Name: establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids
Uploaded: 2022-02-12T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids at JoVE.com

Ringraziamo il professor Hans Clevers per aver gentilmente fornito le linee cellulari per produrre R-spondin1 ricombinante. Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni del National Key R&D Program of China (2019YFA0111400), della National Natural Science Foundation of China (31970779) a H.H. e del Funds for Youth Interdisciplinary and Innovation Research Group della Shandong University (2020QNQT003) a H.H.

Tutti gli esperimenti sui topi sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali della School of Basic Medical Sciences dell'Università di Shandong e sono stati effettuati secondo la Licenza secondo le linee guida e i regolamenti del Ministero degli Interni (No. ECSBMSSDU2019-2-079).
NOTA: Questo protocollo viene utilizzato principalmente per la coltura di organoidi 3D da epatociti primari isolati.
1. Istituzione della coltura di epatociti murini</p...

<ol>
	<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 124-125 (2014).</li><li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+regenerative+medicine:+organogenesis+from+stem+cells+in+3D+culture.">Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Paola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+brain+organoids+reproducibly+form+cell+diversity+of+the+human+cerebral+cortex.">Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex.</a> Nature. 570, 523-527 (2019).</li><li>Atsuhiro, T., Ryuichi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-Order+Kidney+Organogenesis+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Higher-Order Kidney Organogenesis from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Wang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Expansion+of+Pancreatic+Islet+Organoids+from+Resident+Procr+++Progenitors.">Long-Term Expansion of Pancreatic Islet Organoids from Resident Procr + Progenitors.</a> Cell. 180 (6), 1198-1211 (2020).</li><li>Jarno, D., Hans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18, 407-418 (2018).</li><li>Hans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Forbes, S. J., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration-mechanisms+and+models+to+clinical+application.">Liver regeneration-mechanisms and models to clinical application.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13 (8), 473-485 (2016).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Expansion+of+Primary+Human+Hepatocytes+with+Efficient+Liver+Repopulation+Capacity.">In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 806-819 (2018).</li><li>Katsuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+Terminally+Committed+Hepatocytes+to+Culturable+Bipotent+Progenitor+Cells+with+Regenerative+Capacity.">Conversion of Terminally Committed Hepatocytes to Culturable Bipotent Progenitor Cells with Regenerative Capacity.</a> Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).</li><li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Expansion+of+Functional+Mouse+and+Human+Hepatocytes+as+3D+Organoids.">Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li><li>Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Cytokine+TNFalpha+Promotes+the+Long-Term+Expansion+of+Primary+Hepatocytes+in+3D+Culture.">Inflammatory Cytokine TNFalpha Promotes the Long-Term Expansion of Primary Hepatocytes in 3D Culture.</a> Cell. 175 (6), 1607-1619 (2018).</li><li>Xiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+maintenance+of+primary+human+hepatocytes+in+vitro.">Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro.</a> Science. 364 (6438), 399-402 (2019).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver.">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocol. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li></ol>

La capacità di coltivare epatociti maturi per lunghi periodi è fondamentale nello studio della scienza di base del fegato, della tossicologia dei farmaci e delle infezioni epatotropiche di microbiologia dell'ospite come la malaria e i virus dell'epatite. Con una nicchia ben definita, il protocollo qui imposta un sistema di coltura per gli epatociti. Questo protocollo spinge gli epatociti maturi ad espandersi in coltura 3D con un'eterogeneità che ricapitola l'interazione cellula-cellula, la maggior parte delle funzioni...

Gli organoidi sono cluster in vitro auto-organizzati, tridimensionali (3D) che includono cellule staminali auto-rinnovanti e cellule differenziate multi-linea1,2. Gli organoidi di molti organi sono stati stabiliti da cellule staminali pluripotenti o adulte da fattori di nicchia ben definiti tra cui l'intestino, il cervello, il colon, il rene, il fegato, il pancreas, la tiroide, lo stomaco, la pelle e il polmone3,4,5,6,7 . Gli organoidi ricapitolano le funzioni fisiche delle cellule imitando lo sviluppo (originato da cellule staminali pluripotenti embrionali o indotte, PSC) o la progressione dell'omeostasi/rigenerazione (originata da cellule staminali adulte, ASC), che apre nuove strade nella ricerca e nella terapia delle malattie8,9.
Essendo il più grande organo dei mammiferi, il fegato è principalmente responsabile della conservazione, del metabolismo e della disintossicazione. Due tipi di cellule epiteliali, epatociti e colangiociti, costruiscono l'unità di base di un lobulo epatico. Gli epatociti sono responsabili del 70-80% della funzionalità epatica10. Sebbene il fegato abbia una notevole capacità di rigenerazione, la rapida perdita delle caratteristiche degli epatociti si verifica durante la tradizionale coltura monostrato mediante polarizzazione cellulare disregolata e dedifferenziazione, il che aumenta la necessità di ricercatori e medici di costruire modelli epatici "gap-bridging" in un piatto. Tuttavia, fino a poco tempo fa i modelli di espansione ex vivo degli epatociti primari non erano stati ben stabiliti11,12,13,14,15. Gli organoidi epatici possono essere stabiliti da cellule staminali pluripotenti embrionali / indotte, conversione dei fibroblasti in cellule simili agli epatociti e cellule derivate dai tessuti. Lo sviluppo di organoidi epatici stimola l'applicazione di un modello in vitro per screening farmacologici e saggi di tossicità epatica16,17.
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per stabilire organoidi epatici da epatociti primari murini. Utilizzando questo protocollo, abbiamo creato un sistema di coltura in vitro di organoidi epatocitari con due perfusioni di collagenasi. Questi organoidi possono essere passati per un'espansione a lungo termine per mesi. La loro funzione fisiologica è altamente coerente con gli epatociti. Inoltre, forniamo anche una descrizione dettagliata di come eseguire la manipolazione genetica, come l'infezione da lentivirus, la trasduzione del siRNA e l'ingegneria CRISPR-Cas9 utilizzando organoidi. La propagazione degli organoidi epatocitari fa luce sulla possibilità di utilizzare gli organoidi per comprendere la biologia epatica e sviluppare approcci di medicina personalizzati e traslazionali.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Perfusion Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A600077-0100</td>
			<td>3.50 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100188-0500</td>
			<td>9.00 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100395-0500</td>
			<td>4.00 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>1.51 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501218-0001</td>
			<td>80.0 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A610404-0500</td>
			<td>0.78 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A500873-0500</td>
			<td>3.50 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100882-0025</td>
			<td>0.06 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501330-0005</td>
			<td>0.50 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1639</td>
			<td>0.10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>C621110-0010</td>
			<td>23.80 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100395-0500</td>
			<td>4.00 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>1.51 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501218-0001</td>
			<td>80.0 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A610404-0500</td>
			<td>0.78 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A500873-0500</td>
			<td>3.50 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip-wash Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10091148</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C14190500BT0</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>&#160;A600135-0025</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>Stock concentration 500 &#181;M, final 
			concentration 2 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement 50x, minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1704-044</td>
			<td>50 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chir 99021</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td>Stock concentration 30 mM, final 
			concentration 3 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330032</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin I</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3006</td>
			<td>Stock concentration 100 mM, final 
			concentration 10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel martix</td>
			<td>BD</td>
			<td>356231</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Stock concentration 500 mM, final 
			concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nictinamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>&#160;A600135-0025</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml,final concentration 50 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human HGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 25 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TGF-&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-16A</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-&#945;</td>
			<td>Origene</td>
			<td>TP750007-1000</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho kinase inhibitor Y-27632</td>
			<td>Abmole Bioscience</td>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspondin-1conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPT01RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 # silicone tube</td>
			<td>LangerPump</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well, suspension</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>GN662102-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C Water Bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m filter</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>stemcell</td>
			<td>AT-104</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CTNNB1</td>
			<td>BD</td>
			<td>610154</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH</td>
			<td>CST</td>
			<td>5174S</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HDAC7</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab50212</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KI67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15580</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>542700097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>AC2-4S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>&#160;A100231</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Color Imaging Systems</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AME4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hdac3 siRNA</td>
			<td>Guangzhou RiboBio Co., Ltd.</td>
			<td>siG2003180909192555</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hdac7 lentivirus</td>
			<td>ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd</td>
			<td>LV2020-2364</td>
			<td>stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitrans G A</td>
			<td>Shanghai Genechem Co.,Ltd.</td>
			<td>REVG004</td>
			<td>Increased virus infection efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Pro Plus software</td>
			<td>Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>version 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778150</td>
			<td>Increased virus infection efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live cell dye</td>
			<td>Luna</td>
			<td>F23001</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-speed desktop centrifuge</td>
			<td>cence</td>
			<td>TD5A-WS/TD5AWS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofactor-&#945; 2b Device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>F621006-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>LangerPump</td>
			<td>BT100-2J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Activate with methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX458</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>48138</td>
			<td>stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific Heraeus</td>
			<td>Labofuge 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSL3</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-100218A</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 4 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibico</td>
			<td>25200072</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wee1 siRNA</td>
			<td>Guangzhou RiboBio Co., Ltd.</td>
			<td>siG2003180909205971</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids

Il fegato è l'organo più grande nei mammiferi. Svolge un ruolo importante nella conservazione del glucosio, nella secrezione proteica, nel metabolismo e nella disintossicazione. Come esecutore per la maggior parte delle funzioni epatiche, gli epatociti primari hanno una capacità proliferante limitata. Ciò richiede l'istituzione di modelli di espansione epatocitaria ex vivo per la ricerca fisiologica e patologica epatica. Qui, abbiamo isolato gli epatociti murini mediante due fasi di perfusione di collagenasi e stabilito una coltura organoide 3D come "mini-fegato" per ricapitolare le interazioni cellula-cellula e le funzioni fisiche. Gli organoidi sono costituiti da popolazioni cellulari eterogenee tra cui progenitori ed epatociti maturi. Introduciamo il processo in dettaglio per isolare e coltivare gli epatociti murini o gli epatociti fetali per formare organoidi entro 2-3 settimane e mostriamo come passarli con il pipettaggio meccanico su e giù. Inoltre, introdurremo anche come digerire gli organoidi in singole cellule per l'infezione da lentivirus di costruzione shRNA / ectopica, trasfezione di siRNA e ingegneria CRISPR-Cas9. Gli organoidi possono essere utilizzati per schermi farmacologici, modelli di malattie e ricerca epatica di base modellando la biologia epatica e la patobiologia.

Gli organoidi epatociti della femmina Alb-Cre; Il topo Rosa26-GFP (8 settimane) è stato osservato cinque giorni dopo la semina (Figura 1A). Gli organoidi proliferano con la colorazione positiva Ki67 (Figura 1B). L'espressione interferente di geni rappresentativi negli organoidi epatocitari mediante trasfezione di siRNA o infezione da lentivirus è stata esaminata mediante qRT-PCR e western blot. I risultati sono mostrati nelle Figure 2A</st...

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Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

Un sistema di coltura organoide 3D ex vitro a lungo termine è stato stabilito da epatociti di topo. Questi organoidi possono essere passati e manipolati geneticamente dall'infezione da lentivirus di costruzione shRNA/ectopica, trasfezione di siRNA e ingegneria CRISPR-Cas9.

Istituzione e manipolazione genetica degli organoidi epatociti murini

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

Il fegato è l'organo più grande nei mammiferi. Svolge un ruolo molto importante nel metabolismo e nella disintossicazione. Sebbene il fegato abbia una notevole capacità di rigenerazione in vitro, è ancora una grande sfida a lungo termine coltivare epatociti in vitro.Qui, stabiliamo gli organoidi degli epatociti dagli epatociti maturi. Mantiene le caratteristiche principali degli epatociti nella morfologia e nella funzione. In questo video, introdurremo come coltivare e passare questi organoidi e come eseguire la modificazione genetica di questi organoidi in dettaglio.In primo luogo, perfusione epatica e digestione. Preparare tutte le regioni e gli strumenti e renderli sterili. Lavare il mouse e aprire l'epidermico e la pelle, quindi cercare di trovare il forno a sacchetto del fegato.Inietta gli aghi in esso, quindi cattura questo. Fai la perfusione alla velocità di cinque millilitri al minuto, fino a quando il fegato diventa pallido. Cambiali nel tampone di perfusione, posizionali con attenzione, osserva il fegato, fino a quando non diventa morbido.Di solito ci vogliono dai tre ai cinque minuti, poi tagliare il fegato e metterli nei piatti, e tagliarli a pezzetti con le forbici. Pep su e giù frequentemente. Di solito, ci vogliono dai 10 ai 15 minuti per trasformarli nella singola cellula.E poi pep su e giù con 10 a 15 minuti e dar loro da mangiare attraverso l'installatore. Trasformali nelle singole celle. Raccogliere tutte le celle nel tubo da 50 millilitri e centrifugarle, con la velocità e quindi raccogliere tutte le piastre per.Cerca di tenerli sempre nel ghiaccio freddo. Crea le sospensioni a cella singola e contale con il contatore di celle. Di solito gli epatociti se felici, ha la vivace fluorescenza.La seconda parte, cerchiamo di far sedere le cellule e fare la coltura organoide. Raccogliamo tutte le sospensioni cellulari, e contiamo le cellule con una certa concentro-fusione E poi mescoliamo le. Metrogels. e il supporto del codice.Di solito prendiamo, con il mezzo e i metrogel, al rapporto di 1 a 2 o 1 a 3. Dopo averli accuratamente miscelati, li sediamo sulle piastre sfumate. Di solito aggiungiamo 100 microlitri al pozzo a 24 piastre.Mettili nell'incubatrice alla temperatura di 37 gradi. Dopo 20 minuti, li mettiamo in avanti con il fondo in basso e poi al mezzo. Con due o tre giorni di contrasto, di solito vediamo uscire gli organoidi.Questa è l'immagine tipica dei nostri organoidi. Di solito abbiamo bisogno di singole cellule da organoidi se vogliamo fare il passaggio o fare qualche metodo di modificazione genetica Raccogliamo tutti gli organoidi dalle piastre di contrasto con il tampone di lavaggio del cappotto. Lasciamo cadere il surnatante, quindi al tampone di lavaggio del cappotto nel piatto, mescoliamo, quindi pep su e giù.E poi di solito pre-laviamo tutte le punte con il tampone dei nastri di lavaggio. Per evitare che tutti gli organoidi si rovescino sulle punte. E poi con il, un nuovo lotto su ghiaccio o senza di esso, raccogliamo tutti gli organoidi per centro-fusione.Li trattiamo, c'è un conning radients per rimuovere tutti i metrogel. Dopo 20-30 minuti di incubazione su ghiaccio tutti i metrogel vengono rimossi. Raccogliamo tutti gli organoidi puliti e aggiungiamo la tripsina per trasformarli in singole cellule.Dopo l'aggiunta della tripsina, trattiamo gli organoidi nell'incubatrice. Ci vogliono dai 5 ai 10 minuti perché gli organoidi epatici diventino singole cellule. Aggiungiamo più tamponi di lavaggio per fermare la triplatina.E poi spingilo su e giù verso di loro. Per il processo di opzione, è possibile lavarli ancora una volta per rimuovere tutta la tripsina. Dopo il lavaggio per centrofusione, possiamo contarli sotto il contatore cellulare.Quindi mostreremo come fare la transazione o la trasfezione di questi organoidi epatociti. Per prima cosa, etichetta i tubi di ciò che farai, quindi faremo la trasfezione della vista secondo le istruzioni del produttore. Hai bisogno, il reggente del lipoyl fatto addomesticando INI MaX.Aggiungiamo il. controllare e il gene specifico siRNA, e incubarli con l'ottimale, secondo le istruzioni del produttore. E poi in base alla concentrazione cellulare aggiungiamo il RAN max e li mescoliamo accuratamente.Quindi aggiungiamo anche il RAN max con l'optimum separatamente e li mettiamo sul ghiaccio. Dopo 5 minuti, creiamo una miscela RAN max separata con diversi siRNA, il gene specifico RANi e il controllo II separatamente e li mescoliamo accuratamente. Mettili di nuovo sul ghiaccio, e poi raccogliamo tutti gli organoidi, la centrofusione lenta, lasciamo cadere tutto il surnatante, aggiungiamo l'RNAi max, la miscela di siRNA in questa piastra cellulare e la pep su e giù accuratamente.In breve, le cellule e l'etichetta RNAi max e la miscela di siRNA sono state gentrificazione e incubazione per 4-5 ore a 37 gradi. Parte finale, questi organoidi epatociti potrebbero anche essere infettati dal virus Lenti. Il messaggio simile è stato eseguito come trasfezione di siRNA.Il controllo e i tubi del virus siRNA erano ben preparati e l'optimum è stato aggiunto secondo le istruzioni del produttore. Quindi con le regioni di infezione come poly green e quindi aggiungiamo diversi virus Lenti, secondo la costituzione delle istruzioni del produttore. Unire le sospensioni monocellulari in coltura di organoidi e varie particelle nei tubi eppendorf da 1,5 millilitri, aggiungere, bene, mescolare piaggere questa miscela e concentrarli per 1 ora a 32 gradi.La fusione concentrata verrà eseguita a 500 G.E dopo 4-5 ore di incubazione a 37 gradi la sospensione cellulare verrà quindi raccolta e seduta in metrogel. E mettili di nuovo nell'incubatrice. L'organo sull'efficienza di formazione o altre analisi funzionali potrebbero essere eseguite da 7 a 10 giorni dopo.Ecco i nostri risultati rappresentativi. Nella figura 1A, è possibile vedere i nostri epatociti ALB-Cre Rosa 26-GFP o RFP organoidi dal topo. Nella figura 1B si può vedere il segnale positivo Ki67 nella colorazione, che ha dimostrato che i nostri organoidi epatociti stanno proliferando.In figura 2A e 2B ecco un'espressione genica rappresentativa della nostra espressione interferente dei nostri geni. Dopo la manipolazione genetica negli organoidi epatociti, l'interferenza efficace è molto efficiente. Ecco la figura 2C, si potrebbe vedere dopo la manipolazione genetica con la tecnologia della carsonite nei nostri organoidi murini.Conclusione, i nostri risultati hanno mostrato che gli organoidi epatociti potrebbero essere espansi in vitro e geneticamente manipolati. In sintesi, in questo video mostriamo come fare la perfusione epatica e la digestione per ottenere gli epatociti. Come catturare gli epatociti e passare gli organoidi degli epatociti.Inoltre, abbiamo mostrato come fare la trasfezione di siRNA e vettori o l'infezione da virus Lenti per fare la modifica della genetica di questi organoidi. Inoltre, abbiamo due carenze nei nostri organoidi. In primo luogo, non abbiamo usato per nucleo o nucleo di pelliccia per purificare gli epatociti.E in secondo luogo penso che più fattori di crescita e segnali dovrebbero essere provati per migliorare il tempo di crescita degli organoidi.

Research

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