Name: establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids
Uploaded: 2022-02-12T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids at JoVE.com

Vi takker professor Hans Clevers for vennlig å gi cellelinjene for å produsere rekombinant R-spondin1. Dette arbeidet ble støttet av bevilgningene fra National Key R&D Program of China (2019YFA0111400), National Natural Science Foundation of China (31970779) til H.H., og Funds for Youth Interdisciplinary and Innovation Research Group of Shandong University (2020QNQT003) til H.H.

Alle museeksperimenter ble godkjent av Dyrepleie- og brukskomiteen ved School of Basic Medical Sciences ved Shandong University og ble utført i henhold til lisensen i henhold til hjemmekontor retningslinjer og forskrifter (Nei. ECSBMSSDU2019-2-079).
MERK: Denne protokollen brukes hovedsakelig til å dyrke 3D-organoider fra isolerte primære hepatocytter.
1. Etablering av Murine Hepatocyte Organoid Culture
MERK: Ekstracellulær matrise som ...

<ol>
	<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 124-125 (2014).</li><li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+regenerative+medicine:+organogenesis+from+stem+cells+in+3D+culture.">Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Paola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+brain+organoids+reproducibly+form+cell+diversity+of+the+human+cerebral+cortex.">Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex.</a> Nature. 570, 523-527 (2019).</li><li>Atsuhiro, T., Ryuichi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-Order+Kidney+Organogenesis+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Higher-Order Kidney Organogenesis from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Wang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Expansion+of+Pancreatic+Islet+Organoids+from+Resident+Procr+++Progenitors.">Long-Term Expansion of Pancreatic Islet Organoids from Resident Procr + Progenitors.</a> Cell. 180 (6), 1198-1211 (2020).</li><li>Jarno, D., Hans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18, 407-418 (2018).</li><li>Hans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Forbes, S. J., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration-mechanisms+and+models+to+clinical+application.">Liver regeneration-mechanisms and models to clinical application.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13 (8), 473-485 (2016).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Expansion+of+Primary+Human+Hepatocytes+with+Efficient+Liver+Repopulation+Capacity.">In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 806-819 (2018).</li><li>Katsuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+Terminally+Committed+Hepatocytes+to+Culturable+Bipotent+Progenitor+Cells+with+Regenerative+Capacity.">Conversion of Terminally Committed Hepatocytes to Culturable Bipotent Progenitor Cells with Regenerative Capacity.</a> Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).</li><li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Expansion+of+Functional+Mouse+and+Human+Hepatocytes+as+3D+Organoids.">Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li><li>Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Cytokine+TNFalpha+Promotes+the+Long-Term+Expansion+of+Primary+Hepatocytes+in+3D+Culture.">Inflammatory Cytokine TNFalpha Promotes the Long-Term Expansion of Primary Hepatocytes in 3D Culture.</a> Cell. 175 (6), 1607-1619 (2018).</li><li>Xiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+maintenance+of+primary+human+hepatocytes+in+vitro.">Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro.</a> Science. 364 (6438), 399-402 (2019).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver.">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocol. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li></ol>

Evnen til å dyrke modne hepatocytter over lange perioder er grunnleggende for å studere leverens grunnleggende vitenskap, narkotikatoksikologi og hepatotrope vertsmikrobiologiske infeksjoner som malaria og hepatittvirus. Med en veldefinert nisje setter protokollen her opp et kultursystem for hepatocytter. Denne protokollen driver modne hepatocytter til å ekspandere i 3D-kultur med en heterogenitet som rekapitulerer cellecelleinteraksjon, de fleste hepatocyttfunksjon og genetiske modifikasjoner, slik at utformingen av ...

Organoider er selvorganiserte, tredimensjonale (3D) in vitro-klynger som inkluderer selvfornyende stamceller og flerlinjede differensierte celler1,2. Organoidene i mange organer har blitt etablert enten fra pluripotente eller voksne stamceller av veldefinerte nisjefaktorer, inkludert tarmen, hjernen, tykktarmen, nyrene, leveren, bukspyttkjertelen, skjoldbruskkjertelen, magen, huden og lungen3,4,5,6,7 . Organoidene rekapitulerer fysiske cellefunksjoner ved å etterligne enten utvikling (stammer fra embryonale eller induserte pluripotente stamceller, PSCer) eller homeostase/regenereringsprogresjon (stammer fra voksne stamceller, ASC), som åpner nye veier i sykdomsforskning og terapi8,9.
Som det største organet i pattedyr er leveren hovedsakelig ansvarlig for lagring, metabolisme og avgiftning. To typer epitelceller, hepatocytter og cholangiocytter, konstruerer den grunnleggende enheten av en leverlobul. Hepatocytter er ansvarlige for 70-80% leverfunksjon10. Selv om leveren har bemerkelsesverdig regenereringskapasitet, skjer raskt tap av hepatocyttfunksjoner under tradisjonell monolayerkultur ved dysregulert cellepolarisering og dedifferentiasjon, noe som øker behovet for forskere og klinikere for å bygge "gap-brobygging" levermodeller i en tallerken. Inntil nylig hadde imidlertid ex vivo-utvidelsesmodellene fra primære hepatocytter ikke blitt godt etablert11,12,13,14,15. Leverorganoider kan etableres fra embryonale/induserte pluripotente stamceller, fibroblastkonvertering til hepatocyttlignende celler og vevsavledede celler. Utviklingen av leverorganoider øker anvendelsen av en in vitro-modell for legemiddelskjermer og levertoksisitetsanalyser16,17.
Her beskriver vi en detaljert protokoll for etablering av leverorganoider fra murin primære hepatocytter. Ved å bruke denne protokollen setter vi opp et in vitro kultursystem av hepatocytt organoider med to perfusjoner av kollagenalus. Disse organoidene kan passeres for langsiktig ekspansjon i flere måneder. Deres fysiologiske funksjon er svært konsistent med hepatocytter. Videre gir vi også en detaljert beskrivelse av hvordan man utfører genetisk manipulasjon, for eksempel lentivirusinfeksjon, siRNA-transduksjon og CRISPR-Cas9-ingeniørarbeid ved hjelp av organoider. Forplantningen av hepatocyttorganoider kaster lys over muligheten for å bruke organoider for å forstå leverbiologi og utvikle personlige og translasjonelle medisintilnærminger.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Perfusion Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A600077-0100</td>
			<td>3.50 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100188-0500</td>
			<td>9.00 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100395-0500</td>
			<td>4.00 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>1.51 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501218-0001</td>
			<td>80.0 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A610404-0500</td>
			<td>0.78 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A500873-0500</td>
			<td>3.50 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100882-0025</td>
			<td>0.06 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501330-0005</td>
			<td>0.50 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1639</td>
			<td>0.10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>C621110-0010</td>
			<td>23.80 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100395-0500</td>
			<td>4.00 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>1.51 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501218-0001</td>
			<td>80.0 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A610404-0500</td>
			<td>0.78 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A500873-0500</td>
			<td>3.50 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip-wash Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10091148</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C14190500BT0</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>&#160;A600135-0025</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>Stock concentration 500 &#181;M, final 
			concentration 2 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement 50x, minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1704-044</td>
			<td>50 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chir 99021</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td>Stock concentration 30 mM, final 
			concentration 3 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330032</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin I</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3006</td>
			<td>Stock concentration 100 mM, final 
			concentration 10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel martix</td>
			<td>BD</td>
			<td>356231</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Stock concentration 500 mM, final 
			concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nictinamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>&#160;A600135-0025</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml,final concentration 50 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human HGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 25 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TGF-&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-16A</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-&#945;</td>
			<td>Origene</td>
			<td>TP750007-1000</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho kinase inhibitor Y-27632</td>
			<td>Abmole Bioscience</td>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspondin-1conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPT01RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 # silicone tube</td>
			<td>LangerPump</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well, suspension</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>GN662102-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C Water Bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m filter</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>stemcell</td>
			<td>AT-104</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CTNNB1</td>
			<td>BD</td>
			<td>610154</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH</td>
			<td>CST</td>
			<td>5174S</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HDAC7</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab50212</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KI67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15580</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>542700097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>AC2-4S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>&#160;A100231</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Color Imaging Systems</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AME4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hdac3 siRNA</td>
			<td>Guangzhou RiboBio Co., Ltd.</td>
			<td>siG2003180909192555</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hdac7 lentivirus</td>
			<td>ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd</td>
			<td>LV2020-2364</td>
			<td>stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitrans G A</td>
			<td>Shanghai Genechem Co.,Ltd.</td>
			<td>REVG004</td>
			<td>Increased virus infection efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Pro Plus software</td>
			<td>Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>version 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778150</td>
			<td>Increased virus infection efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live cell dye</td>
			<td>Luna</td>
			<td>F23001</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-speed desktop centrifuge</td>
			<td>cence</td>
			<td>TD5A-WS/TD5AWS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofactor-&#945; 2b Device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>F621006-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>LangerPump</td>
			<td>BT100-2J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Activate with methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX458</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>48138</td>
			<td>stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific Heraeus</td>
			<td>Labofuge 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSL3</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-100218A</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 4 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibico</td>
			<td>25200072</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wee1 siRNA</td>
			<td>Guangzhou RiboBio Co., Ltd.</td>
			<td>siG2003180909205971</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids

Leveren er det største organet i pattedyr. Det spiller en viktig rolle i glukoselagring, proteinsekresjon, metabolisme og avgiftning. Som eksekutor for de fleste leverfunksjonene har primære hepatocytter begrenset spredningskapasitet. Dette krever etablering av ex vivo hepatocyte ekspansjonsmodeller for leverfysiologisk og patologisk forskning. Her isolerte vi murine hepatocytter med to trinn collagenase perfusjon og etablerte en 3D organoid kultur som "mini-leveren" for å rekapitulere cellecelleinteraksjoner og fysiske funksjoner. Organoidene består av heterogene cellepopulasjoner, inkludert forfedre og modne hepatocytter. Vi introduserer prosessen i detalj for å isolere og kultur murine hepatocytter eller føtal hepatocytt for å danne organoider innen 2-3 uker og vise hvordan du passerer dem ved mekanisk pipettering opp og ned. I tillegg vil vi også introdusere hvordan du fordøyer organoidene i enkeltceller for lentivirusinfeksjon av shRNA / ektopisk konstruksjon, siRNA-transfeksjon og CRISPR-Cas9-ingeniørarbeid. Organoidene kan brukes til legemiddelskjermer, sykdomsmodellering og grunnleggende leverforskning ved modellering av leverbiologi og patobiologi.

Hepatocytt organoider fra kvinnelige Alb-Cre; Rosa26-GFP-mus (8 uker) ble observert fem dager etter sådd (figur 1A). Organoidene sprer seg med Ki67 positiv farging (figur 1B). Forstyrrende uttrykk for representative gener i hepatocyttorganoider enten ved siRNA-transfeksjon eller lentivirusinfeksjon ble undersøkt av qRT-PCR og vestlig blot. Resultatene er vist i figur 2A og 2B. Figur 2C</strong...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids at JoVE.com

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

Et langsiktig ex vitro 3D organoid kultursystem ble etablert fra musen hepatocytter. Disse organoidene kan passeres og genetisk manipuleres ved lentivirusinfeksjon av shRNA / ektopisk konstruksjon, siRNA-transfeksjon og CRISPR-Cas9-ingeniørarbeid.

Etablering og genetisk manipulering av murin hepatocytt organoider

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

Leveren er det største organet i pattedyr. Det spiller svært viktig rolle i metabolisme og avgiftning. Selv om leveren har en bemerkelsesverdig regenereringskapasitet in vitro, er det fortsatt en veldig stor utfordring på lang sikt til kultur hepatocytt in-vitro.Her etablerer vi hepatocytter organoider fra modne hepatocytter. Det holder hovedtrekk ved hepatocytter i morfologi og funksjon. I denne videoen vil vi introdusere hvordan du kan kultur og passere disse organoidene og hvordan du utfører den genetiske modifikasjonen av disse organoidene i detaljer.For det første leverperfusjon og fordøyelse. Forbered alle regionene og instrumentene og gjør dem sterile. Vask musen og åpne epidermal og huden, og prøv deretter å finne posen ovnen i leveren.Injiser nålene i den, og ta deretter dette. Gjør perfusjonen med en hastighet på fem milliliter per minutt, til leveren blir blek. Endre dem til perfusjonsbufferen, plasser forsiktig, se på leveren, til den blir myk.Vanligvis tar det tre til fem minutter, Klipp deretter leveren og legg dem i platene, og kutt dem i små biter med saksen. Pep det opp og ned ofte. Vanligvis tar det 10 til 15 minutter å gjøre dem til enkeltcellen.Og pep det opp og ned med 10 til 15 minutter og mate dem gjennom montøren. Gjør dem til enkeltcellene. Samle alle cellene i 50 milliliterrøret, og sentrifuger dem, med hastigheten og samle deretter alle per platene.Prøv å holde dem alltid i den kalde isen. Lag enkeltcellesuspensjonene, og tell dem med celletelleren. Vanligvis hepatocyttene hvis de er glade, har den den livlige fluorescerende.Den andre delen prøver vi å sitte cellene og gjøre organoidkulturen. Vi samler alle cellene suspensjoner, og teller cellene med en viss concentro-fusion Og så blander vi. Metrogeler. og kodemediet.Vanligvis tar vi, med mediet og metrogelene, i forholdet 1 til 2 eller 1 til 3. Etter å ha blandet dem forsiktig, sitter vi dem på gradientplatene. Vi legger vanligvis til 100 mikroliter på 24-platebrønnen.Sett dem inn i inkubatoren ved en temperatur på 37 grader. Etter 20 minutter legger vi dem bakover fremover med bunnen nederst og deretter på mediet. Med to eller tre dager motarbeid ser vi vanligvis organoidene komme ut.Dette er det typiske bildet av organoidene våre. Vi trenger vanligvis enkeltceller fra organoider hvis vi vil gjøre passasjen eller gjøre noen genetisk modifikasjonsmetode Vi samler alle organoidene fra motplatene med frakkvaskbufferen. Vi slipper supernatanten, deretter ved frakkvaskbufferen inn i platen, bland dem, så pep det opp og ned.Og så forhåndsvasker vi vanligvis alle tipsene med vaskebåndbufferen. For å unngå at alle organoidene tipper på spissene. Og så med, en ny batch på is eller uten den, samler vi alle organoidene ved centro-fusion.Vi behandler dem, det er en conning radients å fjerne alle metrogels. Etter 20 til 30 minutter med inkubasjon på is fjernes alle metrogelene. Vi samler alle de rene organoidene og legger til trypsin for å gjøre dem til enkeltceller.Etter at trypsin er tilsatt, behandler vi organoidene i inkubatoren. Det tar 5 til 10 minutter for leverorganoider å bli enkeltceller. Vi legger til flere vaskebuffere for å stoppe triplatin.Og så pep det opp og ned mot dem. For alternativprosess kan du vaske dem en gang til for å fjerne alle trypsin. Etter vask ved sentrofusjon kan vi telle dem under celledisken.Da vil vi vise hvordan du gjør transaksjon eller transfeksjon av disse hepatocytter organoider. Først merker du rørene til hva du skal gjøre, og så gjør vi synstransfeksjonen i henhold til produsentens instruksjoner. Du trenger, regenten av lipoyl faktum taming INI MaX.Vi legger til. kontroll og det spesifikke genet siRNA, og inkuber dem med det optimale, i henhold til produsentens instruksjoner. Og så i henhold til cellekonsentrasjonen legger vi til RAN max og blander dem grundig.Deretter legger vi også til RAN max med det optimale separat og legger dem på is. Etter 5 minutter pep opp separat RAN max blanding med forskjellige siRNAer, Spesifikk gen RANi og II kontroll separat og bland dem grundig. Sett dem på is igjen, og så samler vi alle organoidene, langsom sentrofusjon, slipper alle supernatanten, vi legger til RNAi max, siRNA-blandingen i denne celleplaten og pep den opp og ned grundig.Kort sagt var cellene og etiketten RNAi max og siRNA-blanding gentrifisering og inkuberer i 4 til 5 timer ved 37 grader. Siste del, disse hepatocytter organoider kan også bli smittet av Lenti viruset. Den lignende meldingen ble utført som siRNA-transfeksjon.Kontrollen og siRNA-virusrørene var godt forberedt, og det optimale ble lagt til i henhold til produsentens instruksjoner. Deretter med infeksjonsregionene som polygrønn, og så legger vi til forskjellige Lenti-virus, i henhold til produsentens instruksjoner grunnlov. Kombiner enkeltcelle suspensjoner i organoider kultur og ulike partikler i 1,5 milliliter eppendorf rør, Legg til, vel, bland dem Plate denne blandingen, og konsentrer dem i 1 time ved 32 grader.Konsentratfusjonen vil bli utført ved 500 G.Og etter 4 til 5 timers inkubasjon ved 37 grader vil cellefjæringen deretter bli samlet og sittende i metrogel. Og legg dem i inkubatoren igjen. Organet på formasjonseffektiviteten eller annen funksjonell analyse kan utføres 7 til 10 dager senere.Her er våre representative resultater. I figur 1A kunne du se vår ALB-Cre Rosa 26-GFP eller RFP hepatocytter organoid fra musen. I figur 1B kunne du se Ki67 positivt signal i farging, som har vist at våre hepatocytter organoider sprer seg.I figur 2A og 2B her er et representativt genuttrykk for vårt forstyrrende uttrykk for genene våre. Etter genetisk manipulasjon i hepatocytter organoider, er den forstyrrende effektive svært effektiv. Her er figur 2C, du kan se etter genetisk manipulasjon med carsonittteknologi i våre murine organoider.Konklusjonen, våre resultater viste at hepatocytter organoider kunne utvides in vitro og genetisk manipulert. Oppsummert, i denne videoen viser vi hvordan du gjør leveren perfusjon og fordøyelse for å få hepatocytter. Hvordan fange hepatocyttene og passere hepatocytter organoider.Vi viste også hvordan du gjør siRNA og vektortransfeksjon eller Lenti virusinfeksjon for å gjøre modifikasjonen av genetikken til disse organoidene. Vi har også to mangler i organoidene våre. For det første brukte vi ikke per kjerne eller pelskjerne for å rense hepatocyttene.Og for det andre tror jeg flere vekstfaktorer og signalering bør prøves å forbedre organoidenes veksttid.

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Electroporation, Isolering og Imaging av Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation

En forbedret tids- og arbeidseffektiv protokoll for musens primære hepatocytisolasjon

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on ...

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

Analysere oksidativt stress i murine intestinale organoider ved hjelp av reaktive oksygenarter-sensitiv fluorogen sonde

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

The Establishment of a Murine Mandibular Molar Extraction Socket Healing Model

Etableringen av en murine mandibulær molar ekstraksjon socket healing modell

This study introduces the development of a molar extraction model in the murine mandible to provide a practicable model for studying alveolar bone ...

Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids

Etablering, vedlikehold, differensiering, genetisk manipulasjon og transplantasjon av mus og humane lakrimale kjertelorganoider

The lacrimal gland is an essential organ for ocular surface homeostasis. By producing the aqueous part of the tear film, it protects the eye from ...

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Eks Vivo Ekspansjon og genetisk manipulering av hematopoietiske stamceller fra mus i polyvinylalkoholbaserte kulturer

Self-renewing&#160;multipotent&#160;hematopoietic stem cells (HSCs) are an important cell type due to their abilities to support hematopoiesis throughout ...

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

Kultur av Piglet Intestinal 3D Organoids fra kryopreserverte epitelkrypter og etablering av cellemonolayers

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...