Name: tumor transplantation for assessing the dynamics of tumor-infiltrating cd8+ t cells in mice
Uploaded: 2021-06-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice at JoVE.com

この研究は、国家自然科学基金(LYに31825011番)と中国国家自然科学財団(31900643番からQHへ、31900656番からZWへ)からの助成金によって支援されました。

すべてのマウス実験は、第三軍事医科大学の施設動物ケアおよび使用委員会のガイドラインに準拠して実施された。体重18~22gの6~8週齢のC57BL/6マウスおよび素朴なOT-Iトランスジェニックマウスを使用する。無作為化や「盲検化」を行わずに男性と女性の両方を使用してください。
培地および試薬の調製
<ol><li>ダルベッコの改変イーグル培地に10%ウシ胎児血清(FBS)、100U/mL?...

<ol>
	<li>Blank, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+'T+cell+exhaustion.">Defining 'T cell exhaustion.</a> Nature Reviews Immunology. 19 (11), 665-674 (2019).</li><li>Leko, V., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+and+targeting+human+tumor+antigens+for+T+cell-based+immunotherapy+of+solid+tumors.">Identifying and targeting human tumor antigens for T cell-based immunotherapy of solid tumors.</a> Cancer Cell. 38 (4), 454-472 (2020).</li><li>McLane, L. M., Abdel-Hakeem, M. S., Wherry, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+T+cell+exhaustion+during+chronic+viral+infection+and+cancer.">CD8 T cell exhaustion during chronic viral infection and cancer.</a> Annual Review of Immunology. 37, 457-495 (2019).</li><li>Davis, M. M., Brodin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebooting+human+immunology.">Rebooting human immunology.</a> Annual Review of Immunology. 36, 843-864 (2018).</li><li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+immune+checkpoint+therapy.">The future of immune checkpoint therapy.</a> Science. 348 (6230), 56-61 (2015).</li><li>Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Releasing+the+brakes+on+cancer+immunotherapy.">Releasing the brakes on cancer immunotherapy.</a> Cell. 373 (16), 1490-1492 (2015).</li><li>Verma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+blockade+in+subprimed+CD8+cells+induces+dysfunctional+PD-1(+)CD38(hi)+cells+and+anti-PD-1+resistance.">PD-1 blockade in subprimed CD8 cells induces dysfunctional PD-1(+)CD38(hi) cells and anti-PD-1 resistance.</a> Nature Immunology. 20, 1231-1243 (2019).</li><li>Hashimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+T+cell+exhaustion+in+chronic+infection+and+cancer:+opportunities+for+interventions.">CD8 T cell exhaustion in chronic infection and cancer: opportunities for interventions.</a> Annual Review of Medicine. 69, 301-318 (2018).</li><li>Dammeijer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PD-1/PD-L1-checkpoint+restrains+T+cell+immunity+in+tumor-draining+lymph+nodes.">The PD-1/PD-L1-checkpoint restrains T cell immunity in tumor-draining lymph nodes.</a> Cancer Cell. 38 (5), 685-700 (2020).</li><li>Buchwald, Z. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-draining+lymph+node+is+important+for+a+robust+abscopal+effect+stimulated+by+radiotherapy.">Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 8 (2), 000867 (2020).</li><li>Philip, M., Schietinger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+fate+choice:+T+cell+exhaustion+in+cancer+and+chronic+infections.">Heterogeneity and fate choice: T cell exhaustion in cancer and chronic infections.</a> Current Opinion in Immunology. 58, 98-103 (2019).</li><li>Miller, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsets+of+exhausted+CD8(+)+T+cells+differentially+mediate+tumor+control+and+respond+to+checkpoint+blockade.">Subsets of exhausted CD8(+) T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade.</a> Nature Immunology. 20, 326-336 (2019).</li><li>Wu, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+T+cell+expansion+predicts+tumour+infiltration+and+clinical+response.">Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response.</a> Nature. 579, 274-278 (2020).</li><li>Im, S. J., Konieczny, B. T., Hudson, W. H., Masopust, D., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1++stemlike+CD8+T+cells+are+resident+in+lymphoid+tissues+during+persistent+LCMV+infection.">PD-1+ stemlike CD8 T cells are resident in lymphoid tissues during persistent LCMV infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 117 (8), 4292-4299 (2020).</li><li>Beltra, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+relationships+of+four+exhausted+CD8(+)+T+cell+subsets+reveals+underlying+transcriptional+and+epigenetic+landscape+control+mechanisms.">Developmental relationships of four exhausted CD8(+) T cell subsets reveals underlying transcriptional and epigenetic landscape control mechanisms.</a> Immunity. 52 (5), 825-841 (2020).</li><li>Myers, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+subset+of+CD8(+)+T+cells+during+chronic+exhaustion+is+defined+by+SIRPalpha+expression.">A functional subset of CD8(+) T cells during chronic exhaustion is defined by SIRPalpha expression.</a> Nature Communications. 10 (1), 794 (2019).</li><li>Jansen, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intra-tumoral+niche+maintains+and+differentiates+stem-like+CD8+T+cells.">An intra-tumoral niche maintains and differentiates stem-like CD8 T cells.</a> Nature. 576, 465-470 (2019).</li><li>Jadhav, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+signature+of+PD-1++TCF1++CD8+T+cells+that+act+as+resource+cells+during+chronic+viral+infection+and+respond+to+PD-1+blockade.">Epigenetic signature of PD-1+ TCF1+ CD8 T cells that act as resource cells during chronic viral infection and respond to PD-1 blockade.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 116 (28), 14113-14118 (2019).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+CD8+T+cells+form+a+proliferative,+dynamically+regulated+compartment+within+human+melanoma.">Dysfunctional CD8 T cells form a proliferative, dynamically regulated compartment within human melanoma.</a> Cell. 176 (4), 775-789 (2018).</li><li>Kurtulus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Checkpoint+blockade+immunotherapy+induces+dynamic+changes+in+PD-1(-)CD8(+)+tumor-infiltrating+T+cells.">Checkpoint blockade immunotherapy induces dynamic changes in PD-1(-)CD8(+) tumor-infiltrating T cells.</a> Immunity. 50 (1), 181-194 (2019).</li><li>Fransen, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-draining+lymph+nodes+are+pivotal+in+PD-1/PD-L1+checkpoint+therapy.">Tumor-draining lymph nodes are pivotal in PD-1/PD-L1 checkpoint therapy.</a> JCI Insight. 3 (23), 124507 (2018).</li><li>E, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8(+)CXCR5(+)+T+cells+in+tumor-draining+lymph+nodes+are+highly+activated+and+predict+better+prognosis+in+colorectal+cancer.">CD8(+)CXCR5(+) T cells in tumor-draining lymph nodes are highly activated and predict better prognosis in colorectal cancer.</a> Human Immunology. 79 (6), 446-452 (2018).</li><li>Snell, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8(+)+T+cell+priming+in+established+chronic+viral+infection+preferentially+directs+differentiation+of+memory-like+cells+for+sustained+immunity.">CD8(+) T cell priming in established chronic viral infection preferentially directs differentiation of memory-like cells for sustained immunity.</a> Immunity. 49 (4), 678-694 (2018).</li><li>Siddiqui, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral+Tcf1(+)PD-1(+)CD8(+)+T+cells+with+stem-like+properties+promote+tumor+control+in+response+to+vaccination+and+checkpoint+blockade+immunotherapy.">Intratumoral Tcf1(+)PD-1(+)CD8(+) T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy.</a> Immunity. 50 (1), 195-211 (2019).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+TCF1+preserves+the+effector+function+of+exhausted+CD8+T+cells+during+chronic+viral+infection.">The transcription factor TCF1 preserves the effector function of exhausted CD8 T cells during chronic viral infection.</a> Frontiers in Immunology. 10, 169 (2019).</li><li>Krishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-like+CD8+T+cells+mediate+response+of+adoptive+cell+immunotherapy+against+human+cancer.">Stem-like CD8 T cells mediate response of adoptive cell immunotherapy against human cancer.</a> Science. 370 (6522), 1328-1334 (2020).</li><li>Yost, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+replacement+of+tumor-specific+T+cells+following+PD-1+blockade.">Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade.</a> Nature Medicine. 25, 1251-1259 (2019).</li><li>Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillere, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+in+oncoimmunology.">Mouse models in oncoimmunology.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl6+preserves+the+suppressive+function+of+regulatory+T+cells+during+tumorigenesis.">Bcl6 preserves the suppressive function of regulatory T cells during tumorigenesis.</a> Frontiers in Immunology. 11, 806 (2020).</li><li>Yu, D., Ye, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+portrait+of+CXCR5(+)+follicular+cytotoxic+CD8(+)+T+cells.">A portrait of CXCR5(+) follicular cytotoxic CD8(+) T cells.</a> Trends in Immunology. 39 (12), 965-979 (2018).</li><li>Bracci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophosphamide+enhances+the+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+immune+cells+through+the+induction+of+cytokine+expression,+B-cell+and+T-cell+homeostatic+proliferation,+and+specific+tumor+infiltration.">Cyclophosphamide enhances the antitumor efficacy of adoptively transferred immune cells through the induction of cytokine expression, B-cell and T-cell homeostatic proliferation, and specific tumor infiltration.</a> Clinical Cancer Research. 13 (2), 644-653 (2007).</li><li>Salem, M. L., El-Naggar, S. A., Mahmoud, H. A., Elgharabawy, R. M., Bader, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophosphamide+eradicates+murine+immunogenic+tumor+coding+for+a+non-self-antigen+and+induces+antitumor+immunity.">Cyclophosphamide eradicates murine immunogenic tumor coding for a non-self-antigen and induces antitumor immunity.</a> International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 32, 1-5 (2018).</li><li>Thorsson, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Immune+landscape+of+cancer.">The Immune landscape of cancer.</a> Immunity. 48 (4), 812-830 (2018).</li></ol>

T細胞媒介性免疫は腫瘍に対する免疫応答において重要な役割を果たしており、CTLはがん細胞の根絶において主導的な役割を果たしている。しかしながら、TME内の腫瘍抗原特異的CTLの起源は解明されていない30。この腫瘍移植プロトコールの使用は、幹細胞様TCF1+前駆CD8+ T細胞が存在するにもかかわらず、腫瘍内抗原特異的CD8+ T細胞が長期間持続しない可能性?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62442">Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+&#160;T Cells in Mice</a>. The Protocol&#160;was&#160;updated.
Step 6.10 of the Protocol was updated from:
Administer penicillin every 8-12 h after the surgery for 3 days. Monitor the mouse&#39;s eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered. 
NOTE: The administration of buprenorphine is suggested to prevent post-surgical pain [delete sentence]. The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
to:
Administer buprenorphine subcutaneously at a dose of 0.1 mg/kg body weight every 8 h three times after surgery to alleviate the pain. Monitor the mouse&#39;s eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered. 
NOTE: The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62442">Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+&#160;T Cells in Mice</a>. The Protocol&#160;was&#160;updated.

Erratum: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

CD8+ T細胞媒介性免疫応答は、腫瘍増殖の制御において極めて重要な役割を果たしている。腫瘍形成の間、ナイーブCD8+ T細胞はMHCクラスI制限様式で抗原認識時に活性化され、続いてエフェクター細胞に分化し、腫瘍塊に浸潤する1,2。しかし、腫瘍微小環境(TME)内では、長期にわたる抗原曝露および免疫抑制因子が、浸潤した腫瘍特異的CD8+ T細胞を「枯渇」3として知られる低応答状態に追いやる。疲弊したT細胞(Tex)は、急性ウイルス感染で生成されたエフェクターまたはメモリーT細胞とは、転写的およびエピジェネティックに区別される。これらのTex細胞は、主に、一連の阻害性受容体の持続性および上昇した発現、ならびにエフェクター機能の階層的喪失によって特徴付けられる。さらに、疲弊したCD8+ T細胞の増殖能の障害は、腫瘍特異的T細胞の数を減少させ、その結果、TME内の残留CD8+ T細胞は、腫瘍進行に対して十分な保護免疫をかろうじて提供することができる3。したがって、腫瘍内抗原特異的CD8+ T細胞の維持または強化は、腫瘍抑制に不可欠である。
さらに、免疫チェックポイント遮断(ICB)療法は、T細胞浸潤を増加させることによって腫瘍中のTexを再活性化し、したがって、T細胞数および若返りT細胞機能を若返らせて腫瘍抑制を促進すると考えられている。ICB治療の広範な適用は、がん治療のランドスケープを変え、患者のかなりのサブセットが持続的な応答を経験している4,5,6。それにもかかわらず、大多数の患者およびがんタイプはICBに反応しないか、または一時的にしか反応しない。TMEにおける不十分なT細胞浸潤は、ICB耐性を説明する根底にあるメカニズムの1つであると仮定されている7、8。
いくつかの研究は、患者およびマウスモデルの両方において、腫瘍浸潤性CD8+ T細胞(TIL)の不均一性を実証している9、10、11、12。腫瘍塊中でT細胞因子-1(TCF1)を発現するCD8+ T細胞のサブセットが幹細胞様特性を示すことが確認されており、これはさらに終末的に疲弊したT細胞を生じさせ、ICB療法後の増殖バーストの原因であることが確認されている12、13、14、15、16、17、18、19、20、21,22。しかし、抗原特異的TCF1+CD8+ T細胞のごく一部しかTMEに存在せず、ICB23、24、25、26に応答して分化した子孫の拡張プールを生成することが証明されている。この集団の限られたサイズが、腫瘍の進行を制御するために細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の持続性を保証するのに十分であるかどうかは不明のままであり、末梢組織からの補充があるかどうかはさらなる調査を必要とする。さらに、最近の研究は、既存の腫瘍特異的T細胞の再活性化能力が不十分であり、抗プログラム細胞死タンパク質1治療後の新規で以前は存在しなかったクロノタイプの出現を示唆している。これは、チェックポイント遮断に対するT細胞応答が、T細胞クローン27の別個のレパートリーの新たな流入によるものかもしれないことを示す。TMEにおける傍観者の非腫瘍反応性細胞傷害性T細胞画分の存在とともに、これらの知見は、末梢由来CD8+ T細胞の役割を研究するための腫瘍同種移植片モデルの確立を促した11。
これまで、数種類の腫瘍移植、ならびに免疫細胞養子移入が、腫瘍免疫学28の分野において広く用いられてきた。他の組織に由来するTIL、末梢血単核球、および腫瘍反応性免疫細胞は、これらの方法を用いて十分に特徴付けることができる。しかし、全身抗腫瘍免疫と局所抗腫瘍免疫との相互作用を研究する場合、これらのモデルは、末梢に由来する免疫細胞とTMEとの間の相互作用を調べるには不十分であると思われる。ここでは、ドナーから腫瘍マッチレシピエントマウスに腫瘍組織を移植し、レシピエント由来免疫細胞の流入を正確にトレースし、TME中のドナー由来細胞を同時に観察した。
この研究では、代理ネオ抗原オボアルブミンを安定に発現するB16F10-OVAメラノーマ細胞株を用いて、メラノーマのマウス同系モデルを確立した。TCRトランスジェニックOT-Iマウスは、CD8+ T細胞の90%以上がクラスI MHC分子H2-Kbに結合したOVA由来ペプチドOVA257-264(SIINFEKL)を特異的に認識し、B16F10-OVA腫瘍モデルで開発された抗原特異的T細胞応答の研究を可能にする。このモデルを腫瘍移植と組み合わせると、腫瘍固有の抗原特異的CD8+ T細胞と末梢起源の抗原特異的CD8+ T細胞の免疫応答を比較し、これら2つの集団間の動的移行を明らかにした。全体として、この実験計画は、TME中のCD8+ T細胞の免疫応答を正確に調査するための別のアプローチを提供し、TMEにおける腫瘍特異的T細胞免疫応答のダイナミクスに新しい光を当てる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL tuberculin syringe</td>
			<td>KDL</td>
			<td>BB000925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tube</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG2211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 U insulin syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>320310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>BEAVER</td>
			<td>43008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T48402-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methyl-2-butanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>240486-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m nylon cell strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD45.1</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>110714</td>
			<td>Clone:A20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16F10-OVA cell line</td>
			<td>bluefbio</td>
			<td>BFN607200447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-V (bovine serum albumin)</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>bs-0292P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 Mouse Anti-Mouse CD45.2</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>562895</td>
			<td>Clone:104</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture dish</td>
			<td>BEAVER</td>
			<td>43701/43702/43703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R-A462/5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyclophosphamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0768-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>19853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>EDS-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACSCanto II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>PorLab Scientific</td>
			<td>HM330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>RWD life science</td>
			<td>R510-22-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KHCO3</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501195-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L10199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle carrier</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>F31034-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501569-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0099-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse TCR V&#945;2</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>127808</td>
			<td>Clone:B20.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep Glutamine (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100734</td>
			<td>Clone:53-6.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical forceps</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>F12005-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical scissors</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>S12003-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suture thread</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>F34004-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tumor transplantation for assessing the dynamics of tumor-infiltrating cd8+ t cells in mice

T細胞媒介性免疫は腫瘍に対する免疫応答において重要な役割を果たしており、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)は癌細胞の根絶において主導的な役割を果たしている。しかしながら、腫瘍微小環境(TME)内の腫瘍抗原特異的CD8+ T細胞の起源および補充は不明瞭なままである。このプロトコールは、代理ネオ抗原、オボアルブミン(OVA)、およびTCRトランスジェニックOT-Iマウスを安定に発現するB16F10-OVAメラノーマ細胞株を採用し、CD8+ T細胞の90%以上がクラスI主要組織適合性複合体(MHC)分子H2-Kbに結合したOVA由来ペプチドOVA257-264(SIINFEKL)を特異的に認識する。これらの特徴は、腫瘍形成中の抗原特異的T細胞応答の研究を可能にする。
このモデルを腫瘍移植手術と組み合わせることで、ドナー由来の腫瘍組織を腫瘍マッチした同系レシピエントマウスに移植し、移植ドナー組織へのレシピエント由来免疫細胞の流入を正確に追跡し、腫瘍固有の抗原特異的CD8+および末梢起源抗原特異的CD8+ の免疫応答の解析を可能にした。 T セル。これら2つの集団間で動的な遷移が起こることが判明した。全体として、この実験計画は、TME中のCD8+ T細胞の免疫応答を正確に調査するための別のアプローチを提供し、腫瘍免疫学に新たな光を当てるであろう。

このプロトコルの概略を図1に示します。腫瘍接種から8日後、CD45.1+およびCD45.1+CD45.2+ OT-I細胞をB16F10-OVA担がんC57BL/6マウスに注射した。腫瘍を、移植後8日目にCD45.1+ OT-I細胞移植マウス(ドナー)から外科的に切除し、移植腫瘍と同じ側の背側腹部の腫瘍マッチCD45.1+CD45.2+ OT-I細胞移植マウス(レシピエント)に移植した。フロー?...

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Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

ここでは、マウス腫瘍モデルにおける腫瘍固有および末梢由来腫瘍浸潤リンパ球の特性評価のための腫瘍移植プロトコールを提示する。フローサイトメトリーによるレシピエント由来免疫細胞の流入の特異的追跡は、抗腫瘍免疫応答中のこれらの細胞の表現型および機能的変化のダイナミクスを明らかにする。

マウスにおける腫瘍浸潤CD8+ T細胞の動態を評価するための腫瘍移植

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

この方法は、末梢組織からの腫瘍特異的免疫細胞の補充があるかどうか、腫瘍微小環境内で新たに浸潤した免疫細胞と既存の免疫細胞との間の遷移、および免疫療法に対するそれらの応答を含む、腫瘍免疫学における重要な質問に答えるのに役立つ。これは、末梢由来細胞と腫瘍浸潤免疫細胞を区別し、縦断アッセイでこれらの細胞の動的、表現的、および機能的変化を追跡するための便利でわかりやすい技術です。まず、調製したB16F10-OVA細胞懸濁液100マイクロリットルを1mLツベルクリンシリンジに引き込む。バレルをタップして気泡を上部に移動し、プランジャーを静かに押して気泡を取り除きます。腹部が露出するようにマウスを拘束します。左後肢を小指で押して、左鼠径部の皮膚を引き締めます。マウスの毛を左下腹部から電気シェーバーで取り除きます。75%エタノールに浸した綿を使用して、左腹部の後象限をきれいにします。シリンジを0〜15度の浅い角度で持ち、針の斜めを上に向けて、左上腿の側面に挿入します。針を皮下組織を通って鼠径部に0.5〜1センチメートル進める。注入する前にプランジャーを後ろに引いてください。負圧がある場合は、プランジャーを完全に押し下げて、サブキューティスに小さな液体ポケットまたはボーラスの形成を観察します。注射が行われた後に針を取り外す。マウスを放してケージに戻します。B16F10-OVA移植後6~8日目に、腫瘍サイズをバーニアスケールで測定する。直径約3ミリメートルまたは緑豆サイズの腫瘍を有するマウスを選択し、それらを均等かつランダムに2つのグループに分割する。200マイクロリットルのOT-1細胞懸濁液を100ユニットの29ゲージインスリンシリンジに引き出し、気泡を除去する。マウスをケージに別々に置き、ケージの上に赤外線ランプを5〜10分間かけて尾静脈を拡張します。マウスを適切なサイズの拘束装置で固定する。尾をまっすぐに伸ばし、静脈を見えるように75%エタノールをスプレーします。シリンジを静脈と平行に保持し、0〜15度の角度で静脈に挿入する。プランジャーをわずかに引き戻し、血液がバレルに入った場合は、毎分1ミリリットル以下の速度で懸濁液をゆっくりと着実に注入します。注射が完了したら、注射器を取り外し、注射領域を3〜5秒間静かに押して出血を止めます。マウスをケージに戻し、副作用がないか数分間注意深く観察します。それが正常な可動性と鼻汁を持っているならば、それを他のマウスの会社に戻してください。養子移入の8〜10日後に、直径約5ミリメートルの同等の腫瘍塊を有するドナーマウスを移植手術のために選択する。バイオセーフティキャビネットに100ミリメートル×20ミリリットルの皿を置き、10ミリリットルの滅菌、氷冷PBSを加える。マウスを安楽死させた後、75%エタノールに3〜5分間浸漬する。バイオセーフティキャビネット内の清潔な吸収紙で覆われた解剖ボードの上にマウスを仰臥位に置きます。解剖針でマウスの四肢を拘束する。はさみで尿道オリフィスの上から剣状体まで正中線に沿って皮膚を切断する。ピンセットで皮膚をマウスの体の左側に伸ばし、解剖針で皮膚を拘束します。腫瘍を切除し、そのカプセルをできるだけ無傷に保つ。外科用はさみで腫瘍の近くの結合組織を注意深く穏やかに除去し、その後移植するために滅菌された氷冷PBSを含む皿に腫瘍組織を置く。目に獣医用軟膏を使用して、乾燥を防ぎます。マウスの左脇腹を電気シェーバーで剃り、脱毛クリームを塗って残りの毛を取り除きます。マウスの縦軸が実験者の右側に平行で、マウスの頭が平行になるように、清潔な吸収紙で覆われた解剖ボード上のバイオセーフティキャビネットの内側にマウスを置きます。ポビドンヨードに浸した綿で剃った部分の皮膚をこすります。マウスの股関節の中間点にある皮膚を外科用ピンセットで持ち上げます。はさみを使用して長さ5ミリメートルの垂直切除を行い、背側正中線に沿って吻側に切断を約10〜15ミリメートルまで伸ばす。はさみの閉じた先端を切開部に挿入し、左脇腹の腹膜を皮膚および軟部組織から分離するために開いて鋭い解剖を行う。鋭い解剖を数回行い、左脇腹に皮膚ポケットを作ります。封入された無傷のドナー由来の腫瘍塊をポケットに預ける。切開部ごとに2つまたは3つのステッチを使用して、中断された縫合糸によって切開部を閉じる。ポビドンヨードに浸した綿でカットの周りの皮膚を消毒します。マウスを清潔で暖かいケージの横の位置に置きます。胸骨の臥位を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、継続的に監視してください。ブプレノルフィンを皮下投与し、体重1kgあたり0.1ミリグラムを8時間ごとに投与し、合計3回投与する。移植レシピエントは、完全に回復した後にのみ他の動物の会社に返してください。フローサイトメトリーを用いて、CD45.1陽性ドナー由来およびCD45.1陰性およびCD45.2陽性レシピエント由来腫瘍浸潤CD8陽性T細胞を含む、腫瘍微小環境においてCD44陰性およびCD8陽性腫瘍抗原特異的T細胞の2つの集団を容易に同定した。移植後2日目には、移植腫瘍内にドナー由来抗原特異的CD8陽性T細胞が約83%存在し、レシピエント由来のCD8陽性T細胞よりも優勢であった。レシピエント由来OT-1細胞の割合は、腫瘍形成の後期段階で上昇し、ドナー由来の腫瘍固有のOT-1細胞を上回った。覚えておくべき最も重要なことは、皮下腫瘍移植中に穏やかな解剖を行い、周囲の組織、特に顆粒リンパ節の損傷を避けることです。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

ザ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;成虫盤腫瘍モデル：遺伝的モザイクを用いた遺伝子発現と腫瘍侵襲性の可視化と定量化

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivoひと肺腫瘍内常駐 cd8 陽性 T リンパ球の画像スライス共焦点顕微鏡を用いた

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

単球/マクロファージにおける腫瘍微小環境の採用を検討する癌細胞株における遺伝子発現の条件付きのノックダウン

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

多重蛍光分析・数量化腫瘍 PD 1+ティム-3+ CD8 の+ T 細胞

Immune cells are important components of the tumor microenvironment and influence tumor growth and evolution at all stages of carcinogenesis. Notably, it ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

チップ チューブ形式を使用して散発的な家族性大腸腺腫症患者の遺伝的変異のデジタル ポリメラーゼ連鎖反応分析

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

CD8 による培養腫瘍細胞のアポトーシスのリアルタイム検出+ T 細胞腫瘍浸潤骨髄細胞の免疫抑制機能を勉強するには

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

The Clinical Application of Tumor Treating Fields Therapy in Glioblastoma

腫瘍神経膠芽腫でフィールド療法を治療の臨床応用

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

キメラ抗原受容体の T 細胞の抗腫瘍機能の予測評価のため培養腫瘍細胞の再投与に

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

腫瘍抗原特異的T細胞の生成にヒト誘導多能性幹細胞を用いた

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

直交トピック膵腫瘍の生成と腫瘍浸潤T細胞細胞傷害のEx生体内特性評価

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...