Name: establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids
Uploaded: 2022-02-12T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids at JoVE.com

Agradecemos al profesor Hans Clevers por proporcionar amablemente las líneas celulares para producir R-spondin1 recombinante. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones del Programa Nacional Clave de I + D de China (2019YFA0111400), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31970779) a H.H., y los Fondos para la Juventud Interdisciplinaria y el Grupo de Investigación de Innovación de la Universidad de Shandong (2020QNQT003) a H.H.

Todos los experimentos con ratones fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Escuela de Ciencias Médicas Básicas de la Universidad de Shandong y se llevaron a cabo de acuerdo con la Licencia bajo las pautas y regulaciones del Ministerio del Interior (No. ECSBMSSDU2019-2-079).
NOTA: Este protocolo se utiliza principalmente para cultivar organoides 3D a partir de hepatocitos primarios aislados.
1. Establecimiento del cultivo de organoides de h...

<ol>
	<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 124-125 (2014).</li><li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+regenerative+medicine:+organogenesis+from+stem+cells+in+3D+culture.">Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Paola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+brain+organoids+reproducibly+form+cell+diversity+of+the+human+cerebral+cortex.">Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex.</a> Nature. 570, 523-527 (2019).</li><li>Atsuhiro, T., Ryuichi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-Order+Kidney+Organogenesis+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Higher-Order Kidney Organogenesis from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Wang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Expansion+of+Pancreatic+Islet+Organoids+from+Resident+Procr+++Progenitors.">Long-Term Expansion of Pancreatic Islet Organoids from Resident Procr + Progenitors.</a> Cell. 180 (6), 1198-1211 (2020).</li><li>Jarno, D., Hans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18, 407-418 (2018).</li><li>Hans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Forbes, S. J., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration-mechanisms+and+models+to+clinical+application.">Liver regeneration-mechanisms and models to clinical application.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13 (8), 473-485 (2016).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Expansion+of+Primary+Human+Hepatocytes+with+Efficient+Liver+Repopulation+Capacity.">In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 806-819 (2018).</li><li>Katsuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+Terminally+Committed+Hepatocytes+to+Culturable+Bipotent+Progenitor+Cells+with+Regenerative+Capacity.">Conversion of Terminally Committed Hepatocytes to Culturable Bipotent Progenitor Cells with Regenerative Capacity.</a> Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).</li><li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Expansion+of+Functional+Mouse+and+Human+Hepatocytes+as+3D+Organoids.">Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li><li>Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Cytokine+TNFalpha+Promotes+the+Long-Term+Expansion+of+Primary+Hepatocytes+in+3D+Culture.">Inflammatory Cytokine TNFalpha Promotes the Long-Term Expansion of Primary Hepatocytes in 3D Culture.</a> Cell. 175 (6), 1607-1619 (2018).</li><li>Xiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+maintenance+of+primary+human+hepatocytes+in+vitro.">Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro.</a> Science. 364 (6438), 399-402 (2019).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver.">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocol. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li></ol>

La capacidad de cultivar hepatocitos maduros durante largos períodos es fundamental en el estudio de la ciencia básica del hígado, la toxicología de medicamentos y las infecciones hepatotrópicas de microbiología del huésped, como la malaria y los virus de la hepatitis. Con un nicho bien definido, el protocolo aquí establece un sistema de cultivo para hepatocitos. Este protocolo impulsa a los hepatocitos maduros a expandirse en cultivo 3D con una heterogeneidad que recapitula la interacción célula-célula, la fu...

Los organoides son grupos in vitro autoorganizados, tridimensionales (3D) que incluyen células madre autorrenovantes y células diferenciadas multilinaje1,2. Los organoides de muchos órganos se han establecido a partir de células madre pluripotentes o adultas por factores de nicho bien definidos, incluidos el intestino, el cerebro, el colon, el riñón, el hígado, el páncreas, la tiroides, el estómago, la piel y el pulmón3,4,5,6,7 . Los organoides recapitulan las funciones de las células físicas imitando el desarrollo (originado a partir de células madre pluripotentes embrionarias o inducidas, PSC) o la progresión de la homeostasis/regeneración (originada a partir de células madre adultas, ASC), lo que abre nuevas vías en la investigación y terapia de enfermedades8,9.
Como el órgano más grande en los mamíferos, el hígado es principalmente responsable del almacenamiento, el metabolismo y la desintoxicación. Dos tipos de tipos de células epiteliales, los hepatocitos y los colangiocitos, construyen la unidad básica de un lóbulo hepático. Los hepatocitos son responsables del 70-80% de la función hepática10. Aunque el hígado tiene una notable capacidad de regeneración, la rápida pérdida de las características de los hepatocitos ocurre durante el cultivo monocapa tradicional por polarización y desdiferenciación celular desregulada, lo que aumenta la necesidad de investigadores y médicos de construir modelos hepáticos de "puente de brecha" en un plato. Sin embargo, hasta hace poco los modelos de expansión ex vivo de los hepatocitos primarios no estaban bien establecidos11,12,13,14,15. Los organoides hepáticos se pueden establecer a partir de células madre pluripotentes embrionarias / inducidas, conversión de fibroblastos en células similares a hepatocitos y células derivadas de tejidos. El desarrollo de organoides hepáticos impulsa la aplicación de un modelo in vitro para cribados farmacológicos y ensayos de toxicidad hepática16,17.
Aquí, describimos un protocolo detallado para establecer organoides hepáticos a partir de hepatocitos primarios murinos. Mediante el uso de este protocolo, establecimos un sistema de cultivo in vitro de organoides de hepatocitos con dos perfusiones de colagenasa. Estos organoides pueden ser pasados para la expansión a largo plazo durante meses. Su función fisiológica es altamente consistente con los hepatocitos. Además, también proporcionamos una descripción detallada de cómo realizar la manipulación genética, como la infección por lentivirus, la transducción de siRNA y la ingeniería CRISPR-Cas9 utilizando organoides. La propagación de organoides de hepatocitos arrojó luz sobre la posibilidad de utilizar organoides para comprender la biología hepática y desarrollar enfoques de medicina personalizados y traslacionales.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Perfusion Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A600077-0100</td>
			<td>3.50 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100188-0500</td>
			<td>9.00 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100395-0500</td>
			<td>4.00 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>1.51 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501218-0001</td>
			<td>80.0 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A610404-0500</td>
			<td>0.78 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A500873-0500</td>
			<td>3.50 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100882-0025</td>
			<td>0.06 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501330-0005</td>
			<td>0.50 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1639</td>
			<td>0.10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>C621110-0010</td>
			<td>23.80 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100395-0500</td>
			<td>4.00 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>1.51 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501218-0001</td>
			<td>80.0 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A610404-0500</td>
			<td>0.78 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A500873-0500</td>
			<td>3.50 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip-wash Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10091148</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C14190500BT0</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>&#160;A600135-0025</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>Stock concentration 500 &#181;M, final 
			concentration 2 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement 50x, minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1704-044</td>
			<td>50 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chir 99021</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td>Stock concentration 30 mM, final 
			concentration 3 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330032</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin I</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3006</td>
			<td>Stock concentration 100 mM, final 
			concentration 10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel martix</td>
			<td>BD</td>
			<td>356231</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Stock concentration 500 mM, final 
			concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nictinamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>&#160;A600135-0025</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml,final concentration 50 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human HGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 25 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TGF-&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-16A</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-&#945;</td>
			<td>Origene</td>
			<td>TP750007-1000</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho kinase inhibitor Y-27632</td>
			<td>Abmole Bioscience</td>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspondin-1conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPT01RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 # silicone tube</td>
			<td>LangerPump</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well, suspension</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>GN662102-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C Water Bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m filter</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>stemcell</td>
			<td>AT-104</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CTNNB1</td>
			<td>BD</td>
			<td>610154</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH</td>
			<td>CST</td>
			<td>5174S</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HDAC7</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab50212</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KI67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15580</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>542700097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>AC2-4S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>&#160;A100231</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Color Imaging Systems</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AME4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hdac3 siRNA</td>
			<td>Guangzhou RiboBio Co., Ltd.</td>
			<td>siG2003180909192555</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hdac7 lentivirus</td>
			<td>ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd</td>
			<td>LV2020-2364</td>
			<td>stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitrans G A</td>
			<td>Shanghai Genechem Co.,Ltd.</td>
			<td>REVG004</td>
			<td>Increased virus infection efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Pro Plus software</td>
			<td>Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>version 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778150</td>
			<td>Increased virus infection efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live cell dye</td>
			<td>Luna</td>
			<td>F23001</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-speed desktop centrifuge</td>
			<td>cence</td>
			<td>TD5A-WS/TD5AWS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofactor-&#945; 2b Device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>F621006-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>LangerPump</td>
			<td>BT100-2J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Activate with methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX458</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>48138</td>
			<td>stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific Heraeus</td>
			<td>Labofuge 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSL3</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-100218A</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 4 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibico</td>
			<td>25200072</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wee1 siRNA</td>
			<td>Guangzhou RiboBio Co., Ltd.</td>
			<td>siG2003180909205971</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids

El hígado es el órgano más grande en los mamíferos. Juega un papel importante en el almacenamiento de glucosa, la secreción de proteínas, el metabolismo y la desintoxicación. Como ejecutor de la mayoría de las funciones hepáticas, los hepatocitos primarios tienen una capacidad de proliferación limitada. Esto requiere el establecimiento de modelos de expansión de hepatocitos ex vivo para la investigación fisiológica y patológica del hígado. Aquí, aislamos los hepatocitos murinos por dos pasos de perfusión de colagenasa y establecimos un cultivo de organoides 3D como el "mini-hígado" para recapitular las interacciones célula-célula y las funciones físicas. Los organoides consisten en poblaciones celulares heterogéneas que incluyen progenitores y hepatocitos maduros. Introducimos el proceso en detalle para aislar y cultivar los hepatocitos murinos o el hepatocito fetal para formar organoides en 2-3 semanas y mostrar cómo pasarlos canalizando mecánicamente hacia arriba y hacia abajo. Además, también presentaremos cómo digerir los organoides en células individuales para la infección por lentivirus de la construcción shRNA / ectópica, la transfección de siRNA y la ingeniería CRISPR-Cas9. Los organoides se pueden utilizar para pruebas de detección de drogas, modelado de enfermedades e investigación hepática básica mediante el modelado de la biología hepática y la patobiología.

Los organoides hepatocitos de Alb-Cre femenino; Se observó ratón Rosa26-GFP (8 semanas) cinco días después de la siembra (Figura 1A). Los organoides están proliferando con tinción positiva de Ki67 (Figura 1B). La expresión interferente de genes representativos en organoides de hepatocitos, ya sea por transfección por siRNA o infección por lentivirus, se examinó mediante qRT-PCR y western blot. Los resultados se muestran en las Figu...

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Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

Se estableció un sistema de cultivo de organoides 3D ex vitro a largo plazo a partir de hepatocitos de ratón. Estos organoides pueden ser atravesados y manipulados genéticamente por infección por lentivirus de construcción shRNA/ectópica, transfección de siRNA e ingeniería CRISPR-Cas9.

Establecimiento y manipulación genética de organoides hepatocitos murinos

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

El hígado es el órgano más grande en los mamíferos. Juega un papel muy importante en el metabolismo y la desintoxicación. Aunque el hígado tiene una notable capacidad de regeneración in vitro, sigue siendo un reto muy grande a largo plazo cultivar hepatocitos in vitro.Aquí, establecemos los organoides de los hepatocitos a partir de hepatocitos maduros. Mantiene las principales características de los hepatocitos en morfología y función. En este video, presentaremos cómo cultivar y pasar estos organoides y cómo realizar la modificación genética de estos organoides en detalle.Primero, la perfusión hepática y la digestión. Prepara todas las regiones y los instrumentos y hazlos estériles. Lave el ratón y abra el epidérmico y la piel, y luego trate de encontrar el horno de bolsa del hígado.Inyecte las agujas en él y luego capture esto. Haga la perfusión a la velocidad de cinco mililitros por minuto, hasta que el hígado se ponga pálido. Cámbielos en el tampón de perfusión, colóquelos con cuidado, observe el hígado, hasta que se ablande.Por lo general, toma de tres a cinco minutos, luego corte el hígado y póngalos en las placas, y córtelos en trozos pequeños con las tijeras. Pásalo hacia arriba y hacia abajo con frecuencia. Por lo general, toma de 10 a 15 minutos convertirlos en la celda única.Y luego animarlo hacia arriba y hacia abajo con 10 a 15 minutos y alimentarlos a través del instalador. Conviértelos en las celdas individuales. Recoge todas las células en el tubo de 50 mililitros, y centríbalas, con la velocidad y luego recoge todas las placas por placas.Trate de mantenerlos siempre en el hielo frío. Haga las suspensiones de una sola celda y cuéntelas con el contador de celdas. Por lo general, los hepatocitos si están contentos, tiene el fluorescente vivo.La segunda parte, tratamos de sentar las células y hacer el cultivo de organoides. Recogemos todas las suspensiones de células, y contamos las células con un cierto concentro-fusión Y luego mezclamos las. Metrogels. y el medio de código.Normalmente tomamos, con el medio y los metrogels, en la proporción de 1 a 2 o de 1 a 3. Después de mezclarlos cuidadosamente, los sentamos en las placas de gradiente. Por lo general, agregamos 100 microlitros en el pozo de 24 platos.Póngalos en la incubadora a la temperatura de 37 grados. Después de 20 minutos, los ponemos hacia adelante con la parte inferior en la parte inferior y luego en el medio. Con dos o tres días de contraataque, solemos ver salir los organoides.Esta es la imagen típica de nuestros organoides. Por lo general, necesitamos células individuales de organoides si queremos hacer el pasaje o hacer algún método de modificación genética Recogemos todos los organoides de las placas de contraataque con el tampón de lavado de pelaje. Dejamos caer el sobrenadante, luego en el tampón de lavado de la capa en el plato, los mezclamos, así que anímelo hacia arriba y hacia abajo.Y luego solemos prelavar todas las puntas con el tampón de cintas de lavado. Para evitar todos los organoides, inclíquese sobre las puntas. Y luego, con el, un nuevo lote sobre hielo o sin él, recogemos todos los organoides por centro-fusión.Los tratamos, hay un conducto para eliminar todos los metrogeles. Después de 20 a 30 minutos de incubación en hielo se retiran todos los metrogeles. Recolectamos todos los organoides limpios y agregamos tripsina para convertirlos en células individuales.Después de agregar tripsina, tratamos los organoides en la incubadora. Los organoides hepáticos tardan de 5 a 10 minutos en convertirse en células individuales. Agregamos más tampones de lavado para detener la triplatina.Y luego animarlo hacia arriba y hacia abajo hacia ellos. Para el proceso de opción, puede lavarlos una vez más para eliminar toda la tripsina. Después del lavado por centrofusión, podemos contarlos debajo del contador celular.A continuación mostraremos cómo hacer transacción o transfección de estos organoides hepatocitos. Primero, etiquete los tubos de lo que hará, y luego haremos la transfección de la vista de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Necesitas, el regente de los hechos lipoílicos domesticando INI MaX.Añadimos el. controlar y el gen específico siRNA, e incubarlos con el óptimo, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Y luego, de acuerdo con la concentración celular, agregamos el RAN max y los mezclamos a fondo.Luego también añadimos el RAN max con el óptimo por separado y los ponemos en hielo. Después de 5 minutos, preparamos una mezcla ran max separada con diferentes siRNAs, RANi de genes específicos y control de II por separado y los mezclamos a fondo. Ponerlos en hielo de nuevo, y luego recogemos todos los organoides, centrofusión lenta, dejamos caer todo el sobrenadante, agregamos el RNAi max, la mezcla de siRNA en esta placa celular y la alimentamos hacia arriba y hacia abajo a fondo.Brevemente, las células y la etiqueta RNAi max y la mezcla de siRNA se gentrificaron e incubaron durante 4 a 5 horas a 37 grados. Parte final, estos organoides de hepatocitos también podrían estar infectados por el virus Lenti. El mensaje similar se realizó como transfección de siRNA.El control y los tubos del virus siRNA estaban bien preparados, y el óptimo se agregó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego con las regiones de infección como poly green y luego agregamos diferentes virus Lenti, de acuerdo con la constitución de instrucciones del fabricante. Combine las suspensiones unicelulares en cultivo de organoides y varias partículas en los tubos eppendorf de 1,5 mililitros, Agregue, bueno, mézclelos Coloque esta mezcla y concéntrelos durante 1 hora a 32 grados.La fusión de concentrado se realizará a 500 G.Y después de 4 a 5 horas de incubación a 37 grados, la suspensión celular se recogerá y se sentará en metrogel. Y ponerlos en la incubadora de nuevo. El órgano en la eficiencia de la formación u otro análisis funcional podría realizarse de 7 a 10 días después.Aquí están nuestros resultados representativos. En la figura 1A, se podía ver nuestro ALB-Cre Rosa 26-GFP o RFP hepatocitos organoides de ratón. En la figura 1B se pudo ver la señal positiva Ki67 en la tinción, lo que ha demostrado que nuestros organoides hepatocitos están proliferando.En la figura 2A y 2B aquí hay una expresión génica representativa de nuestra expresión interferente de nuestros genes. Después de la manipulación genética en organoides de hepatocitos, la interferencia efectiva es muy eficiente. Aquí está la figura 2C, se puede ver después de la manipulación genética con tecnología de carsonita en nuestros organoides murinos.Conclusión, nuestros resultados mostraron que los organoides de los hepatocitos podían expandirse in vitro y manipularse genéticamente. En resumen, en este vídeo mostramos cómo hacer la perfusión hepática y la digestión para conseguir los hepatocitos. Cómo capturar los hepatocitos y pasar los organoides de los hepatocitos.Asimismo, mostramos cómo hacer la transfección por siRNA y vector o virus Lenti para hacer la modificación de la genética de estos organoides. Además, tenemos dos carencias en nuestros organoides. Primero, no usamos por núcleo o núcleo de piel para hacer puro los hepatocitos.Y en segundo lugar, creo que se deben intentar más factores de crecimiento y señalización para mejorar el tiempo de crecimiento de los organoides.

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