Name: establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids
Uploaded: 2022-02-12T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids at JoVE.com

Agradecemos ao Professor Hans Clevers por fornecer gentilmente as linhas celulares para produzir r-spondin1 recombinantes. Este trabalho foi apoiado pelas bolsas do Programa Nacional de P&D da China (2019YFA0111400), da Fundação Nacional de Ciência Natural da China (31970779) ao H.H., e do Grupo de Pesquisa Interdisciplinar e de Inovação da Juventude da Universidade de Shandong (2020QNQT003) ao H.H.

Todos os experimentos com camundongos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Escola de Ciências Médicas Básicas da Universidade de Shandong e foram realizados de acordo com a Licença sob as diretrizes e regulamentos do Home Office (No. ECSBMSSDU2019-2-079).
NOTA: Este protocolo é usado principalmente para cultivar organoides 3D de hepatócitos primários isolados.
1. Estabelecimento da Cultura Organoide Hepatocito Murine
<p class="jove_c...

<ol>
	<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 124-125 (2014).</li><li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+regenerative+medicine:+organogenesis+from+stem+cells+in+3D+culture.">Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Paola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+brain+organoids+reproducibly+form+cell+diversity+of+the+human+cerebral+cortex.">Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex.</a> Nature. 570, 523-527 (2019).</li><li>Atsuhiro, T., Ryuichi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-Order+Kidney+Organogenesis+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Higher-Order Kidney Organogenesis from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Wang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Expansion+of+Pancreatic+Islet+Organoids+from+Resident+Procr+++Progenitors.">Long-Term Expansion of Pancreatic Islet Organoids from Resident Procr + Progenitors.</a> Cell. 180 (6), 1198-1211 (2020).</li><li>Jarno, D., Hans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18, 407-418 (2018).</li><li>Hans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Forbes, S. J., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration-mechanisms+and+models+to+clinical+application.">Liver regeneration-mechanisms and models to clinical application.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13 (8), 473-485 (2016).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Expansion+of+Primary+Human+Hepatocytes+with+Efficient+Liver+Repopulation+Capacity.">In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 806-819 (2018).</li><li>Katsuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+Terminally+Committed+Hepatocytes+to+Culturable+Bipotent+Progenitor+Cells+with+Regenerative+Capacity.">Conversion of Terminally Committed Hepatocytes to Culturable Bipotent Progenitor Cells with Regenerative Capacity.</a> Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).</li><li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Expansion+of+Functional+Mouse+and+Human+Hepatocytes+as+3D+Organoids.">Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li><li>Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Cytokine+TNFalpha+Promotes+the+Long-Term+Expansion+of+Primary+Hepatocytes+in+3D+Culture.">Inflammatory Cytokine TNFalpha Promotes the Long-Term Expansion of Primary Hepatocytes in 3D Culture.</a> Cell. 175 (6), 1607-1619 (2018).</li><li>Xiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+maintenance+of+primary+human+hepatocytes+in+vitro.">Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro.</a> Science. 364 (6438), 399-402 (2019).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver.">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocol. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li></ol>

A capacidade de cultivar hepatócitos maduros por longos períodos é fundamental no estudo da ciência básica hepática, toxicologia medicamentosa e infecções hepatotrópicos de microbiologia hospedeira, como malária e vírus da hepatite. Com um nicho bem definido, o protocolo aqui cria um sistema de cultura para hepatócitos. Este protocolo leva hepatócitos maduros a expandir-se na cultura 3D com uma heterogeneidade que recapitula a interação célula-célula, a maioria da função hepatocita e modificações gen...

Organoides são aglomerados in vitro auto-organizados, tridimensionais (3D) que incluem células-tronco auto-renovadores e células diferenciadas multi-linhagem1,2. Os organoides de muitos órgãos foram estabelecidos a partir de células-tronco pluripotentes ou adultas por fatores de nicho bem definidos, incluindo o intestino, o cérebro, o cólon, o rim, o fígado, o pâncreas, a tireoide, o estômago, a pele e o pulmão3,4,5,6,7 . Os organoides recapitulam funções celulares físicas imitando o desenvolvimento (originário de células-tronco pluripotentes embrionárias ou induzidas, PSCs) ou progressão de homeostase/regeneração (originária de células-tronco adultas, ASCs), o que abre novos caminhos na pesquisa e terapia de doenças8,9.
Como o maior órgão dos mamíferos, o fígado é o principal responsável pelo armazenamento, metabolismo e desintoxicação. Dois tipos de células epiteliais, hepatócitos e cholangiocitos, constroem a unidade básica de um lobule hepático. Hepatócitos são responsáveis por 70-80% da função hepática10. Embora o fígado tenha notável capacidade de regeneração, a perda rápida de características hepatócidas acontece durante a cultura tradicional de monocamadas por polarização celular disregulada e dediferenciação, o que aumenta a necessidade de pesquisadores e médicos construirem modelos hepáticos de "ponte de lacunas" em um prato. No entanto, até recentemente, os modelos de expansão ex vivo dos hepatócitos primários não tinham sido bem estabelecidos11,12,13,14,15. Organoides hepáticos podem ser estabelecidos a partir de células-tronco pluripotentes embrionárias/induzidas, conversão de fibroblasto em células semelhantes a hepatócitos e células derivadas de tecidos. O desenvolvimento de organoides hepáticos aumenta a aplicação de um modelo in vitro para telas de drogas e ensaios de toxicidade hepática16,17.
Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para estabelecer organoides hepáticos de hepatócitos primários murinas. Usando este protocolo, criamos um sistema de cultura in vitro de organoides hepatocitos com duas perfusões de colagemnase. Esses organoides podem ser aprovados para expansão a longo prazo por meses. Sua função fisiológica é altamente consistente com hepatócitos. Além disso, também fornecemos uma descrição detalhada de como realizar manipulação genética, como infecção por lentivírus, transdução de siRNA e engenharia CRISPR-Cas9 usando organoides. A propagação de organoides hepatocitos esclareceu a possibilidade de usar organoides para entender a biologia hepática e desenvolver abordagens personalizadas e translacionais de medicina.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Perfusion Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A600077-0100</td>
			<td>3.50 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100188-0500</td>
			<td>9.00 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100395-0500</td>
			<td>4.00 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>1.51 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501218-0001</td>
			<td>80.0 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A610404-0500</td>
			<td>0.78 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A500873-0500</td>
			<td>3.50 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100882-0025</td>
			<td>0.06 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501330-0005</td>
			<td>0.50 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1639</td>
			<td>0.10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>C621110-0010</td>
			<td>23.80 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100395-0500</td>
			<td>4.00 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>1.51 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501218-0001</td>
			<td>80.0 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A610404-0500</td>
			<td>0.78 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A500873-0500</td>
			<td>3.50 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip-wash Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10091148</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C14190500BT0</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>&#160;A600135-0025</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>Stock concentration 500 &#181;M, final 
			concentration 2 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement 50x, minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1704-044</td>
			<td>50 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chir 99021</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td>Stock concentration 30 mM, final 
			concentration 3 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330032</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin I</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3006</td>
			<td>Stock concentration 100 mM, final 
			concentration 10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel martix</td>
			<td>BD</td>
			<td>356231</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Stock concentration 500 mM, final 
			concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nictinamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>&#160;A600135-0025</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml,final concentration 50 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human HGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 25 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TGF-&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-16A</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-&#945;</td>
			<td>Origene</td>
			<td>TP750007-1000</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho kinase inhibitor Y-27632</td>
			<td>Abmole Bioscience</td>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspondin-1conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPT01RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 # silicone tube</td>
			<td>LangerPump</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well, suspension</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>GN662102-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C Water Bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m filter</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>stemcell</td>
			<td>AT-104</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CTNNB1</td>
			<td>BD</td>
			<td>610154</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH</td>
			<td>CST</td>
			<td>5174S</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HDAC7</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab50212</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KI67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15580</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>542700097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>AC2-4S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>&#160;A100231</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Color Imaging Systems</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AME4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hdac3 siRNA</td>
			<td>Guangzhou RiboBio Co., Ltd.</td>
			<td>siG2003180909192555</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hdac7 lentivirus</td>
			<td>ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd</td>
			<td>LV2020-2364</td>
			<td>stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitrans G A</td>
			<td>Shanghai Genechem Co.,Ltd.</td>
			<td>REVG004</td>
			<td>Increased virus infection efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Pro Plus software</td>
			<td>Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>version 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778150</td>
			<td>Increased virus infection efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live cell dye</td>
			<td>Luna</td>
			<td>F23001</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-speed desktop centrifuge</td>
			<td>cence</td>
			<td>TD5A-WS/TD5AWS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofactor-&#945; 2b Device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>F621006-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>LangerPump</td>
			<td>BT100-2J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Activate with methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX458</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>48138</td>
			<td>stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific Heraeus</td>
			<td>Labofuge 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSL3</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-100218A</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 4 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibico</td>
			<td>25200072</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wee1 siRNA</td>
			<td>Guangzhou RiboBio Co., Ltd.</td>
			<td>siG2003180909205971</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids

O fígado é o maior órgão em mamíferos. Desempenha um papel importante no armazenamento de glicose, secreção de proteínas, metabolismo e desintoxicação. Como executor da maioria das funções hepáticas, hepatócitos primários têm capacidade de proliferação limitada. Isso requer o estabelecimento de modelos de expansão de hepatócitos ex vivo para pesquisa fisiológica e patológica hepática. Aqui, isolamos hepatócitos murinos por dois passos de perfusão de colagenase e estabelecemos uma cultura organoide 3D como o "mini-fígado" para recapitular interações célula-células e funções físicas. Os organoides consistem em populações de células heterogêneas, incluindo progenitores e hepatócitos maduros. Introduzimos o processo de forma detalhada para isolar e cultivar os hepatócitos murinos ou hepatócitos fetais para formar organoides dentro de 2-3 semanas e mostrar como passá-los mecanicamente tubos para cima e para baixo. Além disso, também introduziremos como digerir os organoides em células únicas para infecção por lentivírus de construção shRNA/ectópica, transfecção de siRNA e engenharia CRISPR-Cas9. Os organoides podem ser usados para telas de drogas, modelagem de doenças e pesquisa hepática básica, modelando biologia hepática e patobiologia.

Os organoides hepatocits do fêmea Alb-Cre; O rato Rosa26-GFP (8 semanas) foi observado cinco dias após a semeadura (Figura 1A). Os organoides estão proliferando com a coloração positiva ki67 (Figura 1B). A expressão de interferência de genes representativos em organoides hepatocitos, seja por transfecção de sirna ou infecção por lentivírus, foi examinada por qRT-PCR e mancha ocidental. Os resultados são mostrados nas Figuras 2A<...

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Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

Um sistema de cultura organoide 3D ex vitro de longo prazo foi estabelecido a partir de hepatócitos de camundongos. Esses organoides podem ser passagemdos e geneticamente manipulados por infecção por lentivírus de construção shRNA/ectópica, transfecção de siRNA e engenharia CRISPR-Cas9.

Estabelecimento e Manipulação Genética de Organoides Hepatocitos De Murine

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

O fígado é o maior órgão dos mamíferos. Desempenha um papel muito importante no metabolismo e na desintoxicação. Embora o fígado tenha uma notável capacidade de regeneração in vitro, ainda é um desafio muito grande para um longo prazo cultivar hepatócito in vitro.Aqui, estabelecemos os organoides hepatócitos de hepatócitos maduros. Mantém as principais características dos hepatócitos na morfologia e na função. Neste vídeo, vamos introduzir como cultivar e passar esses organoides e como realizar a modificação genética desses organoides em detalhes.Primeiro, perfusão hepática e digestão. Prepare todas as regiões e os instrumentos e os torne estéreis. Lave o rato e abra o epidérmico e a pele, e depois tente encontrar o forno de bolsa do fígado.Injete as agulhas nele, e então capture isso. Faça a perfusão à velocidade de cinco mililitros por minuto, até que o fígado fique pálido. Transforme-os no tampão de perfusão, coloque cuidadosamente, observe o fígado, até que fique macio.Normalmente leva de três a cinco minutos, depois corte o fígado e coloque-os nas placas, e corte-os em pequenos pedaços com a tesoura. Pep-lo para cima e para baixo com frequência. Normalmente, leva de 10 a 15 minutos para transformá-los na única célula.E então pep-lo para cima e para baixo com 10 a 15 minutos e alimentá-los através do montador. Transformá-los nas células individuais. Colete todas as células no tubo de 50 mililitros, e centrífuga-as, com a velocidade e, em seguida, colete todas as placas por.Tente mantê-los sempre no gelo frio. Faça as suspensões de célula única e conte-as com o contador de células. Normalmente os hepatócitos se felizes, tem o fluorescente animado.Na segunda parte, tentamos sentar as células e fazer a cultura organoide. Coletamos todas as suspensões das células, e contamos as células com uma certa fusão de concentro e então misturamos a. Os Metrogels. e o meio de código.Normalmente tomamos, com o médio e os metrogels, na proporção de 1 a 2 ou 1 a 3. Depois de misturá-los cuidadosamente, sentamos-nos nas placas gradientes. Geralmente adicionamos 100 microliters na placa de 24 bem.Coloque-os na incubadora à temperatura de 37 graus. Depois de 20 minutos, nós os colocamos para frente com a parte inferior na parte inferior e, em seguida, no meio. Com dois ou três dias de combate, geralmente vemos os organoides saírem.Esta é a imagem típica de nossos organoides. Geralmente precisamos de células únicas de organoides se quisermos fazer a passagem ou fazer algum método de modificação genética Coletamos todos os organoides das placas de combate com o tampão de lavagem do casaco. Nós soltamos o supernatante, em seguida, no tampão de lavagem do casaco na placa, misture-os, então pep-lo para cima e para baixo.E então nós geralmente pré-lavar todas as pontas com o buffer de fitas de lavagem. Para evitar que todos os organoides caiam nas pontas. E então, com um novo lote no gelo ou sem ele, coletamos todos os organoides por centro-fusão.Nós os tratamos, há um radients conivente para remover todos os metrogels. Após 20 a 30 minutos de incubação no gelo todos os metrogel são removidos. Coletamos todos os organoides limpos e adicionamos trippsina para transformá-los em células únicas.Depois que a trippsina é adicionada, tratamos os organoides na incubadora. Leva de 5 a 10 minutos para os organoides hepáticos se tornarem células únicas. Adicionamos mais tampões de lavagem para parar a triplatina.E, em seguida, pep-lo para cima e para baixo em direção a eles. Para o processo de opção, você pode lavá-los mais uma vez para remover toda a trippsina. Depois de lavar por centrofusão, podemos contá-los sob o balcão de células.Então vamos mostrar como fazer transação ou transfecção desses organoides hepatócitos. Primeiro, rotule os tubos do que você vai fazer, e então faremos a transfecção da visão de acordo com as instruções do fabricante. Você precisa.do regente do fato lipoyl domando INI MaX.Nós adicionamos o. controlar e o gene específico siRNA, e incuba-los com o melhor, de acordo com as instruções do fabricante. E então, de acordo com a concentração celular, adicionamos o RAN max e os misturamos bem.Em seguida, também adicionamos o RAN max com o ideal separadamente e colocá-los no gelo. Após 5 minutos, nós criamos a mistura ran max separada com diferentes siRNAs, gene ESPECÍFICO RANi e II controle separadamente e misturamos-os completamente. Coloque-os no gelo novamente, e então coletamos todos os organoides, centrofusão lenta, largamos todo o supernatante, adicionamos o RNAi max, a mistura de siRNA nesta placa celular e o arrastamos para cima e para baixo completamente.Resumidamente, as células e o rótulo RNAi max e siRNA misturam foram gentrificação e incubam por 4 a 5 horas a 37 graus. Parte final, esses organoides hepatócitos também podem ser infectados pelo vírus Lenti. A mensagem semelhante foi realizada como transfecção do siRNA.O controle e os tubos do vírus siRNA estavam bem preparados, e o ideal foi adicionado de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, com as regiões de infecção como poli verde e, em seguida, adicionamos diferentes vírus Lenti, de acordo com a constituição de instruções do fabricante. Combine as suspensões de células únicas na cultura organoides e várias partículas nos tubos eppendorf de 1,5 mililitros, Adicione, bem, misture-os Emplacando esta mistura, e concentre-os por 1 hora a 32 graus.A fusão do concentrado será realizada a 500 G.E após 4 a 5 horas de incubação a 37 graus a suspensão da célula será então coletada e sentada em metrogel. E colocá-los na incubadora novamente. O órgão sobre a eficiência de formação ou outra análise funcional poderia ser realizado de 7 a 10 dias depois.Aqui estão nossos resultados representativos. Na figura 1A, você pode ver nosso ALB-Cre Rosa 26-GFP ou RFP hepatócitos organoide de camundongo. Na figura 1B você pode ver o sinal positivo ki67 na coloração, que mostrou que nossos organoides hepatócitos estão proliferando.Na figura 2A e 2B aqui está uma expressão genética representativa de nossa expressão interferente de nossos genes. Após a manipulação genética em organoides hepatócitos, o eficaz de interferência é muito eficiente. Aqui está a figura 2C, você pode ver depois da manipulação genética com a tecnologia carsonita em nossos organoides murinas.Conclusão, nossos resultados mostraram que os organoides hepatócitos poderiam ser expandidos in vitro e geneticamente manipulados. Em resumo, neste vídeo mostramos como fazer a perfusão e digestão hepática para obter os hepatócitos. Como capturar os hepatócitos e passagem dos hepatócitos organoides.Além disso, mostramos como fazer a infecção pelo siRNA e transfecção vetorial ou pela infecção pelo vírus Lenti para fazer a modificação da genética desses organoides. Além disso, temos duas escassez em nossos organoides. Primeiro, não usamos por núcleo ou núcleo de pele para puro os hepatócitos.E segundo, acho que mais fatores de crescimento e sinalização devem ser tentados para melhorar o tempo de crescimento dos organoides.

Research

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