Name: tumor transplantation for assessing the dynamics of tumor-infiltrating cd8+ t cells in mice
Uploaded: 2021-06-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע לחוקרים צעירים מצטיינים (מס '31825011 ל- LY) ומהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '31900643 ל- QH, מס ' 31900656 עד ZW).

כל הניסויים בעכברים בוצעו בהתאם להנחיות הוועדות המוסדיות לטיפול בבעלי חיים ולשימוש בהם של האוניברסיטה הצבאית השלישית לרפואה. השתמש בעכברי C57BL/6 בני 6-8 שבועות ובעכברים מהונדסים OT-I תמימים במשקל 18-22 גרם. השתמש גם בזכר וגם בנקבה ללא אקראיות או "עיוורון".
1. הכנת בינוניים וריאגנטים<...

<ol>
	<li>Blank, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+'T+cell+exhaustion.">Defining 'T cell exhaustion.</a> Nature Reviews Immunology. 19 (11), 665-674 (2019).</li><li>Leko, V., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+and+targeting+human+tumor+antigens+for+T+cell-based+immunotherapy+of+solid+tumors.">Identifying and targeting human tumor antigens for T cell-based immunotherapy of solid tumors.</a> Cancer Cell. 38 (4), 454-472 (2020).</li><li>McLane, L. M., Abdel-Hakeem, M. S., Wherry, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+T+cell+exhaustion+during+chronic+viral+infection+and+cancer.">CD8 T cell exhaustion during chronic viral infection and cancer.</a> Annual Review of Immunology. 37, 457-495 (2019).</li><li>Davis, M. M., Brodin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebooting+human+immunology.">Rebooting human immunology.</a> Annual Review of Immunology. 36, 843-864 (2018).</li><li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+immune+checkpoint+therapy.">The future of immune checkpoint therapy.</a> Science. 348 (6230), 56-61 (2015).</li><li>Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Releasing+the+brakes+on+cancer+immunotherapy.">Releasing the brakes on cancer immunotherapy.</a> Cell. 373 (16), 1490-1492 (2015).</li><li>Verma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+blockade+in+subprimed+CD8+cells+induces+dysfunctional+PD-1(+)CD38(hi)+cells+and+anti-PD-1+resistance.">PD-1 blockade in subprimed CD8 cells induces dysfunctional PD-1(+)CD38(hi) cells and anti-PD-1 resistance.</a> Nature Immunology. 20, 1231-1243 (2019).</li><li>Hashimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+T+cell+exhaustion+in+chronic+infection+and+cancer:+opportunities+for+interventions.">CD8 T cell exhaustion in chronic infection and cancer: opportunities for interventions.</a> Annual Review of Medicine. 69, 301-318 (2018).</li><li>Dammeijer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PD-1/PD-L1-checkpoint+restrains+T+cell+immunity+in+tumor-draining+lymph+nodes.">The PD-1/PD-L1-checkpoint restrains T cell immunity in tumor-draining lymph nodes.</a> Cancer Cell. 38 (5), 685-700 (2020).</li><li>Buchwald, Z. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-draining+lymph+node+is+important+for+a+robust+abscopal+effect+stimulated+by+radiotherapy.">Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 8 (2), 000867 (2020).</li><li>Philip, M., Schietinger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+fate+choice:+T+cell+exhaustion+in+cancer+and+chronic+infections.">Heterogeneity and fate choice: T cell exhaustion in cancer and chronic infections.</a> Current Opinion in Immunology. 58, 98-103 (2019).</li><li>Miller, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsets+of+exhausted+CD8(+)+T+cells+differentially+mediate+tumor+control+and+respond+to+checkpoint+blockade.">Subsets of exhausted CD8(+) T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade.</a> Nature Immunology. 20, 326-336 (2019).</li><li>Wu, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+T+cell+expansion+predicts+tumour+infiltration+and+clinical+response.">Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response.</a> Nature. 579, 274-278 (2020).</li><li>Im, S. J., Konieczny, B. T., Hudson, W. H., Masopust, D., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1++stemlike+CD8+T+cells+are+resident+in+lymphoid+tissues+during+persistent+LCMV+infection.">PD-1+ stemlike CD8 T cells are resident in lymphoid tissues during persistent LCMV infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 117 (8), 4292-4299 (2020).</li><li>Beltra, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+relationships+of+four+exhausted+CD8(+)+T+cell+subsets+reveals+underlying+transcriptional+and+epigenetic+landscape+control+mechanisms.">Developmental relationships of four exhausted CD8(+) T cell subsets reveals underlying transcriptional and epigenetic landscape control mechanisms.</a> Immunity. 52 (5), 825-841 (2020).</li><li>Myers, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+subset+of+CD8(+)+T+cells+during+chronic+exhaustion+is+defined+by+SIRPalpha+expression.">A functional subset of CD8(+) T cells during chronic exhaustion is defined by SIRPalpha expression.</a> Nature Communications. 10 (1), 794 (2019).</li><li>Jansen, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intra-tumoral+niche+maintains+and+differentiates+stem-like+CD8+T+cells.">An intra-tumoral niche maintains and differentiates stem-like CD8 T cells.</a> Nature. 576, 465-470 (2019).</li><li>Jadhav, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+signature+of+PD-1++TCF1++CD8+T+cells+that+act+as+resource+cells+during+chronic+viral+infection+and+respond+to+PD-1+blockade.">Epigenetic signature of PD-1+ TCF1+ CD8 T cells that act as resource cells during chronic viral infection and respond to PD-1 blockade.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 116 (28), 14113-14118 (2019).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+CD8+T+cells+form+a+proliferative,+dynamically+regulated+compartment+within+human+melanoma.">Dysfunctional CD8 T cells form a proliferative, dynamically regulated compartment within human melanoma.</a> Cell. 176 (4), 775-789 (2018).</li><li>Kurtulus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Checkpoint+blockade+immunotherapy+induces+dynamic+changes+in+PD-1(-)CD8(+)+tumor-infiltrating+T+cells.">Checkpoint blockade immunotherapy induces dynamic changes in PD-1(-)CD8(+) tumor-infiltrating T cells.</a> Immunity. 50 (1), 181-194 (2019).</li><li>Fransen, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-draining+lymph+nodes+are+pivotal+in+PD-1/PD-L1+checkpoint+therapy.">Tumor-draining lymph nodes are pivotal in PD-1/PD-L1 checkpoint therapy.</a> JCI Insight. 3 (23), 124507 (2018).</li><li>E, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8(+)CXCR5(+)+T+cells+in+tumor-draining+lymph+nodes+are+highly+activated+and+predict+better+prognosis+in+colorectal+cancer.">CD8(+)CXCR5(+) T cells in tumor-draining lymph nodes are highly activated and predict better prognosis in colorectal cancer.</a> Human Immunology. 79 (6), 446-452 (2018).</li><li>Snell, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8(+)+T+cell+priming+in+established+chronic+viral+infection+preferentially+directs+differentiation+of+memory-like+cells+for+sustained+immunity.">CD8(+) T cell priming in established chronic viral infection preferentially directs differentiation of memory-like cells for sustained immunity.</a> Immunity. 49 (4), 678-694 (2018).</li><li>Siddiqui, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral+Tcf1(+)PD-1(+)CD8(+)+T+cells+with+stem-like+properties+promote+tumor+control+in+response+to+vaccination+and+checkpoint+blockade+immunotherapy.">Intratumoral Tcf1(+)PD-1(+)CD8(+) T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy.</a> Immunity. 50 (1), 195-211 (2019).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+TCF1+preserves+the+effector+function+of+exhausted+CD8+T+cells+during+chronic+viral+infection.">The transcription factor TCF1 preserves the effector function of exhausted CD8 T cells during chronic viral infection.</a> Frontiers in Immunology. 10, 169 (2019).</li><li>Krishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-like+CD8+T+cells+mediate+response+of+adoptive+cell+immunotherapy+against+human+cancer.">Stem-like CD8 T cells mediate response of adoptive cell immunotherapy against human cancer.</a> Science. 370 (6522), 1328-1334 (2020).</li><li>Yost, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+replacement+of+tumor-specific+T+cells+following+PD-1+blockade.">Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade.</a> Nature Medicine. 25, 1251-1259 (2019).</li><li>Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillere, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+in+oncoimmunology.">Mouse models in oncoimmunology.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl6+preserves+the+suppressive+function+of+regulatory+T+cells+during+tumorigenesis.">Bcl6 preserves the suppressive function of regulatory T cells during tumorigenesis.</a> Frontiers in Immunology. 11, 806 (2020).</li><li>Yu, D., Ye, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+portrait+of+CXCR5(+)+follicular+cytotoxic+CD8(+)+T+cells.">A portrait of CXCR5(+) follicular cytotoxic CD8(+) T cells.</a> Trends in Immunology. 39 (12), 965-979 (2018).</li><li>Bracci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophosphamide+enhances+the+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+immune+cells+through+the+induction+of+cytokine+expression,+B-cell+and+T-cell+homeostatic+proliferation,+and+specific+tumor+infiltration.">Cyclophosphamide enhances the antitumor efficacy of adoptively transferred immune cells through the induction of cytokine expression, B-cell and T-cell homeostatic proliferation, and specific tumor infiltration.</a> Clinical Cancer Research. 13 (2), 644-653 (2007).</li><li>Salem, M. L., El-Naggar, S. A., Mahmoud, H. A., Elgharabawy, R. M., Bader, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophosphamide+eradicates+murine+immunogenic+tumor+coding+for+a+non-self-antigen+and+induces+antitumor+immunity.">Cyclophosphamide eradicates murine immunogenic tumor coding for a non-self-antigen and induces antitumor immunity.</a> International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 32, 1-5 (2018).</li><li>Thorsson, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Immune+landscape+of+cancer.">The Immune landscape of cancer.</a> Immunity. 48 (4), 812-830 (2018).</li></ol>

חסינות המתווכת על ידי תאי T ממלאת תפקיד מכריע בתגובות חיסוניות נגד גידולים, כאשר CTLs ממלאים את התפקיד המוביל במיגור תאים סרטניים. עם זאת, המקורות של CTLs ספציפיים לאנטיגן הגידול בתוך TME לא הובהרו30. השימוש בפרוטוקול השתלת גידול זה סיפק רמז חשוב לכך שתאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן ת...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62442">Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+&#160;T Cells in Mice</a>. The Protocol&#160;was&#160;updated.
Step 6.10 of the Protocol was updated from:
Administer penicillin every 8-12 h after the surgery for 3 days. Monitor the mouse&#39;s eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered. 
NOTE: The administration of buprenorphine is suggested to prevent post-surgical pain [delete sentence]. The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
to:
Administer buprenorphine subcutaneously at a dose of 0.1 mg/kg body weight every 8 h three times after surgery to alleviate the pain. Monitor the mouse&#39;s eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered. 
NOTE: The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62442">Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+&#160;T Cells in Mice</a>. The Protocol&#160;was&#160;updated.

Erratum: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

לתגובה חיסונית בתיווך תאי T CD8+ יש תפקיד מרכזי בשליטה על צמיחת הגידול. במהלך הגידול, תאי T תמימים מסוג CD8+ מופעלים עם זיהוי אנטיגן באופן מוגבל I מסוג MHC ולאחר מכן מתמיינים לתאים אפקטיביים ומסתננים למסת הגידול 1,2. עם זאת, בתוך המיקרו-סביבה של הגידול (TME), חשיפה ממושכת לאנטיגן, כמו גם גורמים מדכאי חיסון, דוחפים תאי CD8+ T ספציפיים לגידולים חודרים למצב היפו-רספונסיבי המכונה "תשישות"3. תאי T מותשים (Tex) נבדלים מתאי T משפיעים או זיכרון הנוצרים בזיהום נגיפי חריף, הן מבחינה שעתוקית והן מבחינה אפיגנטית. תאי טקס אלה מאופיינים בעיקר בביטוי מתמשך ומוגבה של סדרה של קולטנים מעכבים, כמו גם באובדן היררכי של תפקודי אפקטור. יתר על כן, יכולת ההתפשטות הפגומה של תאי CD8+ T מותשים גורמת לירידה במספר תאי ה-T הספציפיים לגידול, כך שתאי ה-CD8+ T השיוריים בתוך ה-TME בקושי יכולים לספק חסינות מגנה מספקת מפני התקדמות הגידול3. לפיכך, תחזוקה או חיזוק של תאי T ספציפיים לאנטיגן תוך-סרטניים מסוג CD8+ חיוניים להדחקת הגידול.
יתר על כן, טיפול בחסימת מחסום חיסוני (ICB) הוא האמין להמריץ מחדש את טקס בגידולים על ידי הגדלת חדירת תאי T ומכאן, מספרי תאי T וחידוש תפקודי תאי T להגברת דיכוי הגידול. היישום הנרחב של טיפול ICB שינה את נוף הטיפול בסרטן, עם תת-קבוצה משמעותית של חולים שחוו תגובות עמידות 4,5,6. עם זאת, רוב החולים וסוגי הסרטן אינם מגיבים או רק באופן זמני ל- ICB. חדירה לא מספקת של תאי T ב-TME הונחה כאחד המנגנונים הבסיסיים האחראים להתנגדות ל-ICB 7,8.
מספר מחקרים הדגימו את ההטרוגניות של תאי T מסתננים לגידולים מסוג CD8+ (TILs) הן בחולים והן במודלים של עכברים 9,10,11,12. אושר כי תת-קבוצה של תאי T מסוג CD8+ המבטאים את פקטור תאי T 1 (TCF1) במסת הגידול מפגינים תכונות דמויות תאי גזע, מה שעלול להוליד עוד יותר תאי T מותשים סופניים ואחראי להתפרצות ההתפשטות לאחר טיפול ICB 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. עם זאת, הוכח כי רק חלק קטן מתאי TCF1+CD8+ T הספציפיים לאנטיגן קיימים ב-TME ומייצרים מאגר מורחב של צאצאים ממוינים בתגובה ל-ICB 23,24,25,26. האם הגודל המוגבל של אוכלוסייה זו מספיק כדי להבטיח את ההתמדה של לימפוציטים T ציטוטוקסיים (CTLs) כדי לשלוט בהתקדמות הגידול עדיין לא ידוע, והאם יש חידוש מרקמות פריפריה דורש חקירה נוספת. יתר על כן, מחקרים עדכניים מצביעים על יכולת ההתחדשות הבלתי מספקת של תאי T ספציפיים לגידול הקיימים מראש ועל הופעתם של קלונוטיפים חדשים, שבעבר לא היו קיימים, לאחר טיפול אנטי-מתוכנת בחלבון מוות תאי 1. זה מצביע על כך שתגובת תאי T לחסימת מחסום עשויה לנבוע מהזרם החדש של רפרטואר מובהק של שיבוטים של תאי T27. יחד עם הימצאותו של שבר תאי T ציטוטוקסיים שאינם תגובתיים לגידולים ב-TME, ממצאים אלה הניעו את הקמתו של מודל אלוגרפט גידולי כדי לחקור את תפקידם של תאי CD8+ T שמקורם בפריפריה11.
עד כה, מספר סוגים של השתלת גידול, כמו גם העברה מאמצת של תאים חיסוניים, היו בשימוש נרחב בתחום האימונולוגיה של הגידול28. TILs, תאים חד-גרעיניים בדם היקפי ותאי חיסון תגובתיים לגידול שמקורם ברקמות אחרות יכולים להיות מאופיינים היטב בשיטות אלה. עם זאת, כאשר חוקרים את יחסי הגומלין בין חסינות מערכתית לחסינות מקומית נגד סרטנים, נראה כי מודלים אלה אינם מספיקים כדי לבחון את האינטראקציות בין תאי מערכת החיסון שמקורם בפריפריה לבין ה-TME. כאן, רקמות הגידול הושתלו מתורמים לעכברים מושתלים המותאמים לגידול כדי להתחקות במדויק אחר זרם תאי החיסון שמקורם במקבלי ההשתנה ולבחון את התאים שמקורם בתורמים ב-TME במקביל.
במחקר זה, מודל סיgeneic של מורין של מלנומה נקבע עם קו תאי מלנומה B16F10-OVA, אשר מבטא ביציבות את הפונדקאית neoantigen ovalbumin. עכברי TCR מהונדסים OT-I, שבהם יותר מ-90% מתאי ה-T של CD8+ מזהים באופן ספציפי את הפפטיד OVA OVA257-264 שמקורו ב-OVA (SIINFEKL) הקשור למולקולת ה-MHC H2-Kb מסוג I, מאפשרים לחקור את תגובות תאי ה-T הספציפיים לאנטיגן שפותחו במודל הגידול B16F10-OVA. בשילוב מודל זה עם השתלת גידולים, הושוו התגובה החיסונית של תאי CD8+ T הטבועים בגידול ובפריפריה כדי לחשוף מעבר דינמי בין שתי אוכלוסיות אלה. באופן קולקטיבי, תכנון ניסיוני זה סיפק גישה נוספת כדי לחקור במדויק את התגובות החיסוניות של תאי CD8+ T ב-TME, מה ששופך אור חדש על הדינמיקה של תגובות חיסוניות של תאי T ספציפיים לגידול ב-TME.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL tuberculin syringe</td>
			<td>KDL</td>
			<td>BB000925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tube</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG2211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 U insulin syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>320310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>BEAVER</td>
			<td>43008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T48402-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methyl-2-butanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>240486-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m nylon cell strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD45.1</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>110714</td>
			<td>Clone:A20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16F10-OVA cell line</td>
			<td>bluefbio</td>
			<td>BFN607200447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-V (bovine serum albumin)</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>bs-0292P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 Mouse Anti-Mouse CD45.2</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>562895</td>
			<td>Clone:104</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture dish</td>
			<td>BEAVER</td>
			<td>43701/43702/43703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R-A462/5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyclophosphamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0768-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>19853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>EDS-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACSCanto II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>PorLab Scientific</td>
			<td>HM330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>RWD life science</td>
			<td>R510-22-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KHCO3</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501195-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L10199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle carrier</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>F31034-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501569-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0099-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse TCR V&#945;2</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>127808</td>
			<td>Clone:B20.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep Glutamine (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100734</td>
			<td>Clone:53-6.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical forceps</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>F12005-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical scissors</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>S12003-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suture thread</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>F34004-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tumor transplantation for assessing the dynamics of tumor-infiltrating cd8+ t cells in mice

חסינות המתווכת על ידי תאי T ממלאת תפקיד מכריע בתגובות חיסוניות נגד גידולים, כאשר לימפוציטים ציטוטוקסיים מסוג T (CTLs) ממלאים את התפקיד המוביל במיגור תאים סרטניים. עם זאת, המקורות והחידוש של תאי CD8+ T ספציפיים לאנטיגן הגידול בתוך המיקרו-סביבה של הגידול (TME) נותרים מעורפלים. פרוטוקול זה משתמש בקו תאי המלנומה B16F10-OVA, המבטא ביציבות את הניאו-אנטיגן הפונדקאי, אובלבומין (OVA) ועכברי TCR מהונדסים OT-I, שבהם יותר מ-90% מתאי ה-T של CD8+ מזהים באופן ספציפי את הפפטיד הנגזר מ-OVA OVA257-264 (SIINFEKL) הקשור למולקולה הגדולה מסוג I של קומפלקס היסטו-קומפטביליות (MHC) H2-Kb. תכונות אלה מאפשרות לחקור תגובות של תאי T ספציפיים לאנטיגן במהלך הגידול.
בשילוב מודל זה עם ניתוח השתלת גידולים, רקמות גידול מתורמים הושתלו בעכברים מושתלים סינגניים המותאמים לגידול כדי להתחקות במדויק אחר זרם תאי החיסון שמקורם במקבל לרקמות תורם מושתלות, מה שמאפשר ניתוח של התגובות החיסוניות של CD8+ הטבוע בגידול ומקורו בפריפריה תאי T. נמצא כי בין שתי האוכלוסיות הללו מתרחש מעבר דינמי. באופן קולקטיבי, תכנון ניסיוני זה סיפק גישה נוספת כדי לחקור במדויק את התגובה החיסונית של תאי CD8+ T ב- TME, אשר ישפוך אור חדש על אימונולוגיה של גידולים.

הסכימה של פרוטוקול זה מוצגת באיור 1. שמונה ימים לאחר חיסון הגידול, CD45.1+ ותאי CD45.1+CD45.2+ OT-I הוזרקו לעכברי C57BL/6 נושאי גידול B16F10-OVA. הגידול נותח בניתוח מ-CD45.1+ עכברים מושתלים בתאי OT-I (תורם) ביום ה-8 שלאחר ההעברה והושתל בעכברים מושתלים (מושתלים) של תאי CD45.1+C...

Watch this Scientific Journal Video about Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice at JoVE.com

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

כאן אנו מציגים פרוטוקול השתלת גידול לאפיון לימפוציטים חודרים לגידולים שמקורם בגידול ובפריפריה במודל גידול בעכבר. מעקב ספציפי אחר זרם תאי מערכת החיסון שמקורם במקבל עם ציטומטריה של זרימה חושף את הדינמיקה של השינויים הפנוטיפיים והתפקודיים של תאים אלה במהלך תגובות חיסוניות אנטי-סרטניות.

השתלת גידול להערכת הדינמיקה של תאי T המסתננים לגידולים CD8+ בעכברים

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות המפתח באימונולוגיה של הגידול, כולל האם יש חידוש של תאי חיסון ספציפיים לגידול מרקמות היקפיות, המעברים בין תאים חיסוניים חדשים שחודרו וכבר קיימים בתוך מיקרו-סביבה של הגידול, ותגובותיהם לאימונותרפיה. זוהי טכניקה נוחה וקלה למעקב כדי להבחין בין התאים שמקורם בפריפריה לבין תאי מערכת החיסון החודרים לגידול ולעקוב אחר השינויים הדינמיים, הפנוטיפיים והתפקודיים של תאים אלה במבחני אורך. התחל על ידי משיכת 100 מיקרוליטרים של תרחיף תא B16F10-OVA מוכן למזרק שחפת 1 מ"ל.הקש על הקנה כדי להזיז את כל הבועות למעלה ודחף בעדינות את הבוכנה כדי להסיר בועות אוויר. לרסן את העכבר כדי לחשוף את בטנו. לחץ על הרגל האחורית השמאלית עם האצבע הקטנה כדי להדק את העור של האזור המפשעה השמאלי.הסר את שיער העכבר מבטנו התחתונה השמאלית באמצעות מכונת גילוח חשמלית. השתמשו בכותנה ספוגה ב-75% אתנול כדי לנקות את הרביע האחורי של הבטן השמאלית. החזיקו את המזרק בזווית רדודה בין 0 ל -15 מעלות, ועם שיפוע המחט הפונה כלפי מעלה, הכנס אותו בצד הירך העליונה השמאלית.מקדמים את המחט 0.5 עד 1 ס"מ דרך הרקמה התת עורית לאזור המפשעתי. משכו לאחור את הבוכנה לפני ההזרקה. אם יש לחץ שלילי, לדכא את הבוכנה לחלוטין ולצפות היווצרות של כיס נוזל קטן, או בולוס, ב subcutis.הסר את המחט לאחר ביצוע ההזרקה. שחררו והחזירו את העכבר לכלוב. ביום השישי עד השמיני לאחר השתלת B16F10-OVA, מדוד את גודל הגידול בסולם ורנייה.בחר את העכברים בקוטר של כשלושה מילימטרים או גידול בגודל שעועית מש, וחלק אותם באופן שווה ואקראי לשתי קבוצות. משכו 200 מיקרוליטרים של תרחיף תאי OT-1 למזרק אינסולין בעל 100 יחידות של 29 יחידות והסרו בועות. מניחים את העכבר בנפרד בכלוב, עם מנורת אינפרא אדום מעל הכלוב למשך 5 עד 10 דקות כדי להרחיב את וריד הזנב.לשתק את העכבר עם מכשיר מרסן בגודל מתאים. החזיקו את הזנב כדי ליישר אותו ומרססים 75% אתנול כדי להפוך את הווריד לגלוי. החזיקו את המזרק במקביל לווריד והכניסו אותו לווריד בזווית של 0 עד 15 מעלות.משכו מעט את הבוכנה לאחור, ואם הדם נכנס לחבית, לאט ובהתמדה להזריק את ההשעיה בקצב של לא יותר ממילילטר אחד לדקה. לאחר השלמת ההזרקה, הסר את המזרק ולחץ על אזור ההזרקה בעדינות למשך שלוש עד חמש שניות כדי לעצור את הדימום. מחזירים את העכבר לכלוב ומתבוננים בו מקרוב במשך כמה דקות לתגובות שליליות.אם יש לו ניידות תקינה והפרשות מהאף, הניחו אותו בחזרה בחברת העכברים האחרים. 8 עד 10 ימים לאחר ההעברה המאמצת, בחרו עכברים תורמים הנושאים מסת גידול דומה בקוטר של כחמישה מילימטרים לניתוח השתלה. הניחו צלחת בגודל 100 מילימטר על 20 מיליליטר בארון בטיחות ביולוגית והוסיפו 10 מיליליטר של PBS סטרילי וקר כקרח.לאחר המתת החסד את העכבר, לטבול אותו ב 75% אתנול במשך שלוש עד חמש דקות. הניחו את העכבר במצב שכיבה על לוח דיסקציה המכוסה בנייר סופג נקי בארון הבטיחות הביולוגית. לרסן את איברי העכבר עם מחטי דיסקציה.חותכים את העור לאורך קו האמצע מלמעלה לפתח השופכה ועד לקסיפואיד עם מספריים. למתוח את העור לכיוון הצד השמאלי של גוף העכבר עם פינצטה ולרסן את העור עם מחטי דיסקציה. לבלות את הגידול, תוך שמירה על הקפסולה שלו שלמה ככל האפשר.בזהירות ובעדינות להסיר את רקמת החיבור ליד הגידול עם מספריים כירורגיים, ולאחר מכן למקם את רקמת הגידול בצלחת המכילה PBS סטרילי, קר כקרח להשתלה הבאה. השתמשו במשחה וטרינרית על העיניים כדי למנוע מהן להתייבש. לגלח את האגף השמאלי של העכבר עם מכונת גילוח חשמלית, ולאחר מכן למרוח קרם depilatory כדי להסיר את השיער הנותר.מניחים את העכבר בתוך ארון הבטיחות הביולוגית במצב נוטה על לוח דיסקציה המכוסה בנייר סופג נקי, כאשר הציר האנכי של העכבר מקביל לראשו הימני של הנסיין וראשו בצד ימין של הנסיין. לשפשף את העור של האזור המגולח עם כותנה ספוגה פובידון-יוד. הרימו את העור בנקודת האמצע שבין מפרקי הירך של העכבר עם פינצטה כירורגית.השתמש במספריים כדי ליצור כריתה אנכית באורך חמישה מילימטרים ולהרחיב את החתך באופן רוסטרלי לאורך קו האמצע הגבי לכ-10 עד 15 מילימטרים. בצע ניתוח חד על ידי החדרת הקצות הסגורים של המספריים לתוך החתך ולאחר מכן פתיחה כדי להפריד את הצפק של האגף השמאלי מהעור והרקמה הרכה. בצע דיסקציה חדה מספר פעמים כדי ליצור כיס עור באגף השמאלי.הפקידו את מסת הגידול הדחוסה, השלמה, שמקורה בתורמים, בכיס. סגור את החתך על ידי תפר מופרע, באמצעות שניים או שלושה תפרים עבור כל חתך. יש לחטא את העור סביב החתך בכותנה ספוגה בפובידון-יוד.מניחים את העכבר במצב לרוחב בכלוב נקי וחם. עקוב אחריו ברציפות עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על התאוששות הסטרנלית. מתן buprenorphine תת עורית במינון של 0.1 מיליגרם לכל קילוגרם של משקל הגוף כל שמונה שעות, בסך הכל שלוש מנות.החזירו את המושתל לחברתם של בעלי חיים אחרים רק לאחר שהחלים לחלוטין. באמצעות ציטומטריה של זרימה, שתי אוכלוסיות של תאי T ספציפיים לאנטיגן של CD44-negative ו-CD8-חיוביים ל-CD8 זוהו בקלות במיקרו-סביבה של הגידול, כולל CD45.1-חיובי-תורמים שמקורם בתורמים ו-CD45.1-שליליים ו-CD45.2-חיוביים שמקורם בגידול-מסתננים לתאי T חיוביים ל-CD8. ביום השני לאחר ההשתלה, היו כ-83% מתאי T חיוביים ל-CD8 ספציפיים לאנטיגן שמקורם בתורמים בתוך הגידול המושתל, יותר דומיננטיים ממקביליהם שמקורם במקבל.שיעור תאי ה-OT-1 שמקורם במקבל היה גבוה בשלב המאוחר של הגידול, ועבר את תאי ה-OT-1 הטבועים בגידול שמקורם בתורם. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור הוא כי כדי לבצע דיסקציה עדינה במהלך השתלת גידול תת עורית כדי למנוע פציעות על הרקמות הסובבות, במיוחד בצומת הלימפה הגרעינית.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

ה<em&gt; תסיסנית</em&gt; דגם גידול דיסק דמותי: ויזואליזציה וכימות של ביטוי גנים סרטניים הפולשנות שימוש פסיפסים גנטי

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

לשעבר Vivo הדמיה של לימפוציטים מסוג T CD8 תושב באמבריולוגיה הגידול פרוסות משתמש מיקרוסקופיה קונפוקלית

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

נוקאאוט מותנה של ביטוי גנים בשורות תאים סרטן ללמוד הגיוס של Monocytes/מקרופאגים כדי Microenvironment הגידול

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

מרובב ניתוח Immunofluorescence, כימות של CD8 טים-3+ PD-1+ Intratumoral+ T תאים

Immune cells are important components of the tumor microenvironment and influence tumor growth and evolution at all stages of carcinogenesis. Notably, it ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

פולימראז דיגיטלי Assay תגובת שרשרת עבור הווריאציה גנטי לחולה סדיר פוליפוזיס באמצעות התבנית שבב-ב--שפופרת

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

זיהוי בזמן אמת של הגידול Vitro תאים אפופטוזיס שנגזרות CD8+ T תאים ללמוד פונקציות החיסונית מדכא גידולים הסתננות התאים מיאלואידית

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

The Clinical Application of Tumor Treating Fields Therapy in Glioblastoma

היישום הקליני של הגידול לטיפול שדות טיפול ב גליובלסטומה

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

ב- Rechallenge תא הגידול חוץ גופית להערכה חזוי של Chimeric אנטיגן קולטן תא T פונקציה Antitumor

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

שימוש בתאי גזע של האדם המושרה Pluriפוטנטי עבור הדור של אנטיגן גידולים-תאים T ספציפיים

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

הדור של הלבלב אורתוטואט גידולים ואפיון Vivo Ex של תאים הסתננות של הגידול תא T

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...