Name: establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids
Uploaded: 2022-02-12T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids at JoVE.com

Мы благодарим профессора Ханса Клеверса за любезное предоставление клеточных линий для получения рекомбинантного R-спондина1. Эта работа была поддержана грантами Национальной ключевой программы исследований и разработок Китая (2019YFA0111400), Национального фонда естественных наук Китая (31970779) для H.H. и Группы междисциплинарных и инновационных исследований Фондов для молодежи Шаньдунского университета (2020QNQT003) до H.H.

Все эксперименты на мышах были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Школы фундаментальных медицинских наук в Шаньдунском университете и проводились в соответствии с лицензией в соответствии с руководящими принципами и правилами Министерства внутренних дел (No. ...

<ol>
	<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 124-125 (2014).</li><li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+regenerative+medicine:+organogenesis+from+stem+cells+in+3D+culture.">Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Paola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+brain+organoids+reproducibly+form+cell+diversity+of+the+human+cerebral+cortex.">Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex.</a> Nature. 570, 523-527 (2019).</li><li>Atsuhiro, T., Ryuichi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-Order+Kidney+Organogenesis+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Higher-Order Kidney Organogenesis from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Wang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Expansion+of+Pancreatic+Islet+Organoids+from+Resident+Procr+++Progenitors.">Long-Term Expansion of Pancreatic Islet Organoids from Resident Procr + Progenitors.</a> Cell. 180 (6), 1198-1211 (2020).</li><li>Jarno, D., Hans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18, 407-418 (2018).</li><li>Hans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Forbes, S. J., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration-mechanisms+and+models+to+clinical+application.">Liver regeneration-mechanisms and models to clinical application.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13 (8), 473-485 (2016).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Expansion+of+Primary+Human+Hepatocytes+with+Efficient+Liver+Repopulation+Capacity.">In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 806-819 (2018).</li><li>Katsuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+Terminally+Committed+Hepatocytes+to+Culturable+Bipotent+Progenitor+Cells+with+Regenerative+Capacity.">Conversion of Terminally Committed Hepatocytes to Culturable Bipotent Progenitor Cells with Regenerative Capacity.</a> Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).</li><li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Expansion+of+Functional+Mouse+and+Human+Hepatocytes+as+3D+Organoids.">Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li><li>Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Cytokine+TNFalpha+Promotes+the+Long-Term+Expansion+of+Primary+Hepatocytes+in+3D+Culture.">Inflammatory Cytokine TNFalpha Promotes the Long-Term Expansion of Primary Hepatocytes in 3D Culture.</a> Cell. 175 (6), 1607-1619 (2018).</li><li>Xiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+maintenance+of+primary+human+hepatocytes+in+vitro.">Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro.</a> Science. 364 (6438), 399-402 (2019).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver.">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocol. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li></ol>

Способность культивировать зрелые гепатоциты в течение длительных периодов времени имеет основополагающее значение для изучения фундаментальной науки о печени, токсикологии лекарств и гепатотропных микробиологических инфекций, таких как малярия и вирусы гепатита. Имея четко опред?...

Органоиды представляют собой самоорганизованные, трехмерные (3D) кластеры in vitro, которые включают самообновляющиеся стволовые клетки и многолинейные дифференцированные клетки1,2. Органоиды многих органов были установлены либо из плюрипотентных, либо из взрослых стволовых клеток с помощью четко определенных нишевых факторов, включая кишечник, мозг, толстую кишку, почки, печень, поджелудочную железу, щитовидную железу, желудок, кожу и легкие3,4,5,6,7 . Органоиды рекапитулируют функции физических клеток, имитируя либо развитие (происходящее из эмбриональных или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, PSC), либо прогрессирование гомеостаза / регенерации (происходящее из взрослых стволовых клеток, ASC), что открывает новые возможности в исследованиях и терапии заболеваний8,9.
Как самый большой орган у млекопитающих, печень в основном отвечает за хранение, метаболизм и детоксикацию. Два типа эпителиальных клеток, гепатоциты и холангиоциты, конструируют основную единицу дольки печени. Гепатоциты отвечают за 70-80% функции печени10. Хотя печень обладает замечательной способностью к регенерации, быстрая потеря особенностей гепатоцитов происходит во время традиционного монослойного культивирования путем дисрегулируемой поляризации клеток и дедифференциации, что увеличивает потребность исследователей и клиницистов в построении моделей печени в чашке. Однако до недавнего времени модели расширения ex vivo из первичных гепатоцитов не были хорошо установлены11,12,13,14,15. Органоиды печени могут быть установлены из эмбриональных / индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, превращения фибробластов в гепатоцитоподобные клетки и клеток тканевого происхождения. Развитие органоидов печени стимулирует применение модели in vitro для скрининга лекарств и анализов токсичности печени16,17.
Здесь мы опишем подробный протокол установления органоидов печени из первичных гепатоцитов мышей. Используя этот протокол, мы создали культуральную систему in vitro из органоидов гепатоцитов с двумя перфузиями коллагеназы. Эти органоиды могут быть пройдены для долгосрочного расширения в течение нескольких месяцев. Их физиологическая функция в значительной степени согласуется с гепатоцитами. Кроме того, мы также предоставляем подробное описание того, как выполнять генетические манипуляции, такие как лентивирусная инфекция, трансдукция siRNA и инженерия CRISPR-Cas9 с использованием органоидов. Распространение органоидов гепатоцитов пролило свет на возможность использования органоидов для понимания биологии печени и разработки персонализированных и трансляционных подходов к медицине.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Perfusion Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A600077-0100</td>
			<td>3.50 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100188-0500</td>
			<td>9.00 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100395-0500</td>
			<td>4.00 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>1.51 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501218-0001</td>
			<td>80.0 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A610404-0500</td>
			<td>0.78 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A500873-0500</td>
			<td>3.50 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100882-0025</td>
			<td>0.06 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501330-0005</td>
			<td>0.50 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1639</td>
			<td>0.10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>C621110-0010</td>
			<td>23.80 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100395-0500</td>
			<td>4.00 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>1.51 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501218-0001</td>
			<td>80.0 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A610404-0500</td>
			<td>0.78 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A500873-0500</td>
			<td>3.50 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip-wash Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10091148</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C14190500BT0</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>&#160;A600135-0025</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>Stock concentration 500 &#181;M, final 
			concentration 2 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement 50x, minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1704-044</td>
			<td>50 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chir 99021</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td>Stock concentration 30 mM, final 
			concentration 3 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330032</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin I</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3006</td>
			<td>Stock concentration 100 mM, final 
			concentration 10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel martix</td>
			<td>BD</td>
			<td>356231</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Stock concentration 500 mM, final 
			concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nictinamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>&#160;A600135-0025</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml,final concentration 50 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human HGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 25 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TGF-&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-16A</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-&#945;</td>
			<td>Origene</td>
			<td>TP750007-1000</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho kinase inhibitor Y-27632</td>
			<td>Abmole Bioscience</td>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspondin-1conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPT01RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 # silicone tube</td>
			<td>LangerPump</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well, suspension</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>GN662102-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C Water Bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m filter</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>stemcell</td>
			<td>AT-104</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CTNNB1</td>
			<td>BD</td>
			<td>610154</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH</td>
			<td>CST</td>
			<td>5174S</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HDAC7</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab50212</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KI67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15580</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>542700097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>AC2-4S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>&#160;A100231</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Color Imaging Systems</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AME4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hdac3 siRNA</td>
			<td>Guangzhou RiboBio Co., Ltd.</td>
			<td>siG2003180909192555</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hdac7 lentivirus</td>
			<td>ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd</td>
			<td>LV2020-2364</td>
			<td>stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitrans G A</td>
			<td>Shanghai Genechem Co.,Ltd.</td>
			<td>REVG004</td>
			<td>Increased virus infection efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Pro Plus software</td>
			<td>Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>version 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778150</td>
			<td>Increased virus infection efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live cell dye</td>
			<td>Luna</td>
			<td>F23001</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-speed desktop centrifuge</td>
			<td>cence</td>
			<td>TD5A-WS/TD5AWS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofactor-&#945; 2b Device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>F621006-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>LangerPump</td>
			<td>BT100-2J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Activate with methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX458</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>48138</td>
			<td>stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific Heraeus</td>
			<td>Labofuge 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSL3</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-100218A</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 4 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibico</td>
			<td>25200072</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wee1 siRNA</td>
			<td>Guangzhou RiboBio Co., Ltd.</td>
			<td>siG2003180909205971</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids

Печень является самым крупным органом у млекопитающих. Он играет важную роль в хранении глюкозы, секреции белка, метаболизме и детоксикации. Как исполнитель для большинства функций печени, первичные гепатоциты имеют ограниченную пролиферирующую способность. Это требует установления моделей расширения гепатоцитов ex vivo для физиологических и патологических исследований печени. Здесь мы выделили мышиные гепатоциты двумя этапами перфузии коллагеназы и создали 3D-органоидную культуру как «мини-печень» для рекапитуляции клеточно-клеточных взаимодействий и физических функций. Органоиды состоят из гетерогенных клеточных популяций, включая предшественников и зрелые гепатоциты. Мы подробно вводим процесс выделения и культивирования мышиных гепатоцитов или фетальных гепатоцитов с образованием органоидов в течение 2-3 недель и показываем, как проходить их путем механического пипетирования вверх и вниз. Кроме того, мы также представим, как переваривать органоиды в отдельные клетки для лентивирусной инфекции шРНК/ эктопической конструкции, трансфекции siRNA и инженерии CRISPR-Cas9. Органоиды могут быть использованы для скрининга лекарств, моделирования заболеваний и фундаментальных исследований печени путем моделирования биологии печени и патобиологии.

Органоиды гепатоцитов из женского Alb-Cre; У мышей Rosa26-GFP (8 недель) наблюдали через пять дней после посева (рисунок 1А). Органоиды размножаются с положительным окрашиванием Ki67 (рисунок 1B). Интерферирующую экспрессию репрезентативных генов в органоидах гепато...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids at JoVE.com

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

Из мышиных гепатоцитов была создана долгосрочная система 3D органоидных культур ex vitro . Эти органоиды могут быть пройдены и генетически обработаны лентивирусной инфекцией шРНК/эктопической конструкции, трансфекцией siRNA и инженерией CRISPR-Cas9.

Создание и генетическое манипулирование органоидами мышиных гепатоцитов

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

Печень является самым большим органом у млекопитающих. Он играет очень важную роль в метаболизме и детоксикации. Хотя печень обладает замечательной способностью к регенерации in vitro, это все еще очень большая проблема в долгосрочной перспективе для культивирования гепатоцитов in-vitro.Здесь мы устанавливаем органоиды гепатоцитов из зрелых гепатоцитов. Сохраняет основные черты гепатоцитов в морфологии и функции. В этом видео мы подробно представим, как культивировать и проходить эти органоиды и как выполнять генетическую модификацию этих органоидов.Во-первых, перфузия печени и пищеварение. Подготовьте все регионы и инструменты и сделайте их стерильными. Вымойте мышь и вскройте эпидермис и кожу, а затем попробуйте найти мешочек печи печени.Введите в него иглы, а затем захватите это. Делают перфузию со скоростью пять миллилитров в минуту, пока печень не станет бледной. Поменяйте их в буфер перфузии, аккуратно разместите, следите за печенью, пока она не станет мягкой.Обычно это занимает от трех до пяти минут, затем вырежьте печень и положите их в тарелки, и разрежьте их небольшими кусочками ножницами. Часто поднимайте его вверх и вниз. Обычно требуется от 10 до 15 минут, чтобы превратить их в одну клетку.А затем поднимите его вверх и вниз в течение 10-15 минут и подайте их через слесаря. Превратите их в отдельные клетки. Соберите все ячейки в трубку объемом 50 миллилитров и центрифугируйте их со скоростью, а затем соберите все пластины.Старайтесь держать их всегда в холодном льду. Сделайте одноклеточные суспензии и посчитайте их с помощью счетчика клеток. Обычно гепатоциты если и счастливы, то обладают живым флуоресцентным.Во вторую часть мы пытаемся усадить клетки и сделать органоидную культуру. Мы собираем все клетки суспензии, и подсчитываем клетки с определенным консентро-слиянием, а затем смешиваем их. Метрогели. и носитель кода.Обычно мы берем, со средой и метрогелями, в соотношении 1 к 2 или 1 к 3. После тщательного перемешивания мы сажаем их на градиентные пластины. Обычно мы добавляем 100 микролитров на 24 пластинчатые колодцы.Поместите их в инкубатор при температуре 37 градусов. Через 20 минут мы ставим их обратно вперед снизу внизу, а затем на среде. Через два-три дня противодействия мы обычно видим, как органоиды выходят наружу.Это типичный образ наших органоидов. Обычно нам нужны отдельные клетки из органоидов, если мы хотим сделать проход или сделать какой-то метод генетической модификации Мы собираем все органоиды из противоотталкивающих пластин с буфером для мытья шерсти. Бросаем супернатант, затем на пальто смываем буфер в тарелку, перемешиваем их, так что подтягиваем его вверх и вниз.А затем мы обычно предварительно промываем все наконечники с помощью буфера стиральных лент. Чтобы избежать, все органоиды опрокидываются на кончики. А затем, с новой партией на льду или без нее, мы собираем все органоиды путем центро-синтеза.Мы лечим их, есть обман радиентов, чтобы удалить все метрогели. После 20-30 минут инкубации на льду удаляются все метрогели. Мы собираем все чистые органоиды и добавляем трипсин, чтобы превратить их в отдельные клетки.После добавления трипсина мы обрабатываем органоиды в инкубаторе. Требуется от 5 до 10 минут, чтобы органоиды печени стали одиночными клетками. Мы добавляем больше буферов для мытья, чтобы остановить триплатин.А затем поднимите его вверх и вниз по направлению к ним. Для опционного процесса вы можете промыть их еще раз, чтобы удалить весь трипсин. После промывки центрофузией мы можем пересчитать их под счетчиком клеток.Затем мы покажем, как делать транзакцию или трансфекцию этих органоидов гепатоцитов. Сначала пометьте трубки того, что вы будете делать, а затем мы сделаем трансфекцию зрения в соответствии с инструкциями производителя. Вам нужно, регент липоил факт укрощения INI MaX.Добавляем. контролируют и специфический ген siRNA, и инкубируют их с оптимальным, согласно инструкции производителя. А затем в соответствии с концентрацией клеток мы добавляем RAN max и тщательно перемешиваем их.Затем мы также добавляем RAN max с оптимумом отдельно и кладем их на лед. Через 5 минут мы получаем отдельную смесь RAN max с различными siRNAs, специфический ген RANi и II контролируют отдельно и тщательно их перемешиваем. Снова положите их на лед, а затем мы соберем все органоиды, замедлим центрофузию, бросим весь супернатант, добавляем РНКи макс, смесь siRNA в эту клеточную пластину и тщательно усиливаем ее вверх и вниз.Вкратце, клетки и метка RNAi max и смесь siRNA гентрификации и инкубации в течение 4-5 часов при 37 градусах. Заключительная часть, эти органоиды гепатоцитов также могут быть инфицированы вирусом Ленти. Аналогичное сообщение было выполнено в виде трансфекции siRNA.Контрольная и siRNA вирусные трубки были хорошо подготовлены, а оптимум был добавлен согласно инструкции производителя. Затем с заражением области похожи на поли зеленый, а затем мы добавляем другой вирус Ленти, согласно инструкции производителя конституции. Соединить одноклеточные суспензии в органоидах культуры и различные частицы в 1,5 миллилитра эппендорфских трубках, добавить, хорошо перемешать их пластинчатой этой смесью и сконцентрировать их в течение 1 часа при 32 градусах.Слияние концентрата будет выполнено при 500 г. А после 4-5 часов инкубации при 37 градусах клеточная суспензия будет затем собрана и помещена в метрогель. И снова поместите их в инкубатор. Орган по эффективности формирования или другой функциональный анализ может быть выполнен через 7-10 дней.Вот наши репрезентативные результаты. На рисунке 1A вы можете увидеть наш органоид гепатоцитов ALB-Cre Rosa 26-GFP или RFP от мыши. На рисунке 1B вы можете увидеть положительный сигнал Ki67 при окрашивании, который показал, что наши органоиды гепатоцитов размножаются.На рисунках 2A и 2B показана репрезентативная экспрессия генов нашей интерферирующей экспрессии наших генов. После генетических манипуляций в органоидах гепатоцитов, интерферирующая эффективность очень эффективна. Вот рисунок 2C, вы могли видеть после генетических манипуляций с карсонитовой технологией в наших мышиных органоидах.Вывод, наши результаты показали, что органоиды гепатоцитов могут быть расширены in vitro и генетически модифицированы. Таким образом, в этом видео мы покажем, как сделать перфузию печени и пищеварение, чтобы получить гепатоциты. Как захватывать гепатоциты и проходить через гепатоциты органоиды.Кроме того, мы показали, как делать siRNA и векторную трансфекцию или вирусную инфекцию Ленти, чтобы сделать модификацию генетики этих органоидов. Кроме того, у нас есть два недостатка в наших органоидах. Во-первых, мы не использовали ядро или ядро меха для очистки гепатоцитов.А во-вторых, я думаю, что следует попробовать больше факторов роста и сигнализации, чтобы улучшить время роста органоидов.

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

Метод культуры раннего куриных эмбрионов исключая виво (Новая Культура)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Дважды Всего горе на месте гибридизация раннего куриных эмбрионов

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Выделение и генетических манипуляций взрослых кардиомиоцитов для конфокальной микроскопии

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

ДНК Электропорация, Изоляция и изображений из мышечных волокон

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation

Улучшенный протокол, эффективный по времени и труду, для выделения первичных гепатоцитов мышей

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on ...

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

Анализ окислительного стресса в кишечных органоидах мышей с использованием фторогенного зонда, чувствительного к активным формам кислорода

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

The Establishment of a Murine Mandibular Molar Extraction Socket Healing Model

Создание модели заживления лунки для извлечения нижней челюсти мышей

This study introduces the development of a molar extraction model in the murine mandible to provide a practicable model for studying alveolar bone ...

Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids

Создание, поддержание, дифференциация, генетические манипуляции и трансплантация органоидов слезных желез мыши и человека

The lacrimal gland is an essential organ for ocular surface homeostasis. By producing the aqueous part of the tear film, it protects the eye from ...

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Ex Vivo Экспансия и генетические манипуляции с гемопоэтическими стволовыми клетками мыши в культурах на основе поливинилового спирта

Self-renewing&#160;multipotent&#160;hematopoietic stem cells (HSCs) are an important cell type due to their abilities to support hematopoiesis throughout ...

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

Культура 3D-органоидов кишечника поросенка из криоконсервированных эпителиальных крипт и создание клеточных монослоев

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...