Name: establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids
Uploaded: 2022-02-12T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids at JoVE.com

Vi takker professor Hans Clevers for venligt at give cellelinjer til at producere rekombinant R-spondin1. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Key R &D Program of China (2019YFA01111400), National Natural Science Foundation of China (31970779) til H.H., og Fondene for Ungdomsinterdisciplinær og Innovation Research Group of Shandong University (2020QNQT003) til H.H.

Alle mus eksperimenter blev godkendt af Animal Care and Use Committee af School of Basic Medical Sciences på Shandong University og blev udført i henhold til licensen i henhold til Home Office retningslinjer og regler (Nr. ECSBMSSDU2019-2-079).
BEMÆRK: Denne protokol bruges hovedsageligt til at dyrke 3D-organoider fra isolerede primære hepatocytter.
1. Etablering af Murine Hepatocyte Organoid Kultur
BEMÆRK: Ekstracellulære matrix sås...

<ol>
	<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 124-125 (2014).</li><li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+regenerative+medicine:+organogenesis+from+stem+cells+in+3D+culture.">Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Paola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+brain+organoids+reproducibly+form+cell+diversity+of+the+human+cerebral+cortex.">Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex.</a> Nature. 570, 523-527 (2019).</li><li>Atsuhiro, T., Ryuichi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-Order+Kidney+Organogenesis+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Higher-Order Kidney Organogenesis from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Wang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Expansion+of+Pancreatic+Islet+Organoids+from+Resident+Procr+++Progenitors.">Long-Term Expansion of Pancreatic Islet Organoids from Resident Procr + Progenitors.</a> Cell. 180 (6), 1198-1211 (2020).</li><li>Jarno, D., Hans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18, 407-418 (2018).</li><li>Hans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Forbes, S. J., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration-mechanisms+and+models+to+clinical+application.">Liver regeneration-mechanisms and models to clinical application.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13 (8), 473-485 (2016).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Expansion+of+Primary+Human+Hepatocytes+with+Efficient+Liver+Repopulation+Capacity.">In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 806-819 (2018).</li><li>Katsuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+Terminally+Committed+Hepatocytes+to+Culturable+Bipotent+Progenitor+Cells+with+Regenerative+Capacity.">Conversion of Terminally Committed Hepatocytes to Culturable Bipotent Progenitor Cells with Regenerative Capacity.</a> Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).</li><li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Expansion+of+Functional+Mouse+and+Human+Hepatocytes+as+3D+Organoids.">Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li><li>Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Cytokine+TNFalpha+Promotes+the+Long-Term+Expansion+of+Primary+Hepatocytes+in+3D+Culture.">Inflammatory Cytokine TNFalpha Promotes the Long-Term Expansion of Primary Hepatocytes in 3D Culture.</a> Cell. 175 (6), 1607-1619 (2018).</li><li>Xiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+maintenance+of+primary+human+hepatocytes+in+vitro.">Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro.</a> Science. 364 (6438), 399-402 (2019).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver.">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocol. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li></ol>

Evnen til at kultur modne hepatocytter over lange perioder er grundlæggende i at studere lever grundlæggende videnskab, narkotika toksikologi og hepatotropiske host-mikrobiologi infektioner såsom malaria og hepatitis virus. Med en veldefineret niche opretter protokollen her et kultursystem for hepatocytter. Denne protokol driver modne hepatocytter til at udvide i 3D-kultur med en heterogenitet, der opsummerer celle-celle interaktion, de fleste hepatocyt funktion og genetiske modifikationer, så design af genfunktion u...

Organoider er selvorganiserede, tredimensionelle (3D) in vitro-klynger, der omfatter selvfornyende stamceller og differentierede celler med flere slægter1,2. Organoiderne i mange organer er blevet etableret enten fra pluripotente eller voksne stamceller ved veldefinerede nichefaktorer, herunder tarmen, hjernen, tyktarmen, nyrerne, leveren, bugspytkirtlen, skjoldbruskkirtlen, maven, huden og lungen3,4,5,6,7 . Organoiderne generobrer fysiske cellefunktioner ved at efterligne enten udvikling (stammer fra embryonale eller inducerede pluripotente stamceller, PSC'er) eller homøostase / regenerering progression (stammer fra voksne stamceller, ASCs), som åbner nye veje i sygdomsforskning og terapi8,9.
Som det største organ hos pattedyr er leveren primært ansvarlig for opbevaring, metabolisme og afgiftning. To slags epitelcelletyper, hepatocytter og cholangiocytter, konstruere den grundlæggende enhed af en leverlobule. Hepatocytter er ansvarlige for 70-80% af leverfunktionen10. Selv om leveren har bemærkelsesværdig regenerering kapacitet, hurtigt tab af hepatocyt funktioner sker under traditionelle monolayer dyrkning af dysreguleret celle polarisering og dedifferentiation, hvilket øger behovet for forskere og klinikere til at opbygge 'gap-bridging' lever modeller i en skål. Indtil for nylig havde ex vivo-ekspansionsmodellerne fra primære hepatocytter imidlertid ikke været veletablerede11,12,13,14,15. Leverorganoider kan etableres fra embryonale / inducerede pluripotente stamceller, fibroblast konvertering til hepatocyt-lignende celler, og væv-afledte celler. Udviklingen af leverorganoider øger anvendelsen af en in vitro-model til lægemiddelskærme og levertoksicitetsanalyser16,17.
Her beskriver vi en detaljeret protokol til etablering af leverorganoider fra murin primære hepatocytter. Ved at bruge denne protokol, vi oprettet en in vitro kultur system af hepatocyt organoider med to perfusioner af kollagenase. Disse organoider kan passeres for langsigtet ekspansion i flere måneder. Deres fysiologiske funktion er meget i overensstemmelse med hepatocytter. Derudover giver vi også en detaljeret beskrivelse af, hvordan man udfører genmanipulation, såsom lentivirusinfektion, siRNA transduktion og CRISPR-Cas9-teknik ved hjælp af organoider. Udbredelsen af hepatocytorganoider kaster lys over muligheden for at bruge organoider til at forstå leverbiologi og udvikle personlige og translationelle medicintilgange.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Perfusion Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A600077-0100</td>
			<td>3.50 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100188-0500</td>
			<td>9.00 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100395-0500</td>
			<td>4.00 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>1.51 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501218-0001</td>
			<td>80.0 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A610404-0500</td>
			<td>0.78 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A500873-0500</td>
			<td>3.50 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100882-0025</td>
			<td>0.06 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501330-0005</td>
			<td>0.50 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1639</td>
			<td>0.10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>C621110-0010</td>
			<td>23.80 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100395-0500</td>
			<td>4.00 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>1.51 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501218-0001</td>
			<td>80.0 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A610404-0500</td>
			<td>0.78 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A500873-0500</td>
			<td>3.50 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip-wash Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10091148</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C14190500BT0</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>&#160;A600135-0025</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>Stock concentration 500 &#181;M, final 
			concentration 2 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement 50x, minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1704-044</td>
			<td>50 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chir 99021</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td>Stock concentration 30 mM, final 
			concentration 3 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330032</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin I</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3006</td>
			<td>Stock concentration 100 mM, final 
			concentration 10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel martix</td>
			<td>BD</td>
			<td>356231</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Stock concentration 500 mM, final 
			concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nictinamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>&#160;A600135-0025</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml,final concentration 50 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human HGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 25 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TGF-&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-16A</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-&#945;</td>
			<td>Origene</td>
			<td>TP750007-1000</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho kinase inhibitor Y-27632</td>
			<td>Abmole Bioscience</td>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspondin-1conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPT01RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 # silicone tube</td>
			<td>LangerPump</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well, suspension</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>GN662102-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C Water Bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m filter</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>stemcell</td>
			<td>AT-104</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CTNNB1</td>
			<td>BD</td>
			<td>610154</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH</td>
			<td>CST</td>
			<td>5174S</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HDAC7</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab50212</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KI67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15580</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>542700097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>AC2-4S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>&#160;A100231</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Color Imaging Systems</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AME4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hdac3 siRNA</td>
			<td>Guangzhou RiboBio Co., Ltd.</td>
			<td>siG2003180909192555</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hdac7 lentivirus</td>
			<td>ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd</td>
			<td>LV2020-2364</td>
			<td>stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitrans G A</td>
			<td>Shanghai Genechem Co.,Ltd.</td>
			<td>REVG004</td>
			<td>Increased virus infection efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Pro Plus software</td>
			<td>Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>version 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778150</td>
			<td>Increased virus infection efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live cell dye</td>
			<td>Luna</td>
			<td>F23001</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-speed desktop centrifuge</td>
			<td>cence</td>
			<td>TD5A-WS/TD5AWS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofactor-&#945; 2b Device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>F621006-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>LangerPump</td>
			<td>BT100-2J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Activate with methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX458</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>48138</td>
			<td>stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific Heraeus</td>
			<td>Labofuge 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSL3</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-100218A</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 4 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibico</td>
			<td>25200072</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wee1 siRNA</td>
			<td>Guangzhou RiboBio Co., Ltd.</td>
			<td>siG2003180909205971</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids

Leveren er det største organ hos pattedyr. Det spiller en vigtig rolle i glukoseopbevaring, proteinsekretion, metabolisme og afgiftning. Som eksekutor for de fleste af leveren funktioner, primære hepatocytter har begrænset voksende kapacitet. Dette kræver, at der oprettes ex vivo hepatocyt ekspansion modeller for lever fysiologisk og patologisk forskning. Her isolerede vi murine hepatocytter med to trin af kollagenaseperfusion og etablerede en 3D-organoidkultur som 'minilever' for at generogulere cellecelleinteraktioner og fysiske funktioner. Organoiderne består af heterogene cellepopulationer, herunder forfædre og modne hepatocytter. Vi introducerer processen i detaljeret at isolere og kultur murine hepatocytter eller foster hepatocyt at danne organoider inden for 2-3 uger og vise, hvordan man passage dem ved mekanisk pipetter op og ned. Derudover vil vi også introducere, hvordan man fordøjer organoiderne i enkeltceller til lentivirusinfektion af shRNA / ektopisk konstruktion, siRNA transfection og CRISPR-Cas9 engineering. Organoiderne kan bruges til lægemiddelskærme, sygdomsmodellering og grundlæggende leverforskning ved at modellere leverbiologi og patobiologi.

Hepatocyt organoider fra kvindelige Alb-Cre; Rosa26-GFP mus (8 uger) blev observeret fem dage efter såning (Figur 1A). Organoiderne breder sig med Ki67 positiv farvning (figur 1B). Interfererende udtryk for repræsentative gener i hepatocytorganoider enten ved siRNA transinfektion eller lentivirusinfektion blev undersøgt af qRT-PCR og western blot. Resultaterne er vist i figur 2A og 2B. Figur ...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids at JoVE.com

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

Et langsigtet ex vitro 3D organoid kultursystem blev etableret fra musehæpatocytter. Disse organoider kan passage og genetisk manipuleres ved lentivirus infektion af shRNA / ektopisk konstruktion, siRNA transfection og CRISPR-Cas9 engineering.

Etablering og genmanipulation af Murine Hepatocyte organoider

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

Leveren er det største organ hos pattedyr. Det spiller en meget vigtig rolle i stofskiftet og afgiftning. Selv om leveren har en bemærkelsesværdig regenerering kapacitet in vitro, det er stadig en meget stor udfordring for en langsigtet til kultur hepatocyte in-vitro.Her etablerer vi hepatocytterne organoider fra modne hepatocytter. Det holder hovedtræk ved hepatocytter i morfologi og funktion. I denne video vil vi introducere, hvordan man kultur og passage disse organoider og hvordan man udfører den genetiske modifikation af disse organoider i detaljer.Først leverperfusion og fordøjelse. Forbered alle regioner og instrumenter og gør dem sterile. Vask musen og åbne epidermal og huden, og derefter forsøge at finde posen ovnen af leveren.Indsprøjt nålene i det, og derefter fange dette. Gør perfusion med en hastighed på fem milliliter i minuttet, indtil leveren bliver bleg. Skift dem i perfusionsbufferen, læg forsigtigt, pas på leveren, indtil den bliver blød.Normalt tager det tre til fem minutter, Skær derefter leveren og læg dem i pladerne, og skær dem i små stykker med saksen. Pep det op og ned ofte. Normalt tager det 10 til 15 minutter at gøre dem til den enkelte celle.Og så pep det op og ned med 10 til 15 minutter og fodre dem gennem montøren. Gør dem til de enkelte celler. Saml alle cellerne i 50 milliliter rør, og centrifuge dem, med hastigheden og derefter indsamle alle de per plader.Prøv at holde dem altid i den kolde is. Lav enkeltcelleaffjedringerne, og tæl dem med celletælleren. Normalt hepatocytes hvis glade, det har den livlige fluorescerende.Den anden del forsøger vi at sidde cellerne og gøre organoidkulturen. Vi samler alle cellerne suspensioner, og tælle cellerne med en vis concentro-fusion og så blander vi. Metrogels. og kodemediet.Normalt tager vi, mediet og metrogels, i forholdet mellem 1 og 2 eller 1 til 3. Efter omhyggeligt at have blandet dem, sidder vi dem på gradientpladerne. Vi plejer at tilføje 100 mikroliter på 24 plade godt.Sæt dem i inkubatoren ved temperaturen på 37 grader. Efter 20 minutter sætter vi dem tilbage med bunden i bunden og derefter på mediet. Med to eller tre dages modning ser vi normalt organoiderne komme ud.Dette er det typiske billede af vores organoider. Vi har normalt brug for enkelte celler fra organoider, hvis vi vil gøre passagen eller lave en genetisk modifikationsmetode Vi samler alle organoiderne fra tællerpladerne med frakkevaskbufferen. Vi taber supernatanten, så ved frakkevaskbufferen i pladen, bland dem, så pep det op og ned.Og så vasker vi normalt alle spidserne med vaskebåndsbufferen. For at undgå, at alle organoider tipper på spidserne. Og så med, et nyt parti på is eller uden det, samler vi alle organoider ved centro-fusion.Hvis vi behandler dem, er der en conning radients at fjerne alle metrogels. Efter 20 til 30 minutters inkubation på is fjernes alle metrogels. Vi samler alle de rene organoider og tilføjer trypsin for at gøre dem til enkelte celler.Efter trypsin er tilsat, behandler vi organoiderne i inkubatoren. Det tager 5 til 10 minutter for leverorganoider at blive enkeltceller. Vi tilføjer flere vaskebuffere for at stoppe triplatin.Og så pep det op og ned mod dem. For option proces, kan du vaske dem endnu en gang for at fjerne alle trypsin. Efter vask ved centrofusion kan vi tælle dem under celletælleren.Så vil vi vise, hvordan man gør transaktion eller transfection af disse hepatocytter organoider. Først mærke rørene af, hvad du vil gøre, og så vil vi gøre synet transfection i henhold til producentens anvisninger. Du har brug for, regenten af lipoyl faktum tæmme INI MaX.Vi tilføjer. kontrol og det specifikke gen siRNA, og inkuberer dem med det optimale, i henhold til producentens anvisninger. Og så i henhold til cellekoncentrationen tilføjer vi RAN max og blander dem grundigt.Derefter tilføjer vi også RAN max med det optimale separat og læg dem på is. Efter 5 minutter, vi pep op separate RAN max blanding med forskellige siRNAs, Specifikke gen RANi og II kontrol separat og blande dem grundigt. Sæt dem på is igen, og så samler vi alle organoider, langsomt centrofusion, drop alt supernatanten, vi tilføjer RNAi max, siRNA-blandingen i denne celleplade og pep den op og ned grundigt.Kort sagt blev cellerne og etiketten RNAi max og siRNA-blandingen gentrificering og inkuberede i 4 til 5 timer ved 37 grader. Sidste del, disse hepatocytter organoider kunne også være inficeret med Lenti virus. Den lignende meddelelse blev udført som siRNA transfection.Kontrollen og siRNA virusrørene var velforberedte, og det optimale blev tilføjet i henhold til producentens anvisninger. Så med infektionen regioner som poly grøn og så tilføjer vi forskellige Lenti virus, i henhold til producentens anvisninger forfatning. Kombiner enkeltcelleaffjedringerne i organoider kultur og forskellige partikler i 1,5 milliliter eppendorf rør, Tilsæt, godt, bland dem Plade denne blanding, og koncentrere dem i 1 time ved 32 grader.Koncentratfusionen vil blive udført ved 500 G.Og efter 4 til 5 timers inkubation ved 37 grader vil celleaffjedringen derefter blive indsamlet og siddende i metrogel. Og læg dem i inkubatoren igen. Orgelet på formationseffektiviteten eller anden funktionel analyse kunne udføres 7 til 10 dage senere.Her er vores repræsentative resultater. I figur 1A, kunne du se vores ALB-Cre Rosa 26-GFP eller RFP hepatocytter organoid fra musen. I figur 1B kunne man se Ki67-signalet i farvning, som har vist, at vores hepatocytter organoider breder sig.I figur 2A og 2B her er et repræsentativt genekspression af vores forstyrrende udtryk for vores gener. Efter genetisk manipulation i hepatocytter organoider er interferensen effektiv meget effektiv. Her er figur 2C, du kunne se efter genmanipulation med karsonit teknologi i vores murine organoider.Konklusion, vores resultater viste hepatocytter organoider kunne udvides in vitro og genetisk manipuleret. Sammenfattende viser vi i denne video, hvordan man gør leveren perfusion og fordøjelse for at få hepatocytterne. Hvordan man fanger hepatocytterne og passage hepatocytter organoider.Vi viste også, hvordan man gør siRNA og vektor transfection eller Lenti virus infektion til at gøre modifikationen af den genetiske af disse organoider. Vi har også to mangler i vores organoider. For det første brugte vi ikke per kerne eller pelskerne til at rense hepatocytterne.Og for det andet tror jeg, at flere vækstfaktorer og signalering bør forsøgt at forbedre organoidernes væksttid.

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Elektroporation, Isolering og Imaging af -myofibre

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation

En forbedret tids- og arbejdseffektiv protokol til musens primære hepatocytisolering

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on ...

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

Analyse af oxidativ stress i murintarmorganoider ved hjælp af reaktiv iltartsfølsom fluorogen sonde

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

The Establishment of a Murine Mandibular Molar Extraction Socket Healing Model

Etablering af en murine mandibular molær ekstraktionssocket healing model

This study introduces the development of a molar extraction model in the murine mandible to provide a practicable model for studying alveolar bone ...

Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids

Etablering, vedligeholdelse, differentiering, genetisk manipulation og transplantation af mus- og humane tårekirtelorganoider

The lacrimal gland is an essential organ for ocular surface homeostasis. By producing the aqueous part of the tear film, it protects the eye from ...

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Ex vivo Udvidelse og genetisk manipulation af hæmatopoietiske stamceller fra mus i polyvinylalkoholbaserede kulturer

Self-renewing&#160;multipotent&#160;hematopoietic stem cells (HSCs) are an important cell type due to their abilities to support hematopoiesis throughout ...

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

Kultur af pattegrise Intestinal 3D organoider fra kryopræserverede epitelkrypter og etablering af cellemonolag

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...