Name: establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids
Uploaded: 2022-02-12T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids at JoVE.com

組み換えR-spondin1を生産するための細胞株を親切に提供してくれたハンス・クレバーズ教授に感謝します。この研究は、中国国家主要研究開発プログラム(2019YFA0111400)、中国国立自然科学財団(31970779)からH.H.、山東大学青少年学際イノベーション研究グループ(2020QNQQT003)からH.H.への助成金によって支えられました。

すべてのマウス実験は、山東大学基礎医学部動物管理・使用委員会によって承認され、内務省のガイドラインと規制に基づくライセンスに従って実施されました(No.ECSBMSSDU2019-2-079)。
注:このプロトコルは、主に孤立した原発肝細胞から3Dオルガノイドを培養するために使用されます。
1. ネズミ肝細胞オルガノイド文化の確立
注:Matri...

<ol>
	<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 124-125 (2014).</li><li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+regenerative+medicine:+organogenesis+from+stem+cells+in+3D+culture.">Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Paola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+brain+organoids+reproducibly+form+cell+diversity+of+the+human+cerebral+cortex.">Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex.</a> Nature. 570, 523-527 (2019).</li><li>Atsuhiro, T., Ryuichi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-Order+Kidney+Organogenesis+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Higher-Order Kidney Organogenesis from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Wang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Expansion+of+Pancreatic+Islet+Organoids+from+Resident+Procr+++Progenitors.">Long-Term Expansion of Pancreatic Islet Organoids from Resident Procr + Progenitors.</a> Cell. 180 (6), 1198-1211 (2020).</li><li>Jarno, D., Hans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18, 407-418 (2018).</li><li>Hans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Forbes, S. J., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration-mechanisms+and+models+to+clinical+application.">Liver regeneration-mechanisms and models to clinical application.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13 (8), 473-485 (2016).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Expansion+of+Primary+Human+Hepatocytes+with+Efficient+Liver+Repopulation+Capacity.">In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 806-819 (2018).</li><li>Katsuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+Terminally+Committed+Hepatocytes+to+Culturable+Bipotent+Progenitor+Cells+with+Regenerative+Capacity.">Conversion of Terminally Committed Hepatocytes to Culturable Bipotent Progenitor Cells with Regenerative Capacity.</a> Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).</li><li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Expansion+of+Functional+Mouse+and+Human+Hepatocytes+as+3D+Organoids.">Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li><li>Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Cytokine+TNFalpha+Promotes+the+Long-Term+Expansion+of+Primary+Hepatocytes+in+3D+Culture.">Inflammatory Cytokine TNFalpha Promotes the Long-Term Expansion of Primary Hepatocytes in 3D Culture.</a> Cell. 175 (6), 1607-1619 (2018).</li><li>Xiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+maintenance+of+primary+human+hepatocytes+in+vitro.">Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro.</a> Science. 364 (6438), 399-402 (2019).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver.">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocol. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li></ol>

成熟した肝細胞を長期間にわたって培養する能力は、肝臓の基礎科学、薬物毒物学、マラリアや肝炎ウイルスなどの肝刺激性宿主微生物感染症の研究の基本です。明確に定義されたニッチで、ここでのプロトコルは、肝細胞の培養システムを設定します。このプロトコルは、成熟した肝細胞を細胞と細胞の相互作用、ほとんどの肝細胞機能および遺伝子組換えを再現する異質性を持つ3D培養?...

オルガノイドは、自己更新幹細胞および多系統分化細胞1,2を含む体外(3D)インビトロクラスターです。多くの器官のオルガノイドは、腸、脳、結腸、腎臓、肝臓、膵臓、甲状腺、胃、皮膚、および肺を含む明確に定義されたニッチ因子によって、多能性または成体幹細胞から確立されている3,4,5,6,7.オルガノイドは、発症(胚性または誘発多能性幹細胞、PSCに由来する)または恒常性/再生進行(成人幹細胞、ASCに由来する)のいずれかを模倣することによって、身体細胞機能を再現し、疾患研究と治療の新たな道を開く8,9。
哺乳類の最大の器官として、肝臓は主に貯蔵、代謝および解毒を担当する。肝細胞と胆管球の2種類の上皮細胞型は、肝臓小葉の基本単位を構築する。肝細胞は肝機能の70-80%を担う10。肝臓は顕著な再生能力を有するが、肝細胞特徴の急速な喪失は、調節不全細胞分極化および脱分化による伝統的な単層培養中に起こり、研究者や臨床医が皿の中に「ギャップブリッジング」肝臓モデルを構築する必要性を高める。しかし、最近まで、原発肝細胞からのエクスビボ拡張モデルは十分に確立されていなかった11,12,13,14,15。肝オルガノイドは、胚/誘導多能性幹細胞、肝細胞様細胞への線維芽細胞変換、および組織由来細胞から確立することができる。肝オルガノイドの開発は、薬物スクリーンおよび肝毒性アッセイのためのインビトロモデルの適用を後押しする16,17。
ここでは、マウス原発肝細胞から肝オルガノイドを確立するための詳細なプロトコルについて説明する。このプロトコルを用いることで、2回のコラゲナーゼを用いた肝細胞オルガノイドの インビトロ 培養系を設定しました。これらのオルガノイドは、数ヶ月間の長期拡張のために継代することができる。彼らの生理機能は肝細胞と非常に一致している。さらに、レンチウイルス感染、siRNAの導入、有機体を用いたCRISPR-Cas9工学など、遺伝子操作の実施方法についても詳しく説明しています。肝細胞オルガノイドの伝播は、オルガノイドを使用して肝臓生物学を理解し、パーソナライズされた翻訳医療アプローチを開発する可能性に光を当てた。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Perfusion Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A600077-0100</td>
			<td>3.50 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100188-0500</td>
			<td>9.00 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100395-0500</td>
			<td>4.00 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>1.51 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501218-0001</td>
			<td>80.0 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A610404-0500</td>
			<td>0.78 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A500873-0500</td>
			<td>3.50 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100882-0025</td>
			<td>0.06 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501330-0005</td>
			<td>0.50 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1639</td>
			<td>0.10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>C621110-0010</td>
			<td>23.80 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100395-0500</td>
			<td>4.00 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>1.51 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501218-0001</td>
			<td>80.0 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A610404-0500</td>
			<td>0.78 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A500873-0500</td>
			<td>3.50 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip-wash Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10091148</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C14190500BT0</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>&#160;A600135-0025</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>Stock concentration 500 &#181;M, final 
			concentration 2 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement 50x, minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1704-044</td>
			<td>50 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chir 99021</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td>Stock concentration 30 mM, final 
			concentration 3 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330032</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin I</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3006</td>
			<td>Stock concentration 100 mM, final 
			concentration 10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel martix</td>
			<td>BD</td>
			<td>356231</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Stock concentration 500 mM, final 
			concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nictinamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>&#160;A600135-0025</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml,final concentration 50 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human HGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 25 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TGF-&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-16A</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-&#945;</td>
			<td>Origene</td>
			<td>TP750007-1000</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho kinase inhibitor Y-27632</td>
			<td>Abmole Bioscience</td>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspondin-1conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPT01RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 # silicone tube</td>
			<td>LangerPump</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well, suspension</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>GN662102-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C Water Bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m filter</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>stemcell</td>
			<td>AT-104</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CTNNB1</td>
			<td>BD</td>
			<td>610154</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH</td>
			<td>CST</td>
			<td>5174S</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HDAC7</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab50212</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KI67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15580</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>542700097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>AC2-4S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>&#160;A100231</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Color Imaging Systems</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AME4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hdac3 siRNA</td>
			<td>Guangzhou RiboBio Co., Ltd.</td>
			<td>siG2003180909192555</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hdac7 lentivirus</td>
			<td>ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd</td>
			<td>LV2020-2364</td>
			<td>stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitrans G A</td>
			<td>Shanghai Genechem Co.,Ltd.</td>
			<td>REVG004</td>
			<td>Increased virus infection efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Pro Plus software</td>
			<td>Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>version 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778150</td>
			<td>Increased virus infection efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live cell dye</td>
			<td>Luna</td>
			<td>F23001</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-speed desktop centrifuge</td>
			<td>cence</td>
			<td>TD5A-WS/TD5AWS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofactor-&#945; 2b Device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>F621006-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>LangerPump</td>
			<td>BT100-2J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Activate with methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX458</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>48138</td>
			<td>stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific Heraeus</td>
			<td>Labofuge 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSL3</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-100218A</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 4 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibico</td>
			<td>25200072</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wee1 siRNA</td>
			<td>Guangzhou RiboBio Co., Ltd.</td>
			<td>siG2003180909205971</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids

肝臓は哺乳類の中で最大の器官です。これは、グルコース貯蔵、タンパク質分泌、代謝および解毒において重要な役割を果たしています。肝機能の大部分の実行者として、原発性肝細胞は増殖能力が限られている。そのためには、肝臓生理学的および病理学的研究のための ex vivo 肝細胞拡張モデルの確立が必要です。ここでは、コラゲナーゼ灌流の2段階でマウス肝細胞を単離し、細胞と細胞の相互作用と身体機能を再現する「ミニ肝臓」として3Dオルガノイド培養を確立した。オルガノイドは、前駆細胞および成熟した肝細胞を含む不均一な細胞集団で構成される。マウス肝細胞または胎児肝細胞を2~3週間以内に分離して培養し、オルガノイドを形成するプロセスを詳細に紹介し、機械的に上下にピペットを通過させる方法を示す。また、shRNA/異所構造のレンチウイルス感染、siRNAトランスフェクション、CRISPR-Cas9エンジニアリング用にオルガノイドを単一細胞に消化する方法についても紹介します。オルガノイドは、肝臓生物学と病態生物学をモデル化することにより、薬物スクリーン、疾患モデリング、および基礎的な肝臓研究に使用することができます。

女性のアルブ・クレからの肝細胞オルガノイド;Rosa26-GFPマウス(8週間)は、播種の5日後に観察された(図1A)。このオルガノイドはKi67陽性染色で増殖している(図1B)。肝細胞オルガノイドにおける代表的な遺伝子の発現を、siRNAトランスフェクションまたはレンチウイルス感染のいずれかによる干渉発現をqRT-PCRおよびウェスタンブロットで調べた。結果?...

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Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

マウス肝細胞から長期 の外ビトロ 3Dオルガノイド培養システムが確立された。これらのオルガノイドは、shRNA/異所構造、siRNAトランスフェクションおよびCRISPR-Cas9エンジニアリングのレンチウイルス感染によって継代され、遺伝的に操作することができる。

マウス肝細胞オルガノイドの確立と遺伝子操作

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

肝臓は哺乳類の中で最大の器官です。代謝と解毒において非常に重要な役割を果たしています。.肝臓は、インビトロで顕著な再生能力を持っていますが、それはまだ肝細胞のインビトロを培養するために長期的には非常に大きな課題です。ここでは、成熟した肝細胞から肝細胞オルガノイドを確立する。これは、形態と機能における肝細胞の主な特徴を保持します。本ビデオでは、これらのオルガノイドの培養と通過の仕方と、これらのオルガノイドの遺伝子改変を詳細に行う方法について紹介します。まず、肝臓灌流と消化。すべての領域と器具を準備し、それらを無菌にします。マウスを洗って表皮と皮膚を開き、肝臓のポーチオーブンを見つけようとします。それに針を注入し、これをキャプチャします。肝臓が青白くなるまで、毎分5ミリリットルの速度で灌流を行います。灌流バッファーにそれらを変更, 慎重に置きます, 肝臓を見て, それが柔らかくなるまで.通常、それは3〜5分かかります, その後、肝臓をカットし、プレートに入れて、ハサミで小片にカット.頻繁にそれを上下にペップ。通常、単一の細胞にそれらを作るために10〜15分かかります。そして、10〜15分でそれを上下にペップし、フィッターを通してそれらを供給します。それらを単一のセルにします。50ミリリットルチューブ内のすべての細胞を収集し、速度で遠心分離し、プレートごとにすべての収集します。常に冷たい氷の中でそれらを維持してみてください。単一セルの懸濁液を作り、セルカウンターでそれらを数えます。通常、肝細胞は幸せであれば、生き生きとした蛍光を有する。第二に、細胞を座ってオルガノイド培養を行います。我々は、すべての細胞の懸濁液を収集し、特定の点心融合を有する細胞を数え、その後、混合する。メトロゲルス。およびコードメディア。通常、我々は、媒体とメトロゲルで、1〜2または1〜3の比率で取る。慎重に混合した後、グラデーションプレートに座ります。我々は通常、24プレートウェルで100マイクロリットルを追加します。37度の温度でインキュベーターに入れます。20分後、下の下を逆にして、メディアに戻します。2、3日のカウンターで、私たちは通常、オルガノイドが出てくるのを見ます。これは私たちのオルガノイドの典型的なイメージです。我々は通常、我々は通路を行うか、いくつかの遺伝子組み換え方法を行う場合は、オルガノイドからの単一の細胞が必要な我々はコート洗浄緩衝液とカウンタープレートからすべてのオルガノイドを収集します。上清を落とし、コートウォッシュバッファでプレートに入れ、それらを混ぜるので、それを上下にペップします。そして、我々は通常、洗浄テープバッファですべての先端を事前に洗浄します。すべてのオルガノイドの先端を避けるために、そして、氷の上またはそれなしで新しいバッチで、我々はセントロフュージョンによってすべてのオルガノイドを収集します。私たちはそれらを扱う、すべてのメトロゲルを削除するための説得力のある放射があります。氷上でのインキュベーションの20〜30分後にすべてのメトロゲルが除去されます。私たちは、すべてのきれいなオルガノイドを収集し、単一の細胞にそれらを作るためにトリプシンを追加します。トリプシンを添加した後、オルガノイドをインキュベーターに取り入れ.肝オルガノイドが単一細胞になるには5~10分かかります。我々は、三Latinを停止するために、より多くの洗浄バッファーを追加します。そして、彼らに向かって上下にそれをペップ。オプションプロセスの場合は、もう一度洗ってすべてのトリプシンを取り除くことができます。セントロフュージョンで洗浄した後、細胞カウンターの下で数えることができます。次に、これらの肝細胞オルガノイドのトランザクションまたはトランスフェクションを行う方法を示します。まず、あなたが何をするかのチューブにラベルを付け、次にメーカーの指示に従って視力トランスフェクションを行います。あなたは必要です, INI MaXを飼いならすリポイル事実の摂政.を追加します。コントロールと特定の遺伝子siRNA、およびメーカーの指示に従って、最適でそれらをインキュベートします。そして、細胞濃度に応じて、RAN Maxを追加し、それらを徹底的に混合します。その後、我々はまた、別々に最適でRANの最大値を追加し、氷の上に置きます。5分後、我々は別のsiRNA、特異的遺伝子RANiおよびII対照を別々に別々に別々のRAN最大混合物をペップアップし、それらを徹底的に混合する。再び氷の上に置き、その後、我々はすべてのオルガノイド、遅い中心注入を収集し、すべての上清をドロップし、我々はこの細胞プレートにRNAi max、siRNA混合物を追加し、徹底的にそれをペップ。簡単に言えば、細胞とRNAi maxおよびsiRNA混合物の標識を、37度で4〜5時間の間、ジェントリフィケーションとインキュベートした。最後の部分, これらの肝細胞オルガノイドもレンチウイルスに感染する可能性があります。.同様のメッセージをsiRNAトランスフェクションとして行った。コントロールとsiRNAウイルスチューブは十分に準備され、そして最適はメーカーの指示に従って加えられた。その後、ポリグリーンのような感染領域で、我々はメーカーの指示の憲法に従って、異なるレンティウイルスを追加します。オルガノイド培養物と1.5ミリリットルのエペンドルフチューブの様々な粒子で単一細胞懸濁液を組み合わせ、よく、それらを混ぜて、この混合物をプレートし、32度で1時間濃縮します。濃縮融合は500 G.で行われ、37度で4〜5時間のインキュベーションの後、細胞懸濁液を回収し、メトロゲルに着席する。そして、再び保育器にそれらを入れてください。形成効率または他の機能解析に関する器官は、7〜10日後に行われ得る。ここに私たちの代表的な結果があります。図1Aでは、マウスからALB-クレローザ26-GFPまたはRFP肝細胞オルガノイドを見ることができました。図1Bでは、染色におけるKi67陽性シグナルが見え、肝細胞オルガノイドが増殖していることを示しています。図2Aと2Bは、私たちの遺伝子の干渉発現の代表的な遺伝子発現です。肝細胞オルガノイドの遺伝子操作後、干渉効果は非常に効率的である。図2Cは、私たちのマウスオルガノイドのコネリット技術で遺伝子操作した後に見ることができます。結論として、我々の結果は、肝細胞オルガノイドが体外で拡大され、遺伝的に操作できることを示した。要約すると,このビデオでは肝細胞を得るために肝臓灌流と消化を行う方法を示します。肝細胞を捕獲し、肝細胞オルガノイドを通過する方法.また、これらのオルガノイドの遺伝子の改変を行うsiRNAおよびベクタートランスフェクションまたはレンチウイルス感染を行う方法を示した。また、オルガノイドには2つの不足があります。まず、肝細胞を純粋にするためにコア当たりまたは毛皮コアを使用しませんでした。そして第二に、私はより多くの成長因子とシグナリングが成長するオルガノイドの時間を改善しようとするべきだと思います。

Research

JoVE Journal

Biology

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