Name: establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids
Uploaded: 2022-02-12T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids at JoVE.com

한스클레스 교수님이 재조합 R-spondin1을 생성하기 위해 세포주를 친절하게 제공한 것에 감사드립니다. 이 작품은 중국 국립 키 R&D 프로그램(2019YFA0111400), 중국 국립자연과학재단(31970779)에서 H.H.H.에 이르는 보조금, 산둥대학교 청소년학혁신연구그룹(2020QNQT003)의 지원으로 지원되었다.

모든 마우스 실험은 산동성 기초의과대학의 동물관리 및 사용위원회의 승인을 받았으며, 홈오피스 지침 및 규정에 따라 면허에 따라 수행되었다(No. ECSBMSSDU2019-2-079).
참고: 이 프로토콜은 주로 격리된 1차 간세포로부터 3D 오르가노이드를 배양하는 데 사용됩니다.
1. 뮤린 헤파토세포 오르간구형 설립
참고: 트리겔 또는 BME와 같은 세포 ?...

<ol>
	<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 124-125 (2014).</li><li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+regenerative+medicine:+organogenesis+from+stem+cells+in+3D+culture.">Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Paola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+brain+organoids+reproducibly+form+cell+diversity+of+the+human+cerebral+cortex.">Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex.</a> Nature. 570, 523-527 (2019).</li><li>Atsuhiro, T., Ryuichi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-Order+Kidney+Organogenesis+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Higher-Order Kidney Organogenesis from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Wang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Expansion+of+Pancreatic+Islet+Organoids+from+Resident+Procr+++Progenitors.">Long-Term Expansion of Pancreatic Islet Organoids from Resident Procr + Progenitors.</a> Cell. 180 (6), 1198-1211 (2020).</li><li>Jarno, D., Hans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18, 407-418 (2018).</li><li>Hans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Forbes, S. J., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration-mechanisms+and+models+to+clinical+application.">Liver regeneration-mechanisms and models to clinical application.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13 (8), 473-485 (2016).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Expansion+of+Primary+Human+Hepatocytes+with+Efficient+Liver+Repopulation+Capacity.">In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 806-819 (2018).</li><li>Katsuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+Terminally+Committed+Hepatocytes+to+Culturable+Bipotent+Progenitor+Cells+with+Regenerative+Capacity.">Conversion of Terminally Committed Hepatocytes to Culturable Bipotent Progenitor Cells with Regenerative Capacity.</a> Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).</li><li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Expansion+of+Functional+Mouse+and+Human+Hepatocytes+as+3D+Organoids.">Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li><li>Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Cytokine+TNFalpha+Promotes+the+Long-Term+Expansion+of+Primary+Hepatocytes+in+3D+Culture.">Inflammatory Cytokine TNFalpha Promotes the Long-Term Expansion of Primary Hepatocytes in 3D Culture.</a> Cell. 175 (6), 1607-1619 (2018).</li><li>Xiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+maintenance+of+primary+human+hepatocytes+in+vitro.">Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro.</a> Science. 364 (6438), 399-402 (2019).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver.">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocol. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li></ol>

오랜 기간 동안 성숙한 간세포를 배양하는 능력은 간 기초 과학, 약물 독성학 및 말라리아 및 간염 바이러스와 같은 간 세포 - 미생물학 감염을 연구하는 데 기본적입니다. 잘 정의된 틈새 시장을 통해 이 프로토콜은 간세포에 대한 문화 시스템을 설정합니다. 이 프로토콜은 성숙한 간세포가 세포 세포 상호 작용, 대부분의 간세포 기능 및 유전자 변형을 재구성하는 이질성으로 3D 배양에서 확장하?...

오르가노이드는 자가 재생 줄기 세포 및 다중 계면 분화 세포를 포함하는 체외 클러스터에서 자체 조직, 3차원 (3D)입니다1,2. 많은 장기의 오르가노이드는 장, 뇌, 결장, 신장, 간, 췌장, 갑상선, 위, 피부 및 폐3,4,5,6,7을 포함하여 잘 정의 된 틈새 요인에 의해 만능 또는 성인 줄기 세포에서 확립되었습니다. . 오르가노이드는 질병 연구 및 치료에서 새로운 길을 열어주는 개발 (배아 또는 유도 된 만능 줄기 세포, PSC에서 유래) 또는 항상성 / 재생 진행 (성인 줄기 세포, ASC에서 유래)을 모방하여 물리적 세포 기능을 재구성8,9.
포유류에서 가장 큰 기관으로, 간은 주로 저장에 대 한 책임, 신진 대사와 해독. 상피 세포 유형의 두 종류, 간세포 및 담고고, 간 소리의 기본 단위를 구성. 간 세포는 간 기능10의 70-80 %에 대한 책임이 있습니다. 간은 놀라운 재생 능력을 가지고 있지만, 간세포 기능의 급속한 손실은 소화 조절 세포 편광과 디차별화에 의해 전통적인 단층 배양 하는 동안 발생, 이는 접시에 '갭 브리징'간 모델을 구축 하는 연구원과 임상의의 필요성을 증가. 그러나, 최근까지 1차 간세포에서 의 전 생체 확장 모델은 잘 확립되지 않았다11,12,13,14,15. 간 오르가노이드는 배아 /유도 만능 줄기 세포, 섬유 아세포 변환에서 간세포와 같은 세포, 및 조직 유래 세포에서 확립 될 수있다. 간 오르가노이드의 개발은 약물 화면 및 간 독성 에 대한 체외 모델의 적용을 향상16,17.
여기에서, 우리는 뮤린 1 차 간 세포에서 간 오르가노이드를 확립하기위한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여 콜라게나아제의 두 번의 관류를 가진 간세포 오르가노이드의 체외 배양 시스템을 설정했습니다. 이 오르가노이드는 몇 달 동안 장기 확장을 위해 통과 될 수 있습니다. 그들의 생리 적 기능은 간세포와 매우 일치합니다. 또한, 우리는 또한 렌티 바이러스 감염, siRNA 트랜스듀션 및 ORGANoids를 사용하여 CRISPR-Cas9 공학과 같은 유전 적 조작을 수행하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 간 세포 구가노이드의 전파는 간 생물학을 이해하고 개인화된 및 번역 의학 접근을 개발하기 위하여 오르가노이드를 사용하는 가능성에 빛을 비추었습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Perfusion Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A600077-0100</td>
			<td>3.50 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100188-0500</td>
			<td>9.00 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100395-0500</td>
			<td>4.00 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>1.51 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501218-0001</td>
			<td>80.0 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A610404-0500</td>
			<td>0.78 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A500873-0500</td>
			<td>3.50 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100882-0025</td>
			<td>0.06 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501330-0005</td>
			<td>0.50 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1639</td>
			<td>0.10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>C621110-0010</td>
			<td>23.80 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100395-0500</td>
			<td>4.00 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>1.51 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501218-0001</td>
			<td>80.0 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A610404-0500</td>
			<td>0.78 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A500873-0500</td>
			<td>3.50 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip-wash Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10091148</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C14190500BT0</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>&#160;A600135-0025</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>Stock concentration 500 &#181;M, final 
			concentration 2 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement 50x, minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1704-044</td>
			<td>50 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chir 99021</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td>Stock concentration 30 mM, final 
			concentration 3 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330032</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin I</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3006</td>
			<td>Stock concentration 100 mM, final 
			concentration 10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel martix</td>
			<td>BD</td>
			<td>356231</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Stock concentration 500 mM, final 
			concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nictinamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>&#160;A600135-0025</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml,final concentration 50 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human HGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 25 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TGF-&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-16A</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-&#945;</td>
			<td>Origene</td>
			<td>TP750007-1000</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho kinase inhibitor Y-27632</td>
			<td>Abmole Bioscience</td>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspondin-1conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPT01RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 # silicone tube</td>
			<td>LangerPump</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well, suspension</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>GN662102-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C Water Bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m filter</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>stemcell</td>
			<td>AT-104</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CTNNB1</td>
			<td>BD</td>
			<td>610154</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH</td>
			<td>CST</td>
			<td>5174S</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HDAC7</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab50212</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KI67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15580</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>542700097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>AC2-4S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>&#160;A100231</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Color Imaging Systems</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AME4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hdac3 siRNA</td>
			<td>Guangzhou RiboBio Co., Ltd.</td>
			<td>siG2003180909192555</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hdac7 lentivirus</td>
			<td>ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd</td>
			<td>LV2020-2364</td>
			<td>stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitrans G A</td>
			<td>Shanghai Genechem Co.,Ltd.</td>
			<td>REVG004</td>
			<td>Increased virus infection efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Pro Plus software</td>
			<td>Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>version 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778150</td>
			<td>Increased virus infection efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live cell dye</td>
			<td>Luna</td>
			<td>F23001</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-speed desktop centrifuge</td>
			<td>cence</td>
			<td>TD5A-WS/TD5AWS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofactor-&#945; 2b Device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>F621006-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>LangerPump</td>
			<td>BT100-2J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Activate with methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX458</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>48138</td>
			<td>stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific Heraeus</td>
			<td>Labofuge 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSL3</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-100218A</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 4 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibico</td>
			<td>25200072</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wee1 siRNA</td>
			<td>Guangzhou RiboBio Co., Ltd.</td>
			<td>siG2003180909205971</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids

간은 포유류에서 가장 큰 기관입니다. 그것은 포도 당 저장에 중요 한 역할을, 단백질 분 비, 신진 대사 와 해독. 간 기능의 대부분에 대 한 집행자로, 기본 간 세포는 제한 된 증식 용량. 이것은 간 생리및 병리학 연구를 위한 ex vivo 간세포 확장 모형의 설치를 요구합니다. 여기서, 우리는 콜라게나아제 관류의 두 단계로 뮤린 간세포를 분리하고 세포 세포 상호 작용 및 물리적 기능을 재구성하는 '미니 간'으로 3D 오르간 배양을 확립했습니다. 오르가노이드는 선조와 성숙한 간세포를 포함하는 이기종 세포 집단으로 구성됩니다. 우리는 2-3 주 이내에 오르가노이드를 형성하기 위해 뮤린 간세포 또는 태아 간구를 분리하고 배양하고 기계적으로 위아래로 피펫을 하여 통과하는 방법을 보여주는 세부적인 과정을 소개합니다. 또한, 우리는 또한 shRNA / ectopic 건설, siRNA 트랜스페션 및 CRISPR-Cas9 공학의 렌즈 바이러스 감염을 위한 단하나 세포로 오르가노이드를 소화하는 방법을 소개할 것입니다. 오르가노이드는 간 생물학 및 병리학을 모델링하여 약물 화면, 질병 모델링 및 기본 간 연구에 사용할 수 있습니다.

여성 Alb-Cre에서 간세포 오르가노이드; Rosa26-GFP 마우스(8주)는 시드 후 5일 후에 관찰되었다(도 1A). 오가노이드는 Ki67 양성 염색(그림 1B)으로 증식하고 있습니다. siRNA 트랜스포션 또는 렌티바이러스 감염에 의한 간세포 오르가노이드에서 대표적인 유전자의 발현을 방해하는 것은 qRT-PCR 및 서부 블롯에 의해 검사되었다. 결과는 그림 2A</stro...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids at JoVE.com

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

마우스 간세포로부터 장기 전 시험관 3D 오르간구배기 시스템이 구축되었다. 이러한 오르가노이드는 shRNA/ectopic 구조, siRNA 경질 및 CRISPR-Cas9 엔지니어링의 렌티바이러스 감염에 의해 통과되고 유전적으로 조작될 수 있다.

뮤린 헤파토세포 오르가노이드의 설립 및 유전적 조작

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

간은 포유류에서 가장 큰 기관입니다. 그것은 신진 대사와 해독에 매우 중요 한 역할을. 간은 시험관내에서 놀라운 재생 능력을 가지고 있지만, 그것은 여전히 생체 외에서 문화 간세포에 장기적으로 매우 큰 도전이다.여기서, 우리는 성숙한 간세포에서 간세포 오르간구를 설치합니다. 그것은 형태와 기능에 간세포의 주요 기능을 유지합니다. 이 비디오에서는 이러한 오르가노이드를 문화하고 통과하는 방법과 이러한 오르가노이드의 유전자 변형을 자세히 소개합니다.첫째, 간 관류와 소화. 모든 지역과 악기를 준비하고 멸균합니다. 마우스를 씻고 표피와 피부를 열고 간 파우치 오븐을 찾으려고 노력합니다.바늘을 주입한 다음 이를 캡처합니다. 간이 창백해질 때까지 분당 5 밀리리터의 속도로 관류를 수행하십시오. 관류 완충액으로 바꾸고, 조심스럽게 놓고, 간을 보고 부드러워질 때까지.보통 3~5분 정도 걸린 다음 간을 자르고 접시에 넣고 가위로 작은 조각으로 자릅니다. 자주 위아래로 펩. 일반적으로 단일 셀로 만드는 데 10~15분이 걸립니다.그리고 10-15분 으로 위아래로 조절하고 피터를 통해 먹이를 주면 됩니다. 단일 셀로 만듭니다. 50 밀리리터 튜브의 모든 세포를 수집하고, 경심분리, 속도와 함께 다음 플레이트 당 모든 수집.차가운 얼음에 항상 그들을 유지하려고합니다. 단일 셀 현탁액을 만들고 셀 카운터로 계산합니다. 일반적으로 행복 하면 간 세포, 그것은 활기찬 형광.두 번째 부분, 우리는 세포를 앉아서 오르가노이드 문화를하려고합니다. 우리는 모든 세포 현탁액을 수집하고 특정 concentro-fusion으로 세포를 계산한 다음 혼합합니다. 메트로겔스. 및 코드 매체.보통 우리는 매체와 메트로겔을 1 대 2 또는 1 또는 3의 비율로 취합니다. 조심스럽게 혼합 한 후, 우리는 그라데이션 플레이트에 앉아. 우리는 일반적으로 잘 24 접시에 100 마이크로 리터를 추가합니다.37도의 온도에서 인큐베이터에 넣어. 20분 후, 우리는 바닥으로 앞뒤로 놓은 다음 매체에서 진행합니다. 2~3일 동안 대응하면 보통 오르가노이드가 나오는 것을 볼 수 있습니다.이것은 우리의 오르가노이드의 전형적인 이미지입니다. 우리는 일반적으로 우리가 통로를 하거나 몇몇 유전 수정 방법을 하고 싶은 경우에 오르가노이드에서 단 하나 세포가 필요합니다 우리는 코트 세척 버퍼를 가진 카운터 플레이트에서 모든 오르가노이드를 수집합니다. 우리는 상체를 떨어 뜨린 다음 코트 워시 버퍼를 접시에 넣고 섞어 위아래로 섞습니다.그리고 우리는 일반적으로 워시 테이프 버퍼로 모든 팁을 미리 씻습니다. 모든 오르가노이드팁을 피하기 위해 팁에 팁을 줍니다. 그리고 얼음에 새로운 배치또는 얼음없이, 우리는 센트로 융합에 의해 모든 오르가노이드를 수집합니다.우리는 그들을 치료, 모든 메트로겔을 제거하는 속이는 radients이있다. 얼음에 잠복20~30분 후에 모든 메트로겔이 제거됩니다. 우리는 모든 깨끗한 오르가노이드를 수집하고 트립신을 추가하여 단일 세포로 만듭니다.트립신이 추가된 후, 우리는 인큐베이터로 오르가노이드를 치료합니다. 간 오르가노이드가 단일 세포가 되는 데는 5~10분이 걸립니다. 우리는 삼중을 중지하기 위해 더 많은 세척 버퍼를 추가합니다.그리고 그들을 향해 위아래로 그것을 pep. 옵션 프로세스의 경우 모든 트립신을 제거하기 위해 한 번 더 씻을 수 있습니다. 중혈으로 씻은 후, 우리는 세포 카운터에서 계산할 수 있습니다.그런 다음 이러한 간세포 오르간노이드의 거래 또는 트랜스페션을 수행하는 방법을 보여줍니다. 첫째, 당신이 할 일의 튜브에 라벨을 지정하고, 우리는 제조 업체의 지시에 따라 시력 트랜스펙트를 할 것입니다. 당신은 리포일 사실 길들이기 INI MaX의 섭정이 필요합니다.우리는 추가합니다. 제조 업체의 지시에 따라 제어 및 특정 유전자 siRNA, 최적의 으로 그들을 배양. 그리고 세포 농도에 따라 우리는 RAN 최대를 추가하고 철저하게 혼합합니다.그런 다음 최적의 RAN max를 별도로 추가하고 얼음위에 놓습니다. 5 분 후, 우리는 다른 siRNAs, 특정 유전자 RANi 및 II 제어와 별도의 RAN 최대 혼합물을 펩과 철저하게 혼합. 다시 얼음에 넣어, 우리는 모든 오르가노이드를 수집, 느린 중심 투과, 모든 슈퍼 나티컬을 드롭, 우리는 RNAi 최대를 추가, 이 세포 판에 siRNA 혼합물을 추가하고 철저하게 위아래로 펩.간략하게, 세포 및 레이블 RNAi 최대 및 siRNA 혼합물은 37도에서 4 5 시간 동안 젠트리피케이션 및 인큐베이션하였다. 마지막 부분, 이 간세포 오르간노이드는 또한 렌티 바이러스에 의해 감염될 수 있었습니다. 유사한 메시지는 siRNA 형질전환으로 수행되었다.대조군과 siRNA 바이러스 튜브는 잘 준비되었고, 제조 업체의 지시에 따라 최적의 튜브가 추가되었습니다. 그런 다음 폴리 그린과 같은 감염 부위와 함께 제조업체의 지침 체에 따라 다른 Lenti 바이러스를 추가합니다. 1.5 밀리리터 eppendorf 튜브에서 오르가노이드 배양 및 다양한 입자에 단일 세포 현탁액을 결합하여 이 혼합물을 혼합하고 32도에서 1 시간 동안 농축합니다.농축융합은 500G.에서 수행되며, 4~5시간 배양 후 37도에서 세포 현탁액을 수집하고 메트로겔에 앉게 된다. 그리고 다시 인큐베이터에 넣어. 형성 효율 또는 기타 기능 분석에 대한 기관은 7~10일 후에 수행될 수 있다.다음은 우리의 대표적인 결과입니다. 그림 1A에서, 당신은 마우스에서 우리의 ALB-Cre Rosa 26-GFP 또는 RFP 간세포 오르간로이드를 볼 수 있었습니다. 그림 1B에서 당신은 우리의 간세포 오르간이 확산되는 것을 보여 주었다 염색에 Ki67 긍정적 인 신호를 볼 수 있습니다.그림 2A 및 2B에서 여기에서 우리의 유전자의 우리의 간섭발현의 대표적인 유전자 발현입니다. 간세포 에서 유전 조작 후 오르가노이드, 간섭 효과적인 매우 효율적입니다. 여기에 그림 2C입니다, 당신은 우리의 뮤린 오르가노이드에서 카슨 기술로 유전자 조작 후 볼 수 있습니다.결론, 우리의 결과는 간세포 오르가노이드가 시험관내에서 확장되고 유전적으로 조작될 수 있었다는 것을 보여주었습니다. 요약하자면, 이 비디오에서는 간 관류와 소화를 통해 간 세포에 대한 방법을 보여줍니다. 간세포를 포착하고 간세포 가구를 통과하는 방법.또한, 우리는 이러한 오르가노이드의 유전적 수정을 하기 위해 siRNA 및 벡터 형질 또는 렌티 바이러스 감염을 수행하는 방법을 보여 주었다. 또한, 우리는 우리의 오르가노이드에 두 가지 부족이있다. 첫째, 우리는 간세포를 순수하게 하기 위해 코어 또는 모피 코어당 사용하지 않았습니다.둘째, 더 많은 성장 인자와 시그널링이 성장하는 오르가노이드를 개선하기 위해 노력해야 한다고 생각합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

조기 칙 태아 예 생체내 (새로운 문화)의 문화에 대한 방법

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

연구

생물학

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

조기 칙 태아의 현장 하이브리드화에서 더블 전체 산

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

공촛점 이미징에 대한 분리 및 성인 심장 Myocytes의 유전자 조작

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA 일렉트로, 근섬유의 분리 및 이미징

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation

마우스 원발성 간세포 분리를 위한 개선된 시간 및 노동력 효율적인 프로토콜

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on ...

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

반응성 산소 종 에 민감한 불소 성 프로브를 사용하여 뮤린 장 오르가노이드의 산화 스트레스 분석

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

The Establishment of a Murine Mandibular Molar Extraction Socket Healing Model

쥐 하악 어금니 추출 소켓 치유 모델 구축

This study introduces the development of a molar extraction model in the murine mandible to provide a practicable model for studying alveolar bone ...

Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids

마우스 및 인간 눈물샘 오가노이드의 확립, 유지, 분화, 유전자 조작 및 이식

The lacrimal gland is an essential organ for ocular surface homeostasis. By producing the aqueous part of the tear film, it protects the eye from ...

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Ex Vivo (생체 외 ) 폴리비닐 알코올 기반 배양에서 마우스 조혈 줄기 세포의 확장 및 유전자 조작

Self-renewing&#160;multipotent&#160;hematopoietic stem cells (HSCs) are an important cell type due to their abilities to support hematopoiesis throughout ...

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

냉동보존된 상피선와에서 새끼돼지 장 3D 오가노이드의 배양 및 세포 단층 확립

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...