Name: establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids
Uploaded: 2022-02-12T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids at JoVE.com

Vi tackar professor Hans Clevers för att han vänligen tillhandahåller cellinjerna för att producera rekombinant R-spondin1. Detta arbete stöddes av bidrag från National Key R&D Program of China (2019YFA0111400), National Natural Science Foundation of China (31970779) till H.H., och Funds for Youth Interdisciplinary and Innovation Research Group of Shandong University (2020QNQT003) till H.H.

Alla mössexperiment godkändes av Animal Care and Use Committee vid School of Basic Medical Sciences vid Shandong University och utfördes enligt licensen enligt Home Office riktlinjer och förordningar (Nr. ECSBMSSDU2019-2-079).
OBS: Detta protokoll används främst för att odla 3D-organoider från isolerade primära hepatocyter.
1. Upprättande av Murine Hepatocyte Organoid Kultur
OBS: Extracellulär matris som Matrigel eller BME använ...

<ol>
	<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 124-125 (2014).</li><li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+regenerative+medicine:+organogenesis+from+stem+cells+in+3D+culture.">Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Paola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+brain+organoids+reproducibly+form+cell+diversity+of+the+human+cerebral+cortex.">Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex.</a> Nature. 570, 523-527 (2019).</li><li>Atsuhiro, T., Ryuichi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-Order+Kidney+Organogenesis+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Higher-Order Kidney Organogenesis from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Wang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Expansion+of+Pancreatic+Islet+Organoids+from+Resident+Procr+++Progenitors.">Long-Term Expansion of Pancreatic Islet Organoids from Resident Procr + Progenitors.</a> Cell. 180 (6), 1198-1211 (2020).</li><li>Jarno, D., Hans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18, 407-418 (2018).</li><li>Hans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Forbes, S. J., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration-mechanisms+and+models+to+clinical+application.">Liver regeneration-mechanisms and models to clinical application.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13 (8), 473-485 (2016).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Expansion+of+Primary+Human+Hepatocytes+with+Efficient+Liver+Repopulation+Capacity.">In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 806-819 (2018).</li><li>Katsuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+Terminally+Committed+Hepatocytes+to+Culturable+Bipotent+Progenitor+Cells+with+Regenerative+Capacity.">Conversion of Terminally Committed Hepatocytes to Culturable Bipotent Progenitor Cells with Regenerative Capacity.</a> Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).</li><li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Expansion+of+Functional+Mouse+and+Human+Hepatocytes+as+3D+Organoids.">Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li><li>Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Cytokine+TNFalpha+Promotes+the+Long-Term+Expansion+of+Primary+Hepatocytes+in+3D+Culture.">Inflammatory Cytokine TNFalpha Promotes the Long-Term Expansion of Primary Hepatocytes in 3D Culture.</a> Cell. 175 (6), 1607-1619 (2018).</li><li>Xiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+maintenance+of+primary+human+hepatocytes+in+vitro.">Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro.</a> Science. 364 (6438), 399-402 (2019).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver.">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocol. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li></ol>

Förmågan att odla mogna hepatocyter under långa perioder är grundläggande för att studera lever grundläggande vetenskap, läkemedelstoxikologi och hepatotropa värdmikrobiologi infektioner såsom malaria och hepatitvirus. Med en väldefinierad nisch inrättar protokollet här ett kultursystem för hepatocyter. Detta protokoll driver mogna hepatocyter att expandera i 3D-kulturen med en heterogenitet som rekapitulerar cell-cellinteraktion, de flesta hepatocytfunktion och genetiska modifieringar, vilket möjliggör d...

Organoider är självorganiserade, tredimensionella (3D) in vitro-kluster som inkluderar självförnyande stamceller och differentierade multi-lineageceller1,2. Organoiderna i många organ har etablerats antingen från pluripotenta eller vuxna stamceller av väldefinierade nischfaktorer inklusive tarmen, hjärnan, tjocktarmen, njuren, levern, bukspottkörteln, sköldkörteln, magen, huden och lungan3,4,5,6,7 . Organoiderna rekapitulerar fysiska cellfunktioner genom att efterlikna antingen utveckling (som härrör från embryonala eller inducerade pluripotenta stamceller, PSC) eller homeostas/regenereringsprogression (härrör från vuxna stamceller, ASCs), vilket öppnar nya vägar inom sjukdomsforskning och terapi8,9.
Som det största organet hos däggdjur är levern främst ansvarig för lagring, metabolism och avgiftning. Två typer av epitelial celltyper, hepatocyter och cholangiocyter, konstruera den grundläggande enheten i en leverlobule. Hepatocyter är ansvariga för 70-80% av leverfunktionen10. Även om levern har anmärkningsvärd regenereringskapacitet, sker snabb förlust av hepatocytfunktioner under traditionell monolayer-odling av dysreglerad cellpolarisering och dedifferentiation, vilket ökar behovet av forskare och kliniker att bygga "gap-överbryggande" levermodeller i en maträtt. Fram till nyligen hade dock ex vivo-expansionsmodellerna från primära hepatocyter inte varit väletablerade11,12,13,14,15. Leverorganoider kan etableras från embryonala/inducerade pluripotenta stamceller, fibroblastkonvertering till hepatocytliknande celler och vävnadsbaserade celler. Utvecklingen av leverorganoider ökar tillämpningen av en in vitro-modell för läkemedelsskärmar och levertoxicitetsanalyser16,17.
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att fastställa lever organoider från murine primära hepatocyter. Genom att använda detta protokoll, vi inrätta ett in vitro kultursystem av hepatocyt organoider med två perfusioner av kollagenas. Dessa organoider kan passeras för långsiktig expansion i månader. Deras fysiologiska funktion är mycket förenlig med hepatocyter. Dessutom ger vi också en detaljerad beskrivning av hur man utför genetisk manipulation, såsom lentivirusinfektion, siRNA-transduktion och CRISPR-Cas9-teknik med hjälp av organoider. Förökningen av hepatocytorganoider belyser möjligheten att använda organoider för att förstå leverbiologi och utveckla personliga och translationella medicinska metoder.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Perfusion Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A600077-0100</td>
			<td>3.50 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100188-0500</td>
			<td>9.00 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100395-0500</td>
			<td>4.00 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>1.51 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501218-0001</td>
			<td>80.0 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A610404-0500</td>
			<td>0.78 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A500873-0500</td>
			<td>3.50 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100882-0025</td>
			<td>0.06 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501330-0005</td>
			<td>0.50 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1639</td>
			<td>0.10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>C621110-0010</td>
			<td>23.80 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100395-0500</td>
			<td>4.00 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>1.51 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501218-0001</td>
			<td>80.0 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A610404-0500</td>
			<td>0.78 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A500873-0500</td>
			<td>3.50 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip-wash Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10091148</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C14190500BT0</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>&#160;A600135-0025</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>Stock concentration 500 &#181;M, final 
			concentration 2 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement 50x, minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1704-044</td>
			<td>50 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chir 99021</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td>Stock concentration 30 mM, final 
			concentration 3 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330032</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin I</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3006</td>
			<td>Stock concentration 100 mM, final 
			concentration 10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel martix</td>
			<td>BD</td>
			<td>356231</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Stock concentration 500 mM, final 
			concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nictinamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>&#160;A600135-0025</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml,final concentration 50 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human HGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 25 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TGF-&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-16A</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-&#945;</td>
			<td>Origene</td>
			<td>TP750007-1000</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho kinase inhibitor Y-27632</td>
			<td>Abmole Bioscience</td>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspondin-1conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPT01RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 # silicone tube</td>
			<td>LangerPump</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well, suspension</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>GN662102-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C Water Bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m filter</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>stemcell</td>
			<td>AT-104</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CTNNB1</td>
			<td>BD</td>
			<td>610154</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH</td>
			<td>CST</td>
			<td>5174S</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HDAC7</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab50212</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KI67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15580</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>542700097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>AC2-4S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>&#160;A100231</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Color Imaging Systems</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AME4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hdac3 siRNA</td>
			<td>Guangzhou RiboBio Co., Ltd.</td>
			<td>siG2003180909192555</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hdac7 lentivirus</td>
			<td>ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd</td>
			<td>LV2020-2364</td>
			<td>stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitrans G A</td>
			<td>Shanghai Genechem Co.,Ltd.</td>
			<td>REVG004</td>
			<td>Increased virus infection efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Pro Plus software</td>
			<td>Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>version 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778150</td>
			<td>Increased virus infection efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live cell dye</td>
			<td>Luna</td>
			<td>F23001</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-speed desktop centrifuge</td>
			<td>cence</td>
			<td>TD5A-WS/TD5AWS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofactor-&#945; 2b Device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>F621006-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>LangerPump</td>
			<td>BT100-2J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Activate with methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX458</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>48138</td>
			<td>stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific Heraeus</td>
			<td>Labofuge 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSL3</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-100218A</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 4 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibico</td>
			<td>25200072</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wee1 siRNA</td>
			<td>Guangzhou RiboBio Co., Ltd.</td>
			<td>siG2003180909205971</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids

Levern är det största organet hos däggdjur. Det spelar en viktig roll i glukoslagring, proteinsekresion, metabolism och avgiftning. Som exekutor för de flesta leverfunktioner har primära hepatocyter begränsad prolifererande kapacitet. Detta kräver upprättandet av ex vivo hepatocytexpansion modeller för leverfysiologisk och patologisk forskning. Här isolerade vi murin hepatocyter genom två steg av kollagenas perfusion och etablerade en 3D organoid kultur som "mini-lever" för att rekapitulera cell-cell interaktioner och fysiska funktioner. Organoiderna består av heterogena cellpopulationer inklusive stamceller och mogna hepatocyter. Vi introducerar processen i detalj för att isolera och odla murin hepatocyter eller fetala hepatocyter för att bilda organoider inom 2-3 veckor och visa hur man passerar dem genom att mekaniskt pipettera upp och ner. Dessutom kommer vi också att introducera hur man smälter organoiderna i enstaka celler för lentivirusinfektion av shRNA / utomkvedskonstruktion, siRNA-transfektion och CRISPR-Cas9-teknik. Organoiderna kan användas för läkemedelsskärmar, sjukdomsmodellering och grundläggande leverforskning genom modellering av leverbiologi och patobiologi.

Hepatocytorganoiderna från kvinnliga Alb-Cre; Rosa26-GFP mus (8 veckor) observerades fem dagar efter sådd (figur 1A). Organoiderna fortplantar sig med Ki67 positiv färgning (figur 1B). Störande uttryck av representativa gener i hepatocyt organoider antingen genom siRNA transfection eller lentivirus infektion undersöktes av qRT-PCR och västra blot. Resultaten visas i figur 2A och 2B. Figur ...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids at JoVE.com

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

Ett långsiktigt ex vitro 3D organoid kultursystem inrättades från mus hepatocyter. Dessa organoider kan passeras och genetiskt manipuleras av lentivirus infektion av shRNA/ektopisk konstruktion, siRNA transfection och CRISPR-Cas9 teknik.

Etablering och genetisk manipulering av Murine Hepatocyte Organoids

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

Levern är det största organet hos däggdjur. Det spelar en mycket viktig roll i ämnesomsättningen och avgiftningen. Även om levern har en anmärkningsvärd regenereringskapacitet in vitro, är det fortfarande en mycket stor utmaning på lång sikt att odla hepatocyt in vitro.Här etablerar vi hepatocyterna organoider från mogna hepatocyter. Det håller huvuddragen hos hepatocyter i morfologi och funktion. I den här videon kommer vi att introducera hur man kultur och passage dessa organoider och hur man utför den genetiska modifieringen av dessa organoider i detaljer.Först leverperfusion och matsmältning. Förbered alla regioner och instrument och gör dem sterila. Tvätta musen och öppna epidermal och huden, och försök sedan hitta påsugnen i levern.Injicera nålarna i den och fånga den här. Gör perfusionen med en hastighet av fem milliliter per minut tills levern blir blek. Byt dem till perfusionsbufferten, placera försiktigt, titta på levern tills den blir mjuk.Vanligtvis tar det tre till fem minuter, skär sedan levern och lägg dem i plattorna och skär dem i små bitar med saxen. Peppa det upp och ner ofta. Vanligtvis tar det 10 till 15 minuter att göra dem till den enda cellen.Och peppa sedan upp och ner med 10 till 15 minuter och mata dem genom montören. Gör dem till de enda cellerna. Samla alla celler i 50 milliliterröret och centrifugera dem, med hastigheten och samla sedan alla per plattor.Försök att alltid hålla dem i den kalla isen. Gör encellsupphängningarna och räkna dem med cellräknaren. Vanligtvis hepatocyterna om de är glada, har det den livliga fluorescerande.Den andra delen försöker vi sitta cellerna och göra den organoida kulturen. Vi samlar alla cell suspensioner, och räknar cellerna med en viss concentro-fusion och sedan blandar vi. Metrogels. och kodmediet.Vanligtvis tar vi, med mediet och metrogelerna, med förhållandet 1 till 2 eller 1 till 3. Efter att noggrant ha blandat dem sätter vi dem på gradientplattorna. Vi brukar lägga till 100 mikroliter vid 24-plattan väl.Sätt dem i inkubatorn vid temperaturen 37 grader. Efter 20 minuter lägger vi dem bakåt med botten längst ner och sedan på mediet. Med två eller tre dagars kontrande ser vi vanligtvis organoiderna komma ut.Detta är den typiska bilden av våra organoider. Vi behöver vanligtvis enstaka celler från organoider om vi vill göra passagen eller göra någon genetisk modifieringsmetod Vi samlar alla organoider från motplattorna med pälstvättbufferten. Vi släpper supernatanten, sedan vid pälstvättbufferten i plattan, blanda dem, så peppa den upp och ner.Och då brukar vi förtvätta alla tips med tvättbandbufferten. För att undvika alla organoider tippar på spetsarna. Och sedan med, en ny sats på is eller utan den, samlar vi alla organoider genom centro-fusion.Vi behandlar dem, det finns en räd radients för att ta bort alla metrogels. Efter 20 till 30 minuters inkubation på is avlägsnas alla metrogeler. Vi samlar alla rena organoider och lägger till trypsin för att göra dem till enstaka celler.Efter trypsin läggs till behandlar vi organoiderna i inkubatorn. Det tar 5 till 10 minuter för leverorganoider att bli enstaka celler. Vi lägger till fler tvättbuffertar för att stoppa triplatin.Och sedan peppa det upp och ner mot dem. För alternativprocess kan du tvätta dem en gång till för att ta bort allt trypsin. Efter att ha tvättats av centrofusion kan vi räkna dem under cellräknaren.Då kommer vi att visa hur man gör transaktion eller transfektion av dessa hepatocyter organoider. Märk först rören på vad du ska göra, och sedan gör vi syntransfektionen enligt tillverkarens instruktioner. Du behöver, regenten av lipoyl fakta tämjer INI MaX.Vi lägger till. och den specifika genen siRNA, och inkubera dem med det optimala, enligt tillverkarens instruktioner. Och sedan enligt cellkoncentrationen lägger vi till RAN max och blandar dem noggrant.Sedan lägger vi också till RAN max med det optimala separat och lägger dem på is. Efter 5 minuter peppar vi upp separat RAN max blandning med olika siRNAs, Specifik gen RANi och II kontroll separat och blanda dem noggrant. Lägg dem på is igen, och sedan samlar vi alla organoider, långsam centrofusion, släpper alla supernatant, vi lägger till RNAi max, siRNA-blandningen i denna cellplatta och peppar den upp och ner noggrant.Kort, cellerna och etiketten RNAi max och siRNA blandning var gentrification och inkubera i 4 till 5 timmar vid 37 grader. Den sista delen, dessa hepatocytes organoider kan också infekteras av Lenti virus. Liknande meddelande utfördes som siRNA transfection.Kontrollen och siRNA-virusrören var väl förberedda, och det optimala lades till enligt tillverkarens instruktioner. Sedan med infektionsregionerna som polygrönt och sedan lägger vi till olika Lenti-virus, enligt tillverkarens instruktioner konstitution. Kombinera encellsupphängningarna i organoidkulturen och olika partiklar i 1,5 ml eppendorfrör, Tillsätt, blanda dem Plätera denna blandning och koncentrera dem i 1 timme vid 32 grader.Koncentratfusionen kommer att utföras vid 500 G.Och efter 4 till 5 timmars inkubation vid 37 grader kommer cellfjädringen sedan att samlas in och sitta i metrogel. Och sätt dem i inkubatorn igen. Organet på formation effektivitet eller annan funktionell analys kunde utföras 7 till 10 dagar senare.Här är våra representativa resultat. I figur 1A kunde du se vår ALB-Cre Rosa 26-GFP eller RFP hepatocytes organoid från musen. I figur 1B kunde man se ki67-positiv signal vid färgning, som har visat att våra hepatocyterorganoider sprider sig.I figur 2A och 2B här är ett representativt genuttryck av vårt störande uttryck av våra gener. Efter genetisk manipulering i hepatocyter organoider är den störande effektiva mycket effektiv. Här är figur 2C, du kunde se efter genetisk manipulation med karsonitteknik i våra murinorganoider.Slutsats visade våra resultat hepatocytes organoider kunde utökas in vitro och genetiskt manipuleras. Sammanfattningsvis visar vi i den här videon hur man gör leverperfusionen och matsmältningen för att få hepatocyterna. Hur man fångar hepatocyterna och passager hepatocyterna organoider.Vi visade också hur man gör siRNA och vektor transfektion eller Lenti virusinfektion för att göra modifieringen av genetiken hos dessa organoider. Dessutom har vi två brister i våra organoider. För det första använde vi inte per kärna eller pälskärna för att rena hepatocyterna.Och för det andra tycker jag att fler tillväxtfaktorer och signalering bör försöka förbättra organoidernas växttid.

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

Metod för kultur av tidig kycklingembryon ex vivo (New Kultur)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Dubbel Hela Montera in situ hybridisering för tidig kycklingembryon

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Isolering och genetisk manipulation av vuxen Cardiac myocyter för Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Elektroporation, isolering och avbildning av Myofibers

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation

Ett förbättrat tids- och arbetseffektivt protokoll för musens primära hepatocytisolering

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on ...

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

Analysera oxidativ stress i Murine Intestinala organoider med hjälp av reaktiva syre arter-känslig fluorogen sond

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

The Establishment of a Murine Mandibular Molar Extraction Socket Healing Model

Upprättandet av en murin mandibulär molär extraktionshylsläkningsmodell

This study introduces the development of a molar extraction model in the murine mandible to provide a practicable model for studying alveolar bone ...

Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids

Etablering, underhåll, differentiering, genetisk manipulation och transplantation av tårkörtelorganoider från möss och människa

The lacrimal gland is an essential organ for ocular surface homeostasis. By producing the aqueous part of the tear film, it protects the eye from ...

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Ex Vivo Expansion och genetisk manipulation av mushematopoetiska stamceller i polyvinylalkoholbaserade kulturer

Self-renewing&#160;multipotent&#160;hematopoietic stem cells (HSCs) are an important cell type due to their abilities to support hematopoiesis throughout ...

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

Odling av Piglet Intestinal 3D-organoider från kryokonserverade epitelkrypter och etablering av cellmonolager

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...