Name: tumor transplantation for assessing the dynamics of tumor-infiltrating cd8+ t cells in mice
Uploaded: 2021-06-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice at JoVE.com

Cette étude a été soutenue par des subventions du National Natural Science Fund for Distinguished Young Scholars (n ° 31825011 à LY) et de la National Natural Science Foundation of China (n ° 31900643 à QH, n ° 31900656 à ZW).

Toutes les expériences sur la souris ont été réalisées conformément aux directives des comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux de la troisième université médicale militaire. Utilisez des souris C57BL/6 âgées de 6 à 8 semaines et des souris transgéniques OT-I naïves pesant de 18 à 22 g. Utilisez à la fois l’homme et la femme sans randomisation ni « aveugle ».
1. Préparation du milieu et des réactifs
<ol><li>Préparer le milieu de culture cellulai...

<ol>
	<li>Blank, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+'T+cell+exhaustion.">Defining 'T cell exhaustion.</a> Nature Reviews Immunology. 19 (11), 665-674 (2019).</li><li>Leko, V., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+and+targeting+human+tumor+antigens+for+T+cell-based+immunotherapy+of+solid+tumors.">Identifying and targeting human tumor antigens for T cell-based immunotherapy of solid tumors.</a> Cancer Cell. 38 (4), 454-472 (2020).</li><li>McLane, L. M., Abdel-Hakeem, M. S., Wherry, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+T+cell+exhaustion+during+chronic+viral+infection+and+cancer.">CD8 T cell exhaustion during chronic viral infection and cancer.</a> Annual Review of Immunology. 37, 457-495 (2019).</li><li>Davis, M. M., Brodin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebooting+human+immunology.">Rebooting human immunology.</a> Annual Review of Immunology. 36, 843-864 (2018).</li><li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+immune+checkpoint+therapy.">The future of immune checkpoint therapy.</a> Science. 348 (6230), 56-61 (2015).</li><li>Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Releasing+the+brakes+on+cancer+immunotherapy.">Releasing the brakes on cancer immunotherapy.</a> Cell. 373 (16), 1490-1492 (2015).</li><li>Verma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+blockade+in+subprimed+CD8+cells+induces+dysfunctional+PD-1(+)CD38(hi)+cells+and+anti-PD-1+resistance.">PD-1 blockade in subprimed CD8 cells induces dysfunctional PD-1(+)CD38(hi) cells and anti-PD-1 resistance.</a> Nature Immunology. 20, 1231-1243 (2019).</li><li>Hashimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+T+cell+exhaustion+in+chronic+infection+and+cancer:+opportunities+for+interventions.">CD8 T cell exhaustion in chronic infection and cancer: opportunities for interventions.</a> Annual Review of Medicine. 69, 301-318 (2018).</li><li>Dammeijer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PD-1/PD-L1-checkpoint+restrains+T+cell+immunity+in+tumor-draining+lymph+nodes.">The PD-1/PD-L1-checkpoint restrains T cell immunity in tumor-draining lymph nodes.</a> Cancer Cell. 38 (5), 685-700 (2020).</li><li>Buchwald, Z. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-draining+lymph+node+is+important+for+a+robust+abscopal+effect+stimulated+by+radiotherapy.">Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 8 (2), 000867 (2020).</li><li>Philip, M., Schietinger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+fate+choice:+T+cell+exhaustion+in+cancer+and+chronic+infections.">Heterogeneity and fate choice: T cell exhaustion in cancer and chronic infections.</a> Current Opinion in Immunology. 58, 98-103 (2019).</li><li>Miller, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsets+of+exhausted+CD8(+)+T+cells+differentially+mediate+tumor+control+and+respond+to+checkpoint+blockade.">Subsets of exhausted CD8(+) T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade.</a> Nature Immunology. 20, 326-336 (2019).</li><li>Wu, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+T+cell+expansion+predicts+tumour+infiltration+and+clinical+response.">Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response.</a> Nature. 579, 274-278 (2020).</li><li>Im, S. J., Konieczny, B. T., Hudson, W. H., Masopust, D., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1++stemlike+CD8+T+cells+are+resident+in+lymphoid+tissues+during+persistent+LCMV+infection.">PD-1+ stemlike CD8 T cells are resident in lymphoid tissues during persistent LCMV infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 117 (8), 4292-4299 (2020).</li><li>Beltra, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+relationships+of+four+exhausted+CD8(+)+T+cell+subsets+reveals+underlying+transcriptional+and+epigenetic+landscape+control+mechanisms.">Developmental relationships of four exhausted CD8(+) T cell subsets reveals underlying transcriptional and epigenetic landscape control mechanisms.</a> Immunity. 52 (5), 825-841 (2020).</li><li>Myers, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+subset+of+CD8(+)+T+cells+during+chronic+exhaustion+is+defined+by+SIRPalpha+expression.">A functional subset of CD8(+) T cells during chronic exhaustion is defined by SIRPalpha expression.</a> Nature Communications. 10 (1), 794 (2019).</li><li>Jansen, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intra-tumoral+niche+maintains+and+differentiates+stem-like+CD8+T+cells.">An intra-tumoral niche maintains and differentiates stem-like CD8 T cells.</a> Nature. 576, 465-470 (2019).</li><li>Jadhav, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+signature+of+PD-1++TCF1++CD8+T+cells+that+act+as+resource+cells+during+chronic+viral+infection+and+respond+to+PD-1+blockade.">Epigenetic signature of PD-1+ TCF1+ CD8 T cells that act as resource cells during chronic viral infection and respond to PD-1 blockade.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 116 (28), 14113-14118 (2019).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+CD8+T+cells+form+a+proliferative,+dynamically+regulated+compartment+within+human+melanoma.">Dysfunctional CD8 T cells form a proliferative, dynamically regulated compartment within human melanoma.</a> Cell. 176 (4), 775-789 (2018).</li><li>Kurtulus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Checkpoint+blockade+immunotherapy+induces+dynamic+changes+in+PD-1(-)CD8(+)+tumor-infiltrating+T+cells.">Checkpoint blockade immunotherapy induces dynamic changes in PD-1(-)CD8(+) tumor-infiltrating T cells.</a> Immunity. 50 (1), 181-194 (2019).</li><li>Fransen, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-draining+lymph+nodes+are+pivotal+in+PD-1/PD-L1+checkpoint+therapy.">Tumor-draining lymph nodes are pivotal in PD-1/PD-L1 checkpoint therapy.</a> JCI Insight. 3 (23), 124507 (2018).</li><li>E, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8(+)CXCR5(+)+T+cells+in+tumor-draining+lymph+nodes+are+highly+activated+and+predict+better+prognosis+in+colorectal+cancer.">CD8(+)CXCR5(+) T cells in tumor-draining lymph nodes are highly activated and predict better prognosis in colorectal cancer.</a> Human Immunology. 79 (6), 446-452 (2018).</li><li>Snell, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8(+)+T+cell+priming+in+established+chronic+viral+infection+preferentially+directs+differentiation+of+memory-like+cells+for+sustained+immunity.">CD8(+) T cell priming in established chronic viral infection preferentially directs differentiation of memory-like cells for sustained immunity.</a> Immunity. 49 (4), 678-694 (2018).</li><li>Siddiqui, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral+Tcf1(+)PD-1(+)CD8(+)+T+cells+with+stem-like+properties+promote+tumor+control+in+response+to+vaccination+and+checkpoint+blockade+immunotherapy.">Intratumoral Tcf1(+)PD-1(+)CD8(+) T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy.</a> Immunity. 50 (1), 195-211 (2019).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+TCF1+preserves+the+effector+function+of+exhausted+CD8+T+cells+during+chronic+viral+infection.">The transcription factor TCF1 preserves the effector function of exhausted CD8 T cells during chronic viral infection.</a> Frontiers in Immunology. 10, 169 (2019).</li><li>Krishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-like+CD8+T+cells+mediate+response+of+adoptive+cell+immunotherapy+against+human+cancer.">Stem-like CD8 T cells mediate response of adoptive cell immunotherapy against human cancer.</a> Science. 370 (6522), 1328-1334 (2020).</li><li>Yost, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+replacement+of+tumor-specific+T+cells+following+PD-1+blockade.">Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade.</a> Nature Medicine. 25, 1251-1259 (2019).</li><li>Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillere, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+in+oncoimmunology.">Mouse models in oncoimmunology.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl6+preserves+the+suppressive+function+of+regulatory+T+cells+during+tumorigenesis.">Bcl6 preserves the suppressive function of regulatory T cells during tumorigenesis.</a> Frontiers in Immunology. 11, 806 (2020).</li><li>Yu, D., Ye, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+portrait+of+CXCR5(+)+follicular+cytotoxic+CD8(+)+T+cells.">A portrait of CXCR5(+) follicular cytotoxic CD8(+) T cells.</a> Trends in Immunology. 39 (12), 965-979 (2018).</li><li>Bracci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophosphamide+enhances+the+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+immune+cells+through+the+induction+of+cytokine+expression,+B-cell+and+T-cell+homeostatic+proliferation,+and+specific+tumor+infiltration.">Cyclophosphamide enhances the antitumor efficacy of adoptively transferred immune cells through the induction of cytokine expression, B-cell and T-cell homeostatic proliferation, and specific tumor infiltration.</a> Clinical Cancer Research. 13 (2), 644-653 (2007).</li><li>Salem, M. L., El-Naggar, S. A., Mahmoud, H. A., Elgharabawy, R. M., Bader, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophosphamide+eradicates+murine+immunogenic+tumor+coding+for+a+non-self-antigen+and+induces+antitumor+immunity.">Cyclophosphamide eradicates murine immunogenic tumor coding for a non-self-antigen and induces antitumor immunity.</a> International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 32, 1-5 (2018).</li><li>Thorsson, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Immune+landscape+of+cancer.">The Immune landscape of cancer.</a> Immunity. 48 (4), 812-830 (2018).</li></ol>

L’immunité médiée par les lymphocytes T joue un rôle crucial dans les réponses immunitaires contre les tumeurs, les CTL jouant le rôle principal dans l’éradication des cellules cancéreuses. Cependant, les origines des CTL spécifiques de l’antigène tumoral dans le TME n’ont pas été élucidées30. L’utilisation de ce protocole de transplantation tumorale a fourni un indice important que les lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène intratumoral peuvent ne pas ...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62442">Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+&#160;T Cells in Mice</a>. The Protocol&#160;was&#160;updated.
Step 6.10 of the Protocol was updated from:
Administer penicillin every 8-12 h after the surgery for 3 days. Monitor the mouse&#39;s eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered. 
NOTE: The administration of buprenorphine is suggested to prevent post-surgical pain [delete sentence]. The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
to:
Administer buprenorphine subcutaneously at a dose of 0.1 mg/kg body weight every 8 h three times after surgery to alleviate the pain. Monitor the mouse&#39;s eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered. 
NOTE: The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62442">Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+&#160;T Cells in Mice</a>. The Protocol&#160;was&#160;updated.

Erratum: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

La réponse immunitaire médiée par les lymphocytes T CD8+ joue un rôle central dans le contrôle de la croissance tumorale. Au cours de la tumorigenèse, les lymphocytes T CD8+ naïfs sont activés lors de la reconnaissance de l’antigène d’une manière restreinte au CMH de classe I, puis se différencient en cellules effectrices et s’infiltrent dans la masse tumorale 1,2. Cependant, dans le microenvironnement tumoral (TME), une exposition prolongée à l’antigène, ainsi que des facteurs immunosuppresseurs, conduisent les lymphocytes T CD8+ spécifiques à la tumeur infiltrés dans un état hyporésensible connu sous le nom d'« épuisement »3. Les lymphocytes T épuisés (Tex) sont distincts des lymphocytes T effecteurs ou mémoire générés lors d’une infection virale aiguë, à la fois transcriptionnellement et épigénétiquement. Ces cellules Tex sont principalement caractérisées par l’expression soutenue et élevée d’une série de récepteurs inhibiteurs ainsi que par la perte hiérarchique des fonctions effectrices. En outre, l’altération de la capacité proliférative des lymphocytes T CD8+ épuisés entraîne une diminution du nombre de lymphocytes T spécifiques à la tumeur, de sorte que les lymphocytes T CD8+ résiduels dans le TME peuvent à peine fournir une immunité protectrice suffisante contre la progression tumorale3. Ainsi, le maintien ou le renforcement des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène intratumoral est indispensable à la répression tumorale.
De plus, on pense que la thérapie de blocage des points de contrôle immunitaires (ICB) revigore Tex dans les tumeurs en augmentant l’infiltration des lymphocytes T et, par conséquent, le nombre de lymphocytes T et en rajeunissant les fonctions des lymphocytes T pour stimuler la répression tumorale. L’application généralisée du traitement par ICB a changé le paysage du traitement du cancer, avec un sous-ensemble substantiel de patients présentant des réponses durables 4,5,6. Néanmoins, la majorité des patients et des types de cancer ne répondent pas ou seulement temporairement à l’ICB. Une infiltration inadéquate des lymphocytes T dans le TME a été postulée comme l’un des mécanismes sous-jacents expliquant la résistance iCB 7,8.
Plusieurs études ont démontré l’hétérogénéité des lymphocytes T CD8+ (TIL) infiltrant les tumeurs chez les patients et les modèles murins 9,10,11,12. Il a été confirmé qu’un sous-ensemble de lymphocytes T CD8+ exprimant le facteur T-1 (TCF1) dans une masse tumorale présente des propriétés semblables à celles des cellules souches, ce qui pourrait donner lieu à des lymphocytes T épuisés en phase terminale et est responsable de l’éclatement de la prolifération après le traitement par ICB 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Cependant, il a été prouvé que seule une faible proportion de lymphocytes TCF1+CD8+ spécifiques de l’antigène existent dans le TME et génèrent un pool élargi de descendance différenciée en réponse à l’ICB 23,24,25,26. On ne sait pas si la taille limitée de cette population est suffisante pour assurer la persistance des lymphocytes T cytotoxiques (LCR) pour contrôler la progression tumorale, et s’il y a réapprovisionnement des tissus périphériques nécessite des recherches plus approfondies. En outre, des recherches récentes suggèrent la capacité de revitalisation insuffisante des lymphocytes T spécifiques de la tumeur préexistants et l’apparition de nouveaux clonotypes auparavant inexistants après un traitement antiprogrammé de la protéine de mort cellulaire 1. Cela indique que la réponse des lymphocytes T au blocage des points de contrôle peut être due au nouvel afflux d’un répertoire distinct de clones de lymphocytes T27. Avec la présence de la fraction de lymphocytes T cytotoxiques non réactifs à la tumeur dans le TME, ces résultats ont incité à l’établissement d’un modèle d’allogreffe tumorale pour étudier le rôle des lymphocytes T CD8+ dérivés de la périphérie11.
Jusqu’à présent, plusieurs types d’implantation tumorale, ainsi que le transfert adoptif de cellules immunitaires, ont été largement utilisés dans le domaine de l’immunologie tumorale28. Les TIL, les cellules mononucléaires du sang périphérique et les cellules immunitaires réactives à la tumeur provenant d’autres tissus peuvent être bien caractérisés à l’aide de ces méthodes. Cependant, lors de l’étude des interactions entre l’immunité antitumorale systémique et locale, ces modèles semblent inadéquats pour examiner les interactions entre les cellules immunitaires dérivées de la périphérie et le TME. Ici, les tissus tumoraux ont été transplantés de donneurs dans des souris receveuses appariées par tumeur pour suivre avec précision l’afflux de cellules immunitaires dérivées de receveurs et observer les cellules dérivées de donneurs dans le TME en concomitance.
Dans cette étude, un modèle syngénique murin du mélanome a été établi avec la lignée cellulaire de mélanome B16F10-OVA, qui exprime de manière stable l’ovalbumine néoantigène de substitution. Les souris OT-I transgéniques TCR, dans lesquelles plus de 90% des lymphocytes T CD8+ reconnaissent spécifiquement le peptide dérivé de l’OVA OVA OVA257-264 (SIINFEKL) lié à la molécule H2-Kb du CMH de classe I, permettent l’étude des réponses des lymphocytes T spécifiques à l’antigène développées dans le modèle tumoral B16F10-OVA. En combinant ce modèle avec la transplantation tumorale, les réponses immunitaires des lymphocytes T CD8+ spécifiques à l’antigène inhérents à la tumeur et d’origine périphérique ont été comparées pour révéler une transition dynamique entre ces deux populations. Collectivement, cette conception expérimentale a fourni une autre approche pour étudier avec précision les réponses immunitaires des lymphocytes T CD8+ dans le TME, ce qui jette un nouvel éclairage sur la dynamique des réponses immunitaires des lymphocytes T spécifiques à la tumeur dans le TME.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL tuberculin syringe</td>
			<td>KDL</td>
			<td>BB000925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tube</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG2211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 U insulin syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>320310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>BEAVER</td>
			<td>43008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T48402-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methyl-2-butanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>240486-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m nylon cell strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD45.1</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>110714</td>
			<td>Clone:A20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16F10-OVA cell line</td>
			<td>bluefbio</td>
			<td>BFN607200447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-V (bovine serum albumin)</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>bs-0292P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 Mouse Anti-Mouse CD45.2</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>562895</td>
			<td>Clone:104</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture dish</td>
			<td>BEAVER</td>
			<td>43701/43702/43703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R-A462/5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyclophosphamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0768-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>19853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>EDS-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACSCanto II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>PorLab Scientific</td>
			<td>HM330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>RWD life science</td>
			<td>R510-22-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KHCO3</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501195-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L10199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle carrier</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>F31034-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501569-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0099-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse TCR V&#945;2</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>127808</td>
			<td>Clone:B20.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep Glutamine (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100734</td>
			<td>Clone:53-6.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical forceps</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>F12005-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical scissors</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>S12003-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suture thread</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>F34004-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tumor transplantation for assessing the dynamics of tumor-infiltrating cd8+ t cells in mice

L’immunité médiée par les lymphocytes T joue un rôle crucial dans les réponses immunitaires contre les tumeurs, les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) jouant le rôle principal dans l’éradication des cellules cancéreuses. Cependant, les origines et la reconstitution des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène tumoral dans le microenvironnement tumoral (TME) restent obscures. Ce protocole utilise la lignée cellulaire de mélanome B16F10-OVA, qui exprime de manière stable le néoantigène de substitution, l’ovalbumine (OVA) et les souris OT-I transgéniques TCR, dans lesquelles plus de 90% des lymphocytes T CD8+ reconnaissent spécifiquement le peptide dérivé de l’OVA OVA257-264 (SIINFEKL) lié à la molécule H2-Kb du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe I. Ces caractéristiques permettent d’étudier les réponses des lymphocytes T spécifiques de l’antigène au cours de la tumorigenèse.
En combinant ce modèle avec la chirurgie de transplantation tumorale, les tissus tumoraux de donneurs ont été transplantés dans des souris receveuses syngéniques appariées à une tumeur pour tracer avec précision l’afflux de cellules immunitaires dérivées du receveur dans les tissus de donneurs transplantés, permettant l’analyse des réponses immunitaires de CD8+ spécifiques à l’antigène inhérent à la tumeur et d’origine périphérique Lymphocytes T. Une transition dynamique s’est produite entre ces deux populations. Collectivement, cette conception expérimentale a fourni une autre approche pour étudier avec précision les réponses immunitaires des lymphocytes T CD8+ dans le TME, ce qui apportera un nouvel éclairage sur l’immunologie tumorale.

Le schéma de ce protocole est illustré à la figure 1. Huit jours après l’inoculation tumorale, des cellules CD45.1+ et CD45.1+CD45.2+ OT-I ont été injectées dans des souris C57BL/6 porteuses de tumeurs B16F10-OVA. La tumeur a été disséquée chirurgicalement à partir de souris implantées par cellules CD45.1+ OT-I (donneuse) le jour 8 après le transfert et transplantée dans des souris CD45.1 + CD45.2+ OT-I implan...

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Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Ici, nous présentons un protocole de transplantation tumorale pour la caractérisation des lymphocytes infiltrés tumoraux inhérents à la tumeur et dérivés de la périphérie dans un modèle tumoral murin. Le traçage spécifique de l’afflux de cellules immunitaires dérivées du receveur avec cytométrie en flux révèle la dynamique des changements phénotypiques et fonctionnels de ces cellules au cours des réponses immunitaires antitumorales.

Transplantation tumorale pour évaluer la dynamique des lymphocytes T CD8+ infiltrant la tumeur chez la souris

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés de l’immunologie tumorale, notamment s’il existe une reconstitution des cellules immunitaires spécifiques à la tumeur à partir des tissus périphériques, les transitions entre les cellules immunitaires nouvellement infiltrées et déjà existantes dans le microenvironnement tumoral et leurs réponses à l’immunothérapie. Il s’agit d’une technique pratique et facile à suivre pour distinguer les cellules dérivées de la périphérie des cellules immunitaires infiltrées dans la tumeur et suivre les changements dynamiques, phénotypiques et fonctionnels de ces cellules dans des essais longitudinaux. Commencez par prélever 100 microlitres de la suspension cellulaire B16F10-OVA préparée dans une seringue tuberculine de 1 mL.Appuyez sur le baril pour déplacer les bulles vers le haut et poussez doucement le piston pour éliminer les bulles d’air. Retenez la souris pour exposer son abdomen. Appuyez sur la patte arrière gauche avec le petit doigt pour resserrer la peau de la région inguinale gauche.Retirez les poils de la souris de son bas-ventre gauche avec un rasoir électrique. Utilisez du coton imbibé d’éthanol à 75% pour nettoyer le quadrant postérieur de l’abdomen gauche. Tenez la seringue à un angle peu profond compris entre 0 et 15 degrés et, avec le biseau de l’aiguille tourné vers le haut, insérez-la sur le côté de la cuisse gauche.Avancez l’aiguille de 0,5 à 1 centimètre à travers le tissu sous-cutané dans la région inguinale. Tirez sur le piston avant de l’injecter. S’il y a une pression négative, appuyez entièrement sur le piston et observez la formation d’une petite poche de liquide, ou d’un bolus, dans la sous-cutis.Retirez l’aiguille après l’injection. Relâchez et replacez la souris dans la cage. Le sixième au huitième jour après l’implantation de B16F10-OVA, mesurez la taille de la tumeur avec une échelle de vernier.Sélectionnez les souris avec un diamètre d’environ trois millimètres ou une tumeur de la taille d’un haricot mungo, et divisez-les également et aléatoirement en deux groupes. Prélever 200 microlitres de suspension de cellules OT-1 dans une seringue à insuline de calibre 29 de 100 unités et enlever les bulles. Placez la souris séparément dans une cage, avec une lampe infrarouge sur la cage pendant 5 à 10 minutes pour dilater la veine caudale.Immobilisez la souris avec un dispositif de retenue de taille appropriée. Tenez la queue pour la redresser et vaporisez de l’éthanol à 75% pour rendre la veine visible. Tenez la seringue parallèlement à la veine et insérez-la dans la veine à un angle de 0 à 15 degrés.Retirez légèrement le piston et, si du sang pénètre dans le baril, injectez lentement et régulièrement la suspension à une vitesse maximale d’un millilitre par minute. Une fois l’injection terminée, retirez la seringue et appuyez doucement sur la zone d’injection pendant trois à cinq secondes pour arrêter le saignement. Remettez la souris dans la cage et observez-la de près pendant quelques minutes pour détecter les effets indésirables.S’il a une mobilité normale et un écoulement nasal, replacez-le en compagnie des autres souris. 8 à 10 jours après le transfert adoptif, sélectionnez des souris donneuses portant une masse tumorale comparable d’environ cinq millimètres de diamètre pour la chirurgie de transplantation. Placez un plat de 100 millimètres sur 20 millilitres dans une armoire de biosécurité et ajoutez 10 millilitres de PBS stérile et glacé.Après avoir euthanasié la souris, immergez-la dans de l’éthanol à 75 % pendant trois à cinq minutes. Placez la souris en décubitus dorsal sur une planche de dissection recouverte de papier absorbant propre dans l’armoire de biosécurité. Retenez les membres de la souris avec des aiguilles de dissection.Coupez la peau le long de la ligne médiane du haut de l’orifice urétral jusqu’au xiphoïde avec des ciseaux. Étirez la peau vers le côté gauche du corps de la souris avec une pince à épiler et retenez la peau avec des aiguilles de dissection. Excisez la tumeur, en gardant sa capsule aussi intacte que possible.Retirez soigneusement et doucement le tissu conjonctif près de la tumeur avec des ciseaux chirurgicaux, puis placez le tissu tumoral dans le plat contenant du PBS stérile et glacé pour une transplantation ultérieure. Utilisez une pommade vétérinaire sur les yeux pour les empêcher de sécher. Rasez le flanc gauche de la souris avec un rasoir électrique, puis appliquez une crème dépilatoire pour enlever les poils restants.Placez la souris à l’intérieur de l’armoire de biosécurité en position couchée sur une carte de dissection recouverte de papier absorbant propre, avec l’axe vertical de la souris parallèle et sa tête sur le côté droit de l’expérimentateur. Frottez la peau de la zone rasée avec du coton imbibé de povidone-iode. Soulevez la peau au milieu entre les articulations de la hanche de la souris avec une pince à épiler chirurgicale.Utilisez les ciseaux pour faire une excision verticale de cinq millimètres de long et étendez la coupe rostralement le long de la ligne médiane dorsale à environ 10 à 15 millimètres. Effectuez une dissection nette en insérant les pointes fermées des ciseaux dans l’incision, puis en ouvrant pour séparer le péritoine du flanc gauche de la peau et des tissus mous. Effectuez une dissection nette plusieurs fois pour générer une poche de peau sur le flanc gauche.Déposez la masse tumorale encapsulée, intacte et dérivée du donneur dans la poche. Fermez l’incision par une suture interrompue, en utilisant deux ou trois points de suture pour chaque incision. Désinfectez la peau autour de la coupe avec du coton imbibé de povidone-iode.Placez la souris en position latérale dans une cage propre et chaude. Surveillez-le continuellement jusqu’à ce qu’il ait retrouvé une conscience suffisante pour maintenir la position couchée sternale. Administrer la buprénorphine par voie sous-cutanée à une dose de 0,1 milligramme par kilogramme de poids corporel toutes les huit heures, pour un total de trois doses.Ne retournez le receveur de la greffe à la compagnie d’autres animaux qu’après qu’il se soit complètement rétabli. En utilisant la cytométrie en flux, deux populations de lymphocytes T spécifiques de l’antigène tumoral CD44 négatif et CD8 positif ont été facilement identifiées dans le microenvironnement tumoral, y compris les lymphocytes T CD45.1 positifs dérivés du donneur et CD45.1 négatifs et CD45.2 positifs infiltrant la tumeur. Au deuxième jour après la transplantation, il y avait environ 83% de lymphocytes T CD8 positifs spécifiques à l’antigène dérivé du donneur dans la tumeur transplantée, plus prédominants que leurs homologues dérivés du receveur.La proportion de cellules OT-1 dérivées du receveur était élevée au stade avancé de la tumorigenèse, dépassant les cellules OT-1 inhérentes à la tumeur dérivées du donneur. La chose la plus importante à retenir est d’effectuer une dissection douce lors de la transplantation de tumeur sous-cutanée pour éviter les blessures sur les tissus environnants, en particulier dans les ganglions lymphatiques granulaires.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

le<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Tumor Disc Modèle: Visualisation et quantification de l&#39;expression génique et de tumeurs invasives utilisant Mosaïques génétique

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imagerie des Lymphocytes T CD8 résident dans des tumeurs du poumon humain tranches à l’aide de la microscopie confocale

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Knockdown conditionnel de l’Expression génique dans les lignées de cellules cancéreuses pour étudier le recrutement des Monocytes/Macrophages pour le microenvironnement tumoral

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Multiplexés Immunofluorescence analyse et Quantification d’intratumorale PD-1+ + Tim-3 CD8+ T Cells

Immune cells are important components of the tumor microenvironment and influence tumor growth and evolution at all stages of carcinogenesis. Notably, it ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for la Variation génétique chez un Patient sporadiques de la polypose adénomateuse familiale en utilisant le Format de puce-in-a-tube

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Détection en temps réel de dans l’apoptose des cellules tumorales in Vitro induite par CD8+ T Cells pour étudier les fonctions immunitaires de suppresseurs de tumeur-infiltration de cellules myéloïdes

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

The Clinical Application of Tumor Treating Fields Therapy in Glioblastoma

L’Application clinique de la tumeur, traitement de thérapie de champs dans le glioblastome

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

En reprise cellule tumorale in Vitro pour l’évaluation prédictive de l’antigène chimérique fonction antitumorale des récepteurs des lymphocytes T

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Utilisation de cellules souches pluripotentes induites par l'homme pour la génération de lymphocytes T spécifiques à l'antigène tumoral

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Génération de tumeurs pancréatiques orthopiques et caractérisation ex vivo de la cytotoxicité des cellules T infiltrantes

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...