Name: establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids
Uploaded: 2022-02-12T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids at JoVE.com

Profesör Hans Clevers'e rekombinant R-spondin1 üretmek için hücre hatlarını sağladığı için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı'ndan (2019YFA0111400), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (31970779) H.H.'ye ve Shandong Üniversitesi Gençler Arası ve İnovasyon Araştırma Grubu'ndan (2020QNQT003) H.H.'ye verilen hibelerle desteklendi.

Tüm fare deneyleri Shandong Üniversitesi Temel Tıp Bilimleri Okulu Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır ve İçişleri Bakanlığı yönergeleri ve yönetmelikleri uyarınca Lisansa göre gerçekleştirilmiştir (Hayır. ECSBMSSDU2019-2-079).
NOT: Bu protokol esas olarak izole primer hepatositlerden 3D organoidleri kültüre etmek için kullanılır.
1. Murine Hepatosit Organoid Kültürünün Kurulması
NOT: ...

<ol>
	<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+dish:+modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies.">Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 124-125 (2014).</li><li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+regenerative+medicine:+organogenesis+from+stem+cells+in+3D+culture.">Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Paola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+brain+organoids+reproducibly+form+cell+diversity+of+the+human+cerebral+cortex.">Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex.</a> Nature. 570, 523-527 (2019).</li><li>Atsuhiro, T., Ryuichi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-Order+Kidney+Organogenesis+from+Pluripotent+Stem+Cells.">Higher-Order Kidney Organogenesis from Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+single+Lgr5++liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration.">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li><li>Wang, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Expansion+of+Pancreatic+Islet+Organoids+from+Resident+Procr+++Progenitors.">Long-Term Expansion of Pancreatic Islet Organoids from Resident Procr + Progenitors.</a> Cell. 180 (6), 1198-1211 (2020).</li><li>Jarno, D., Hans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+in+cancer+research.">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18, 407-418 (2018).</li><li>Hans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids.">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Forbes, S. J., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+regeneration-mechanisms+and+models+to+clinical+application.">Liver regeneration-mechanisms and models to clinical application.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13 (8), 473-485 (2016).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Expansion+of+Primary+Human+Hepatocytes+with+Efficient+Liver+Repopulation+Capacity.">In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 806-819 (2018).</li><li>Katsuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+Terminally+Committed+Hepatocytes+to+Culturable+Bipotent+Progenitor+Cells+with+Regenerative+Capacity.">Conversion of Terminally Committed Hepatocytes to Culturable Bipotent Progenitor Cells with Regenerative Capacity.</a> Cell Stem Cell. 20 (1), 41-55 (2017).</li><li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Expansion+of+Functional+Mouse+and+Human+Hepatocytes+as+3D+Organoids.">Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li><li>Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Cytokine+TNFalpha+Promotes+the+Long-Term+Expansion+of+Primary+Hepatocytes+in+3D+Culture.">Inflammatory Cytokine TNFalpha Promotes the Long-Term Expansion of Primary Hepatocytes in 3D Culture.</a> Cell. 175 (6), 1607-1619 (2018).</li><li>Xiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+functional+maintenance+of+primary+human+hepatocytes+in+vitro.">Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro.</a> Science. 364 (6438), 399-402 (2019).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver.">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li><li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation.">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocol. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li></ol>

Olgun hepatositleri uzun süreler boyunca kültürleme yeteneği, karaciğer temel bilimi, ilaç toksikolojisi ve sıtma ve hepatit virüsleri gibi hepatotropik konak mikrobiyoloji enfeksiyonlarının incelenmesinde temeldir. İyi tanımlanmış bir niş ile, protokol burada hepatositler için bir kültür sistemi kurar. Bu protokol, olgun hepatositlerin hücre-hücre etkileşimini, çoğu hepatosit fonksiyonunu ve genetik değişiklikleri yeniden sağlayan bir heterojenlikle 3D kültüründe genişlemesini sağlar ve ge...

Organoidler, kendi kendini yenileyen kök hücreleri ve çok soylu farklılaştırılmış hücreleri içeren kendi kendine organize edilmiş, üç boyutlu (3D) in vitro kümelerdir1,2. Birçok organın organoidleri, bağırsak, beyin, kolon, böbrek, karaciğer, pankreas, tiroid, mide, cilt ve akciğer3,4,5,6,7 gibi iyi tanımlanmış niş faktörlerle pluripotent veya yetişkin kök hücrelerinden kurulmuştur. . Organoidler, hastalık araştırma ve tedavisinde yeni yollar açan gelişim (embriyonik veya indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden, PSC'lerden) veya homeostaz/rejenerasyon ilerlemesini (yetişkin kök hücrelerinden, ASC'lerden kaynaklanır) taklit ederek fiziksel hücre fonksiyonlarını yeniden kapsüllerler8,9.
Memelilerde en büyük organ olarak, karaciğer esas olarak depolama, metabolizma ve detoksifikasyondan sorumludur. İki tür epitel hücre tipi, hepatositler ve kolanjiositler, bir karaciğer lobüllerinin temel birimini oluşturur. Hepatositler karaciğer fonksiyonlarının % 70-80'inden sorumludur10. Karaciğer olağanüstü rejenerasyon kapasitesine sahip olmasına rağmen, hepatosit özelliklerinin hızlı kaybı, düzensiz hücre polarizasyonu ve adanmışlık ile geleneksel monolayer kültleme sırasında meydana gelir ve bu da araştırmacıların ve klinisyenlerin bir tabakta 'boşluk köprüleme' karaciğer modelleri inşa etme ihtiyacını arttırır. Bununla birlikte, yakın zamana kadar birincil hepatositlerden ex vivo genişletme modelleri iyi kurulmamıştı11,12,13,14,15. Karaciğer organoidleri embriyonik/indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden, fibroblast hepatosit benzeri hücrelere ve dokudan türetilmiş hücrelerden kurulabilir. Karaciğer organoidlerinin gelişimi, ilaç elekleri ve karaciğer toksisitesi tahlilleri için bir in vitro modelin uygulanmasını artırır16,17.
Burada, murine primer hepatositlerden karaciğer organoidleri oluşturmak için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Bu protokolü kullanarak, kollajenazın iki perfüzyonu ile hepatosit organoidlerinden oluşan bir in vitro kültür sistemi kurduk. Bu organoidler aylarca uzun süreli genişleme için geçiş yapılabilir. Fizyolojik fonksiyonları hepatositlerle oldukça uyumludur. Ayrıca, organoidler kullanılarak lentivirüs enfeksiyonu, siRNA transdüksiyonu ve CRISPR-Cas9 mühendisliği gibi genetik manipülasyonun nasıl gerçekleştirildiğinin ayrıntılı bir açıklamasını da sunuyoruz. Hepatosit organoidlerinin yayılması, karaciğer biyolojisini anlamak ve kişiselleştirilmiş ve çevirisel tıp yaklaşımları geliştirmek için organoid kullanma olasılığına ışık tutmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Perfusion Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A600077-0100</td>
			<td>3.50 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100188-0500</td>
			<td>9.00 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100395-0500</td>
			<td>4.00 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>1.51 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501218-0001</td>
			<td>80.0 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A610404-0500</td>
			<td>0.78 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A500873-0500</td>
			<td>3.50 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol Red</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100882-0025</td>
			<td>0.06 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501330-0005</td>
			<td>0.50 M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1639</td>
			<td>0.10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>C621110-0010</td>
			<td>23.80 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A100395-0500</td>
			<td>4.00 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4&#183;12H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501727-0500</td>
			<td>1.51 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A501218-0001</td>
			<td>80.0 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;2H2O</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A610404-0500</td>
			<td>0.78 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>A500873-0500</td>
			<td>3.50 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip-wash Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10091148</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C14190500BT0</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>&#160;A600135-0025</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
			<td>Stock concentration 500 &#181;M, final 
			concentration 2 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12634-010</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement 50x, minus vitamin A</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1704-044</td>
			<td>50 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chir 99021</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td>Stock concentration 30 mM, final 
			concentration 3 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330032</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gastrin I</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3006</td>
			<td>Stock concentration 100 mM, final 
			concentration 10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel martix</td>
			<td>BD</td>
			<td>356231</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylcysteine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Stock concentration 500 mM, final 
			concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nictinamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
			<td>Stock concentration 1 M, final concentration 3 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>&#160;A600135-0025</td>
			<td>100 X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml,final concentration 50 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human HGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 25 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TGF-&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-16A</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human TNF-&#945;</td>
			<td>Origene</td>
			<td>TP750007-1000</td>
			<td>Stock concentration 100 &#181;g/ml, final concentration 100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rho kinase inhibitor Y-27632</td>
			<td>Abmole Bioscience</td>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rspondin-1conditioned medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable cell line generated in the Hu Lab. Final concentration 15%.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPT01RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 # silicone tube</td>
			<td>LangerPump</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well, suspension</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>GN662102-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C Water Bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m filter</td>
			<td>BD</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>stemcell</td>
			<td>AT-104</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CTNNB1</td>
			<td>BD</td>
			<td>610154</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH</td>
			<td>CST</td>
			<td>5174S</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HDAC7</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab50212</td>
			<td>Mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-KI67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15580</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>CCL-170B-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>542700097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>AC2-4S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>&#160;A100231</td>
			<td>stored at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Color Imaging Systems</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AME4300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hdac3 siRNA</td>
			<td>Guangzhou RiboBio Co., Ltd.</td>
			<td>siG2003180909192555</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hdac7 lentivirus</td>
			<td>ShanghaiGenePharmaCo.,Ltd</td>
			<td>LV2020-2364</td>
			<td>stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitrans G A</td>
			<td>Shanghai Genechem Co.,Ltd.</td>
			<td>REVG004</td>
			<td>Increased virus infection efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Pro Plus software</td>
			<td>Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA</td>
			<td>version 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778150</td>
			<td>Increased virus infection efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live cell dye</td>
			<td>Luna</td>
			<td>F23001</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-speed desktop centrifuge</td>
			<td>cence</td>
			<td>TD5A-WS/TD5AWS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofactor-&#945; 2b Device</td>
			<td>Lonza</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Sangon Bitech</td>
			<td>F621006-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>LangerPump</td>
			<td>BT100-2J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Activate with methanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX458</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>48138</td>
			<td>stored at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific Heraeus</td>
			<td>Labofuge 400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSL3</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-100218A</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 4 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibico</td>
			<td>25200072</td>
			<td>stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wee1 siRNA</td>
			<td>Guangzhou RiboBio Co., Ltd.</td>
			<td>siG2003180909205971</td>
			<td>stored at -20 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and genetic manipulation of murine hepatocyte organoids

Karaciğer memelilerdeki en büyük organdır. Glikoz depolama, protein salgılama, metabolizma ve detoksifikasyonda önemli bir rol oynar. Karaciğer fonksiyonlarının çoğu için uygulayıcı olarak, birincil hepatositler sınırlı çoğalma kapasitesine sahiptir. Bu, karaciğer fizyolojik ve patolojik araştırmalar için ex vivo hepatosit genleşme modellerinin kurulmasını gerektirir. Burada, murine hepatositleri iki adım kollajenaz perfüzyonu ile izole ettik ve hücre-hücre etkileşimlerini ve fiziksel fonksiyonları yeniden oluşturmak için 'mini karaciğer' olarak 3D organoid kültürü kurduk. Organoidler, progenitörler ve olgun hepatositler de dahil olmak üzere heterojen hücre popülasyonlarından oluşur. 2-3 hafta içinde organoid oluşturmak için murine hepatositleri veya fetal hepatositleri izole etmek ve kültüre etmek ve mekanik olarak yukarı ve aşağı pipetleyerek nasıl geçişlerini göstereceğimizi göstermek için süreci ayrıntılı olarak tanıtıyoruz. Ek olarak, shRNA / ektopik yapı, siRNA transfeksiyonu ve CRISPR-Cas9 mühendisliğinin lentivirüs enfeksiyonu için organoidlerin tek hücreye nasıl sindirileceğini de tanıtacağız. Organoidler, karaciğer biyolojisi ve patobiyolojisi modellenerek ilaç elekleri, hastalık modellemesi ve temel karaciğer araştırmaları için kullanılabilir.

Dişi Alb-Cre'den hepatatit organoidleri; Rosa26-GFP fare (8 hafta) tohumlamadan beş gün sonra gözlendi (Şekil 1A). Organoidler Ki67 pozitif lekeleme ile çoğalmaktadır (Şekil 1B). Hepatosit organoidlerinde siRNA transfeksiyonu veya lentivirüs enfeksiyonu ile temsili genlerin müdahale edici ekspresyonu qRT-PCR ve batı blotu ile incelendi. Sonuçlar Şekil 2A ve 2B'de gösterilmiştir. ...

Watch this Scientific Journal Video about Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids at JoVE.com

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

Fare hepatatitlerinden uzun süreli ek vitro 3D organoid kültür sistemi kuruldu. Bu organoidler shRNA/ektopik yapı, siRNA transfeksiyonu ve CRISPR-Cas9 mühendisliğinin lentivirüs enfeksiyonu ile geçiş ve genetik olarak manipüle edilebilir.

Murine Hepatosit Organoidlerinin Kurulması ve Genetik Manipülasyonu

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

Karaciğer memelilerde en büyük organdır. Metabolizma ve detoksifikasyonda çok önemli rol oynar. Karaciğer in vitro olarak olağanüstü bir rejenerasyon kapasitesine sahip olmasına rağmen, hepatosit in-vitro kültürü için uzun vadede hala çok büyük bir zorluktur.Burada olgun hepatositlerden hepatosit organoidlerini kuruyoruz. Hepatatositlerin ana özelliklerini morfoloji ve fonksiyonda tutar. Bu videoda, bu organoidlerin nasıl kültürlenecekleri ve geçişleri ve bu organoidlerin genetik modifikasyonunun nasıl gerçekleştirileceği ayrıntılı olarak tanıtılacaktır.İlk olarak, karaciğer perfüzyonu ve sindirimi. Tüm bölgeleri ve aletleri hazırlayın ve steril hale getirin. Fareyi yıkayın ve epidermal ve cildi açın ve ardından karaciğerin kese fırınını bulmaya çalışın.İğneleri içine enjekte et ve bunu yakala. Karaciğer soluklaşana kadar perfüzyonu dakikada beş mililitre hızında yapın. Onları perfüzyon tamponuna değiştirin, dikkatlice yerleştirin, yumuşayana kadar karaciğeri izleyin.Genellikle üç ila beş dakika sürer, sonra karaciğeri kesin ve plakalara koyun ve makasla küçük parçalara ayırın. Sık sık yukarı ve aşağı pep. Genellikle, onları tek hücreye yapmak 10 ila 15 dakika sürer.Ve sonra 10 ila 15 dakika ile yukarı ve aşağı pep ve fitter ile onları beslemek. Onları tek bir hücreye dönüştür. 50 mililitrelik tüpteki tüm hücreleri toplayın ve hız ile santrifüj edin ve ardından plaka başına tüm hücreleri toplayın.Onları her zaman soğuk buzda tutmaya çalış. Tek hücreli süspansiyonları yapın ve hücre sayacıyla sayın. Genellikle hepatositler mutluysa, canlı floresan vardır.İkinci bölümde, hücreleri oturtmaya ve organoid kültürünü yapmaya çalışıyoruz. Tüm hücre süspansiyonlarını topluyoruz ve hücreleri belirli bir konsensyonla sayıyoruz ve sonra. Metrogeller. ve kod ortamı.Genellikle, orta ve metrogellerle, 1 ila 2 veya 1 ila 3 oranında alırız. Dikkatlice karıştırdıktan sonra, degrade plakalara oturtacağız. Genellikle 24 plakaya 100 mikrolitre ekliyoruz.Onları 37 derece sıcaklıkta inkübatöre koyun. 20 dakika sonra, altta altta ve daha sonra ortada alt ile ters öne koyuyoruz. İki ya da üç günlük karşı koymayla, genellikle organoidlerin çıktığını görürüz.Bu organoidlerimizin tipik görüntüsüdür. Geçişi yapmak veya genetik modifikasyon yöntemi yapmak istiyorsak genellikle organoidlerden tek hücrelere ihtiyacımız var Tüm organoidleri karşı plakalardan kat yıkama tamponu ile toplarız. Süpernatantı düşürüyoruz, sonra palto yıkama tamponuna tabağa, karıştırıyoruz, bu yüzden yukarı ve aşağı pep.Ve sonra genellikle tüm uçları yıkama bantları tamponu ile önceden yıkarız. Tüm organoidlerin uçlara uçmasını önlemek için. Ve sonra, buzda yeni bir partiyle ya da onsuz, tüm organoidleri centro-fusion ile topluyoruz.Onları tedavi ediyoruz, tüm metrogelleri çıkarmak için bir ışıltı var. Buz üzerinde 20 ila 30 dakika kuluçkadan sonra tüm metrogeller kaldırılır. Tüm temiz organoidleri topluyoruz ve tek hücre haline getirmek için tripsin ekliyoruz.Tripsin eklendikten sonra organoidleri inkübatöre tedavi ediyoruz. Karaciğer organoidlerinin tek hücreli olması 5 ila 10 dakika sürer. Triplatin durdurmak için daha fazla yıkama tamponu ekliyoruz.Ve sonra onlara doğru aşağı yukarı moral ver. Opsiyon işlemi için, tüm tripsinleri çıkarmak için bir kez daha yıkayabilirsiniz. Centrofusion ile yıkadıktan sonra, onları hücre sayacının altında sayabiliriz.Daha sonra bu hepatosit organoidlerinin nasıl işlem yapılacağını veya transfeksiyonunun nasıl yapılacağını göstereceğiz. İlk olarak, ne yapacağınızı tüpleri etiketleyin ve sonra üreticinin talimatlarına göre görme transfeksiyonunu yapacağız. İhtiyacın olan, LIPOYL gerçeğinin INI MaX'i evcilleştirme naibi.Biz de ekliyoruz. kontrol ve spesifik gen siRNA, ve üreticinin talimatlarına göre optimum ile onları kuluçkaya. Ve sonra hücre konsantrasyonuna göre RAN max'i ekleyip iyice karıştırıyoruz.Daha sonra RAN max'i optimum ile ayrı ayrı ekleyip buza koyuyoruz. 5 dakika sonra, farklı siRNA'lar, Spesifik gen RANi ve II kontrolü ile ayrı RAN max karışımını ayrı ayrı pep pep ve iyice karıştırın. Onları tekrar buza koyun, ve sonra tüm organoidleri toplarız, yavaş centrofusion, tüm süpernatantı bırakırız, RNAi max'i, siRNA karışımını bu hücre plakasına ekleriz ve iyice yukarı ve aşağı pepleriz.Kısaca, hücreler ve etiket RNAi max ve siRNA karışımı gentrifikasyon ve 37 derecede 4 ila 5 saat kuluçka edildi. Son bölüm, bu hepatosit organoidleri de Lenti virüsü tarafından enfekte olabilir. Benzer mesaj siRNA transfection olarak gerçekleştirildi.Kontrol ve siRNA virüs tüpleri iyi hazırlanmıştır ve optimum üreticinin talimatlarına göre eklenmiştir. Daha sonra poli yeşil gibi enfeksiyon bölgeleri ile ve daha sonra üreticinin talimatlar anayasasına göre farklı Lenti virüsü ekliyoruz. Organoid kültüründeki tek hücreli süspansiyonları ve 1,5 mililitre eppendorf tüplerindeki çeşitli parçacıkları birleştirin, ekleyin, iyice karıştırın Bu karışımı tabaklayın ve 32 derecede 1 saat konsantre edin.Konsantre füzyonu 500 G'de gerçekleştirilecek ve 37 derecede 4 ila 5 saat kuluçkadan sonra hücre süspansiyonu toplanacak ve metrogelde oturtılacaktır. Ve onları tekrar kuvöze koy. Oluşum verimliliği veya diğer fonksiyonel analizler üzerindeki organ 7 ila 10 gün sonra yapılabilir.İşte temsili sonuçlarımız. Şekil 1A'da, fareden ALB-Cre Rosa 26-GFP veya RFP hepatosit organoidimizi görebilirsiniz. Şekil 1B'de, hepatatit organoidlerimizin çoğaldığını gösteren lekelemede Ki67 pozitif sinyalini görebiliyorsunuz.Şekil 2A ve 2B'de genlerimizin müdahale edici ekspresyonunun temsili bir gen ifadesi vardır. Hepatatit organoidlerinde genetik manipülasyondan sonra, müdahale edici etkili çok etkilidir. İşte şekil 2C, murine organoidlerimizde carsonite teknolojisi ile genetik manipülasyondan sonra görebilirsiniz.Sonuç olarak, sonuçlarımız hepatosit organoidlerinin in vitro olarak genişletilebileceğini ve genetik olarak manipüle edilebileceğini gösterdi. Özetle, bu videoda karaciğer perfüzyon ve sindiriminin hepatositleri almak için nasıl yapacağını gösteriyoruz. Hepatositler nasıl yakalanır ve hepatositler organoidleri nasıl geçirilır.Ayrıca, bu organoidlerin genetiğinin değiştirilmesini yapmak için siRNA ve vektör transfeksiyonunun veya Lenti virüs enfeksiyonunun nasıl yapacağını gösterdik. Ayrıca organoidlerimizde iki eksiklik var. İlk olarak, hepatatitleri saflamak için çekirdek veya kürk çekirdeği başına kullanmadık.ve ikinci olarak, organoidlerin büyüme süresini iyileştirmek için daha fazla büyüme faktörü ve sinyalizasyon denenmesi gerektiğini düşünüyorum.

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

Erken Civciv Embriyolar ex vivo (Kültür) Kültür Yöntemi

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Erken Civciv Embriyolar in situ Hibridizasyon Çift Tüm Dağı

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Konfokal Görüntüleme İzolasyon ve Yetişkin kardiyak miyositler Genetik Manipülasyon

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers

DNA Elektroporasyon, Myofibers İzolasyon ve Görüntüleme

Mature muscle has a unique structure that is amenable to live cell imaging. Herein, we describe the experimental protocol for expressing fluorescently ...

An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation

Fare Primer Hepatosit İzolasyonu için Geliştirilmiş Zaman ve İş Gücü Verimli Protokolü

Primary hepatocytes are used extensively in liver in vitro research, especially in glucose metabolism studies. A base technique has been adapted based on ...

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

Murine Bağırsak Organoidlerinde Reaktif Oksijen Türlerine Duyarlı Florojenik Prob Kullanılarak Oksidatif Stresin Analizi

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

The Establishment of a Murine Mandibular Molar Extraction Socket Healing Model

Murin Mandibuler Molar Ekstraksiyon Soket İyileştirme Modelinin Kurulması

This study introduces the development of a molar extraction model in the murine mandible to provide a practicable model for studying alveolar bone ...

Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids

Fare ve İnsan Lakrimal Bezi Organoidlerinin Kurulması, Bakımı, Farklılaşması, Genetik Manipülasyonu ve Transplantasyonu

The lacrimal gland is an essential organ for ocular surface homeostasis. By producing the aqueous part of the tear film, it protects the eye from ...

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Ex Vivo Polivinil Alkol Bazlı Kültürlerde Fare Hematopoetik Kök Hücrelerinin Genleşmesi ve Genetik Manipülasyonu

Self-renewing&#160;multipotent&#160;hematopoietic stem cells (HSCs) are an important cell type due to their abilities to support hematopoiesis throughout ...

Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers

Kriyokorunmuş Epitel Kriptlerinden Domuz Yavrusu Bağırsak 3D Organoidlerinin Kültürü ve Hücre Tek Katmanlarının Oluşturulması

Intestinal organoids are increasingly being used to study the gut epithelium for digestive disease modeling, or to investigate interactions with drugs, ...