

The lacrimal gland is an essential organ for ocular surface homeostasis. By producing the aqueous part of the tear film, it protects the eye from ...

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

إكس فيفو التوسع والتلاعب الجيني للخلايا الجذعية المكونة للدم في الفئران في الثقافات القائمة على كحول البولي فينيل

Self-renewing&#160;multipotent&#160;hematopoietic stem cells (HSCs) are an important cell type due to their abilities to support hematopoiesis throughout ...

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

ثقافة الخنازير المعوية 3D العضوية من الخبايا الظهارية المحفوظة بالتبريد وإنشاء أحاديات الخلية

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...