Name: tumor transplantation for assessing the dynamics of tumor-infiltrating cd8+ t cells in mice
Uploaded: 2021-06-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice at JoVE.com

이 연구는 저명한 젊은 학자를위한 국립 자연 과학 기금 (31825011 번에서 LY)과 중국 국립 자연 과학 재단 (QH에 31900643 번, ZW에 31900656 번)의 보조금으로 지원되었습니다.

모든 마우스 실험은 세 번째 군사 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따라 수행되었습니다. 6-8 주령의 C57BL / 6 마우스와 18-22 g의 나이브 OT-I 트랜스제닉 마우스를 사용하십시오. 무작위 추출이나 "눈부심"없이 남성과 여성 모두를 사용하십시오.
1. 배지 및 시약의 제조
<ol><li>앞서 기술한 바와 같이 세포 배양 배지 D10을 준비하고, 둘베코의 변형 이글 배지에 1...

<ol>
	<li>Blank, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+'T+cell+exhaustion.">Defining 'T cell exhaustion.</a> Nature Reviews Immunology. 19 (11), 665-674 (2019).</li><li>Leko, V., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+and+targeting+human+tumor+antigens+for+T+cell-based+immunotherapy+of+solid+tumors.">Identifying and targeting human tumor antigens for T cell-based immunotherapy of solid tumors.</a> Cancer Cell. 38 (4), 454-472 (2020).</li><li>McLane, L. M., Abdel-Hakeem, M. S., Wherry, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+T+cell+exhaustion+during+chronic+viral+infection+and+cancer.">CD8 T cell exhaustion during chronic viral infection and cancer.</a> Annual Review of Immunology. 37, 457-495 (2019).</li><li>Davis, M. M., Brodin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebooting+human+immunology.">Rebooting human immunology.</a> Annual Review of Immunology. 36, 843-864 (2018).</li><li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+immune+checkpoint+therapy.">The future of immune checkpoint therapy.</a> Science. 348 (6230), 56-61 (2015).</li><li>Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Releasing+the+brakes+on+cancer+immunotherapy.">Releasing the brakes on cancer immunotherapy.</a> Cell. 373 (16), 1490-1492 (2015).</li><li>Verma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+blockade+in+subprimed+CD8+cells+induces+dysfunctional+PD-1(+)CD38(hi)+cells+and+anti-PD-1+resistance.">PD-1 blockade in subprimed CD8 cells induces dysfunctional PD-1(+)CD38(hi) cells and anti-PD-1 resistance.</a> Nature Immunology. 20, 1231-1243 (2019).</li><li>Hashimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+T+cell+exhaustion+in+chronic+infection+and+cancer:+opportunities+for+interventions.">CD8 T cell exhaustion in chronic infection and cancer: opportunities for interventions.</a> Annual Review of Medicine. 69, 301-318 (2018).</li><li>Dammeijer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PD-1/PD-L1-checkpoint+restrains+T+cell+immunity+in+tumor-draining+lymph+nodes.">The PD-1/PD-L1-checkpoint restrains T cell immunity in tumor-draining lymph nodes.</a> Cancer Cell. 38 (5), 685-700 (2020).</li><li>Buchwald, Z. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-draining+lymph+node+is+important+for+a+robust+abscopal+effect+stimulated+by+radiotherapy.">Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 8 (2), 000867 (2020).</li><li>Philip, M., Schietinger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+fate+choice:+T+cell+exhaustion+in+cancer+and+chronic+infections.">Heterogeneity and fate choice: T cell exhaustion in cancer and chronic infections.</a> Current Opinion in Immunology. 58, 98-103 (2019).</li><li>Miller, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsets+of+exhausted+CD8(+)+T+cells+differentially+mediate+tumor+control+and+respond+to+checkpoint+blockade.">Subsets of exhausted CD8(+) T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade.</a> Nature Immunology. 20, 326-336 (2019).</li><li>Wu, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+T+cell+expansion+predicts+tumour+infiltration+and+clinical+response.">Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response.</a> Nature. 579, 274-278 (2020).</li><li>Im, S. J., Konieczny, B. T., Hudson, W. H., Masopust, D., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1++stemlike+CD8+T+cells+are+resident+in+lymphoid+tissues+during+persistent+LCMV+infection.">PD-1+ stemlike CD8 T cells are resident in lymphoid tissues during persistent LCMV infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 117 (8), 4292-4299 (2020).</li><li>Beltra, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+relationships+of+four+exhausted+CD8(+)+T+cell+subsets+reveals+underlying+transcriptional+and+epigenetic+landscape+control+mechanisms.">Developmental relationships of four exhausted CD8(+) T cell subsets reveals underlying transcriptional and epigenetic landscape control mechanisms.</a> Immunity. 52 (5), 825-841 (2020).</li><li>Myers, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+subset+of+CD8(+)+T+cells+during+chronic+exhaustion+is+defined+by+SIRPalpha+expression.">A functional subset of CD8(+) T cells during chronic exhaustion is defined by SIRPalpha expression.</a> Nature Communications. 10 (1), 794 (2019).</li><li>Jansen, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intra-tumoral+niche+maintains+and+differentiates+stem-like+CD8+T+cells.">An intra-tumoral niche maintains and differentiates stem-like CD8 T cells.</a> Nature. 576, 465-470 (2019).</li><li>Jadhav, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+signature+of+PD-1++TCF1++CD8+T+cells+that+act+as+resource+cells+during+chronic+viral+infection+and+respond+to+PD-1+blockade.">Epigenetic signature of PD-1+ TCF1+ CD8 T cells that act as resource cells during chronic viral infection and respond to PD-1 blockade.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 116 (28), 14113-14118 (2019).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+CD8+T+cells+form+a+proliferative,+dynamically+regulated+compartment+within+human+melanoma.">Dysfunctional CD8 T cells form a proliferative, dynamically regulated compartment within human melanoma.</a> Cell. 176 (4), 775-789 (2018).</li><li>Kurtulus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Checkpoint+blockade+immunotherapy+induces+dynamic+changes+in+PD-1(-)CD8(+)+tumor-infiltrating+T+cells.">Checkpoint blockade immunotherapy induces dynamic changes in PD-1(-)CD8(+) tumor-infiltrating T cells.</a> Immunity. 50 (1), 181-194 (2019).</li><li>Fransen, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-draining+lymph+nodes+are+pivotal+in+PD-1/PD-L1+checkpoint+therapy.">Tumor-draining lymph nodes are pivotal in PD-1/PD-L1 checkpoint therapy.</a> JCI Insight. 3 (23), 124507 (2018).</li><li>E, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8(+)CXCR5(+)+T+cells+in+tumor-draining+lymph+nodes+are+highly+activated+and+predict+better+prognosis+in+colorectal+cancer.">CD8(+)CXCR5(+) T cells in tumor-draining lymph nodes are highly activated and predict better prognosis in colorectal cancer.</a> Human Immunology. 79 (6), 446-452 (2018).</li><li>Snell, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8(+)+T+cell+priming+in+established+chronic+viral+infection+preferentially+directs+differentiation+of+memory-like+cells+for+sustained+immunity.">CD8(+) T cell priming in established chronic viral infection preferentially directs differentiation of memory-like cells for sustained immunity.</a> Immunity. 49 (4), 678-694 (2018).</li><li>Siddiqui, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral+Tcf1(+)PD-1(+)CD8(+)+T+cells+with+stem-like+properties+promote+tumor+control+in+response+to+vaccination+and+checkpoint+blockade+immunotherapy.">Intratumoral Tcf1(+)PD-1(+)CD8(+) T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy.</a> Immunity. 50 (1), 195-211 (2019).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+TCF1+preserves+the+effector+function+of+exhausted+CD8+T+cells+during+chronic+viral+infection.">The transcription factor TCF1 preserves the effector function of exhausted CD8 T cells during chronic viral infection.</a> Frontiers in Immunology. 10, 169 (2019).</li><li>Krishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-like+CD8+T+cells+mediate+response+of+adoptive+cell+immunotherapy+against+human+cancer.">Stem-like CD8 T cells mediate response of adoptive cell immunotherapy against human cancer.</a> Science. 370 (6522), 1328-1334 (2020).</li><li>Yost, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+replacement+of+tumor-specific+T+cells+following+PD-1+blockade.">Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade.</a> Nature Medicine. 25, 1251-1259 (2019).</li><li>Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillere, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+in+oncoimmunology.">Mouse models in oncoimmunology.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl6+preserves+the+suppressive+function+of+regulatory+T+cells+during+tumorigenesis.">Bcl6 preserves the suppressive function of regulatory T cells during tumorigenesis.</a> Frontiers in Immunology. 11, 806 (2020).</li><li>Yu, D., Ye, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+portrait+of+CXCR5(+)+follicular+cytotoxic+CD8(+)+T+cells.">A portrait of CXCR5(+) follicular cytotoxic CD8(+) T cells.</a> Trends in Immunology. 39 (12), 965-979 (2018).</li><li>Bracci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophosphamide+enhances+the+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+immune+cells+through+the+induction+of+cytokine+expression,+B-cell+and+T-cell+homeostatic+proliferation,+and+specific+tumor+infiltration.">Cyclophosphamide enhances the antitumor efficacy of adoptively transferred immune cells through the induction of cytokine expression, B-cell and T-cell homeostatic proliferation, and specific tumor infiltration.</a> Clinical Cancer Research. 13 (2), 644-653 (2007).</li><li>Salem, M. L., El-Naggar, S. A., Mahmoud, H. A., Elgharabawy, R. M., Bader, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophosphamide+eradicates+murine+immunogenic+tumor+coding+for+a+non-self-antigen+and+induces+antitumor+immunity.">Cyclophosphamide eradicates murine immunogenic tumor coding for a non-self-antigen and induces antitumor immunity.</a> International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 32, 1-5 (2018).</li><li>Thorsson, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Immune+landscape+of+cancer.">The Immune landscape of cancer.</a> Immunity. 48 (4), 812-830 (2018).</li></ol>

T 세포 매개 면역은 종양에 대한 면역 반응에 중요한 역할을하며, CTL은 암 세포를 근절하는 데 주도적 인 역할을합니다. 그러나, TME 내의 종양 항원-특이적 CTLs의 기원은 해명되지 않았다(30). 이러한 종양 이식 프로토콜의 사용은 종양내 항원-특이적 CD8+ T 세포가 줄기-유사 TCF1+ 전구 CD8+ T 세포의 존재에도 불구하고 오랫동안 지속되지 않을 수 있다는 중요한 단서?...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62442">Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+&#160;T Cells in Mice</a>. The Protocol&#160;was&#160;updated.
Step 6.10 of the Protocol was updated from:
Administer penicillin every 8-12 h after the surgery for 3 days. Monitor the mouse&#39;s eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered. 
NOTE: The administration of buprenorphine is suggested to prevent post-surgical pain [delete sentence]. The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
to:
Administer buprenorphine subcutaneously at a dose of 0.1 mg/kg body weight every 8 h three times after surgery to alleviate the pain. Monitor the mouse&#39;s eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered. 
NOTE: The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62442">Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+&#160;T Cells in Mice</a>. The Protocol&#160;was&#160;updated.

Erratum: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

CD8+ T 세포-매개 면역 반응은 종양 성장을 조절하는데 중추적인 역할을 한다. 종양 생성 동안, 나이브 CD8+ T 세포는 MHC 클래스 I-제한 방식으로 항원 인식시 활성화되고, 이어서 이펙터 세포로 분화되고 종양 질량 1,2로 침윤된다. 그러나, 종양 미세환경(TME) 내에서, 장기간의 항원 노출, 뿐만 아니라 면역억제 인자는, 침윤된 종양 특이적 CD8+ T 세포를 "고갈"3으로 알려진 저반응 상태로 유도한다. 고갈된 T 세포 (Tex)는 급성 바이러스 감염에서 생성된 이펙터 또는 기억 T 세포와 구별되며, 전사적으로 및 후성유전학적으로 둘 다이다. 이들 텍스 세포는 주로 일련의 억제 수용체의 지속적이고 상승된 발현뿐만 아니라 이펙터 기능의 계층적 손실을 특징으로 한다. 또한, 소진된 CD8+ T 세포의 손상된 증식 능력은 종양 특이적 T 세포의 수의 감소를 초래하여, TME 내의 잔류 CD8+ T 세포가 종양 진행에 대해 충분한 보호 면역을 간신히 제공할 수 있다3. 따라서, 종양내 항원-특이적 CD8+ T 세포의 유지 또는 강화는 종양 억제에 필수적이다.
더욱이, 면역 체크포인트 봉쇄 (ICB) 요법은 T 세포 침윤을 증가시킴으로써 종양에서 텍스를 다시 활성화시키고, 따라서, T 세포 수 및 회춘 T 세포 기능을 활성화시켜 종양 억제를 증진시키는 것으로 여겨진다. ICB 치료의 광범위한 적용은 암 치료 환경을 변화시켰으며, 환자의 상당 부분이 내구성 있는 반응을 경험하고있다 4,5,6. 그럼에도 불구하고, 대부분의 환자와 암 유형은 ICB에 일시적으로 반응하지 않거나 단지 일시적으로 반응한다. TME에서의 부적절한 T 세포 침윤은 ICB 내성 7,8을 차지하는 근본적인 메카니즘 중 하나로 가정되었다.
 몇몇 연구는 환자 및 마우스 모델 9,10,11,12 모두에서 종양 침윤성 CD8+ T 세포 (TILs)의 이질성을 입증하였다. 종양 덩어리에서 T 세포 인자-1 (TCF1)을 발현하는 CD8+ T 세포의 서브세트가 줄기 세포 유사 특성을 나타내는 것으로 확인되었으며, 이는 말기 소모 된 T 세포를 더 일으킬 수 있으며 ICB 치료 후 증식 파열을 담당합니다 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22년. 그러나, 항원 특이적 TCF1+CD8+ T 세포의 단지 작은 비율만이 TME에 존재하고, ICB23,24,25,26에 반응하여 분화된 자손의 확장된 풀을 생성한다는 것이 입증되었다. 이 집단의 제한된 크기가 종양 진행을 조절하기 위해 세포독성 T 림프구 (CTLs)의 지속성을 보장하기에 충분한지 여부는 알려지지 않았으며, 주변 조직으로부터 보충이 있는지 여부는 추가 조사가 필요하다. 더욱이, 최근의 연구는 기존의 종양 특이적 T 세포의 불충분한 활성화 능력 및 항프로그램된 세포 사멸 단백질 1 처리 후에 신규한, 이전에 존재하지 않는 클론형의 출현을 시사한다. 이는 체크포인트 차단에 대한 T 세포 반응이 T 세포 클론(27)의 별개의 레퍼토리의 새로운 유입에 기인할 수 있음을 나타낸다. TME에서 방관자 비종양 반응성 세포독성 T 세포 분획의 존재와 함께, 이러한 발견은 주변부 유래 CD8+ T 세포11의 역할을 연구하기 위한 종양 동종이식편 모델의 확립을 촉발시켰다.
지금까지, 여러 종류의 종양 이식뿐만 아니라 면역 세포 입양 전달이 종양 면역학28 분야에서 널리 사용되어 왔다. TILs, 말초 혈액 단핵 세포, 및 종양-반응성 면역 세포는 다른 조직으로부터 기원된 이들 방법을 사용하여 잘 특성화될 수 있다. 그러나, 전신 및 국소 항종양 면역 사이의 상호작용을 연구할 때, 이들 모델은 주변부와 TME로부터 유래된 면역 세포 사이의 상호작용을 조사하기에 부적합한 것으로 보인다. 여기서, 종양 조직을 공여자로부터 종양 매칭 수용자 마우스로 이식하여 수용자 유래 면역 세포의 유입을 정확하게 추적하고 TME에서 공여체 유래 세포를 동시에 관찰하였다.
본 연구에서, 대리 신항원 난알부민을 안정적으로 발현하는 B16F10-OVA 흑색종 세포주와 함께 흑색종의 뮤린 신생 모델이 확립되었다. CD8+ T 세포의 90% 이상이 클래스 I MHC 분자 H2-Kb에 결합된 OVA 유래 펩티드 OVA257-264(SIINFEKL)를 특이적으로 인식하는 TCR 트랜스제닉 OT-I 마우스는 B16F10-OVA 종양 모델에서 개발된 항원 특이적 T 세포 반응의 연구를 가능하게 한다. 이 모델을 종양 이식과 결합하여, 종양-고유 및 주변-기원 항원-특이적 CD8+ T 세포의 면역 반응을 비교하여, 이들 두 집단 사이의 동적 전이를 드러냈다. 총체적으로, 이 실험 설계는 TME에서 CD8+ T 세포의 면역 반응을 정밀하게 조사하기 위한 또 다른 접근법을 제공하였고, 이는 TME에서 종양 특이적 T 세포 면역 반응의 역학에 대한 새로운 빛을 발산한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL tuberculin syringe</td>
			<td>KDL</td>
			<td>BB000925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tube</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG2211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 U insulin syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>320310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>BEAVER</td>
			<td>43008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T48402-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methyl-2-butanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>240486-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m nylon cell strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD45.1</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>110714</td>
			<td>Clone:A20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16F10-OVA cell line</td>
			<td>bluefbio</td>
			<td>BFN607200447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-V (bovine serum albumin)</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>bs-0292P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 Mouse Anti-Mouse CD45.2</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>562895</td>
			<td>Clone:104</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture dish</td>
			<td>BEAVER</td>
			<td>43701/43702/43703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R-A462/5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyclophosphamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0768-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>19853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>EDS-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACSCanto II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>PorLab Scientific</td>
			<td>HM330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>RWD life science</td>
			<td>R510-22-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KHCO3</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501195-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L10199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle carrier</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>F31034-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501569-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0099-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse TCR V&#945;2</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>127808</td>
			<td>Clone:B20.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep Glutamine (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100734</td>
			<td>Clone:53-6.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical forceps</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>F12005-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical scissors</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>S12003-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suture thread</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>F34004-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tumor transplantation for assessing the dynamics of tumor-infiltrating cd8+ t cells in mice

T 세포 매개 면역은 종양에 대한 면역 반응에 중요한 역할을하며, 세포독성 T 림프구 (CTLs)는 암 세포를 근절하는 데 주도적 인 역할을합니다. 그러나, 종양 미세환경(TME) 내의 종양 항원-특이적 CD8+ T 세포의 기원 및 보충은 모호한 채로 남아있다. 이 프로토콜은 대리 신항원, 난알부민 (OVA) 및 TCR 트랜스제닉 OT-I 마우스를 안정적으로 발현하는 B16F10-OVA 흑색종 세포주를 채용하며, 여기서 CD8+ T 세포의 90% 이상이 클래스 I 주조직 적합성 복합체 (MHC) 분자 H2-Kb에 결합된 OVA 유래 펩티드 OVA 257-264 (SIINFEKL)를 특이적으로 인식한다. 이러한 특징들은 종양발생 동안 항원-특이적 T 세포 반응의 연구를 가능하게 한다.
이 모델을 종양 이식 수술과 결합하여, 기증자의 종양 조직을 종양과 일치하는 합성 수용자 마우스에 이식하여 이식된 기증자 조직으로의 수용자 유래 면역 세포의 유입을 정확하게 추적하여, 종양 고유 및 주변부 기원 항원 특이적 CD8+ 의 면역 반응을 분석할 수 있게 하였다. T 세포. 이 두 집단 사이에서 역동적 인 전환이 일어나는 것으로 나타났습니다. 총체적으로,이 실험 설계는 TME에서 CD8+ T 세포의 면역 반응을 정확하게 조사하기위한 또 다른 접근법을 제공했으며, 이는 종양 면역학에 대한 새로운 빛을 비출 것입니다.

이 프로토콜의 회로도는 그림 1에 나와 있습니다. 종양 접종 8일 후, CD45.1+ 및 CD45.1+CD45.2+ OT-I 세포를 B16F10-OVA 종양 보유 C57BL/6 마우스에 주사하였다. 종양을 이식 후 8일째에 CD45.1+ OT-I 세포 이식 마우스(공여자)로부터 외과적으로 해부하고, 이식된 종양과 동일한 쪽의 등쪽 옆구리에 종양-매칭된 CD45.1+CD45.2+ OT-I 세포 이식된 마우스(수용...

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Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

여기에서, 마우스 종양 모델에서 종양 내재 및 주변부 유래 종양 침윤된 림프구의 특성화를 위한 종양 이식 프로토콜을 제시한다. 유세포 분석기를 사용한 수용자 유래 면역 세포의 유입에 대한 특이적 추적은 항종양 면역 반응 동안 이들 세포의 표현형 및 기능적 변화의 역학을 드러낸다.

마우스에서 종양 침윤성 CD8+ T 세포의 역학을 평가하기 위한 종양 이식

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

이 방법은 말초 조직에서 종양 특이 면역 세포의 보충이 있는지 여부, 종양 미세 환경 내에서 새로 침윤 된 면역 세포와 이미 존재하는 면역 세포 간의 전이 및 면역 요법에 대한 반응을 포함하여 종양 면역학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이는 종양 침윤된 면역 세포로부터 주변부 유래 세포를 구별하고 종방향 분석에서 이들 세포의 동적, 페노티픽 및 기능적 변화를 추적하기 위해 편리하고 따라하기 쉬운 기술이다. 먼저 제조된 B16F10-OVA 세포 현탁액 100 마이크로리터를 1 mL 투베르쿨린 주사기 내로 인출한다.배럴을 탭하여 거품을 위쪽으로 이동시키고 플런저를 부드럽게 밀어 기포를 제거합니다. 마우스를 제지하여 복부를 노출시킵니다. 새끼 손가락으로 왼쪽 뒷다리를 눌러 왼쪽 사타구니 부위의 피부를 조입니다.전기 면도기로 왼쪽 하복부에서 마우스의 머리카락을 제거하십시오. 75 % 에탄올에 적신 면화를 사용하여 왼쪽 복부의 후부 사분면을 청소하십시오. 주사기를 0도에서 15도 사이의 얕은 각도로 잡고 바늘의 경사가 위쪽을 향하게하여 왼쪽 위 허벅지 측면에 삽입하십시오.바늘을 0.5 ~ 1 센티미터로 피하 조직을 통해 사타구니 영역으로 밀어 넣으십시오. 주입하기 전에 플런저를 뒤로 당깁니다. 음압이있는 경우 플런저를 완전히 누르고 서브 큐티스에 작은 유체 주머니 또는 볼루스가 형성되는 것을 관찰하십시오.주사가 수행 된 후 바늘을 제거하십시오. 마우스를 떼어 케이지에 다시 넣습니다. B16F10-OVA 이식 후 6일째 내지 여덟 일째에, 버니어 스케일로 종양 크기를 측정한다.대략 세 밀리미터 직경 또는 녹두 크기의 종양을 가진 마우스를 선택하고 동등하고 무작위로 두 그룹으로 나눕니다. 200 마이크로리터의 OT-1 세포 현탁액을 100 유닛 29 게이지 인슐린 주사기로 회수하고 기포를 제거하십시오. 마우스를 케이지에 별도로 놓고 새장 위에 적외선 램프를 두어 5 ~ 10 분 동안 꼬리 정맥을 확장시킵니다.적절한 크기의 억제 장치로 마우스를 고정시킵니다. 꼬리를 잡고 곧게 펴고 75 % 에탄올을 뿌려 정맥을 보이게하십시오. 주사기를 정맥에 평행하게 잡고 0 ~ 15도 각도로 정맥에 삽입하십시오.플런저를 약간 뒤로 당기고 혈액이 배럴에 들어가면 천천히 그리고 꾸준히 분당 한 밀리리터 이하의 속도로 현탁액을 주입하십시오. 주사가 완료된 후, 주사기를 제거하고 주사 부위를 삼 ~ 다섯 초 동안 부드럽게 눌러 출혈을 멈추십시오. 마우스를 케이지로 돌려 놓고 부작용이 있는지 몇 분 동안 면밀히 관찰하십시오.정상적인 이동성과 비강 분비물이있는 경우 다른 마우스의 회사에 다시 넣으십시오. 입양 이식 후 8 내지 10일 후, 이식 수술을 위해 대략 5밀리미터 직경의 유사한 종양 질량을 갖는 공여체 마우스를 선택한다. 생물 안전 캐비닛에 100 밀리미터 x 20 밀리리터 접시를 놓고 멸균 된 얼음처럼 차가운 PBS 10 밀리리터를 넣으십시오.마우스를 안락사시킨 후, 75%에탄올에 3~5분 동안 담그십시오. 마우스를 생물 안전 캐비닛의 깨끗한 흡수 종이로 덮인 해부 보드의 수핀 위치에 놓습니다. 해부 바늘로 마우스 팔다리를 제지하십시오.요도 오리피스 위에서 가위로 xiphoid까지 중간 선을 따라 피부를 자릅니다. 핀셋으로 마우스 몸의 왼쪽으로 피부를 스트레칭하고 해부 바늘로 피부를 억제하십시오. 종양을 소비하고 캡슐을 가능한 한 그대로 유지하십시오.수술 가위로 종양 근처의 결합 조직을 조심스럽게 부드럽게 제거한 다음, 후속 이식을 위해 멸균되고 빙냉 PBS가 들어있는 접시에 종양 조직을 놓습니다. 눈에 수의학 연고를 사용하여 건조하지 않도록하십시오. 전기 면도기로 마우스의 왼쪽 측면을 면도 한 다음 탈모 크림을 바르고 나머지 머리카락을 제거하십시오.마우스를 깨끗한 흡수성 종이로 덮인 해부 보드의 쉬운 위치에 생물 안전 캐비닛 안에 놓고 마우스의 수직 축을 평행하게하고 머리는 실험자의 오른쪽에 놓습니다. 면도 부위의 피부를 포비돈 요오드에 적신 면화로 문지릅니다. 수술 핀셋으로 마우스 엉덩이 관절 사이의 중간 지점에서 피부를 들어 올립니다.가위를 사용하여 5 밀리미터 길이의 수직 절제를하고 등쪽 미드 라인을 따라 로스트랄로 컷을 약 10 ~ 15 밀리미터까지 확장하십시오. 가위의 닫힌 끝을 절개에 삽입 한 다음 왼쪽 측면의 복막을 피부와 연조직으로부터 분리하여 열어 날카로운 해부를 수행하십시오. 날카로운 해부를 여러 번 수행하여 왼쪽 측면에 피부 주머니를 생성합니다.캡슐화되고 손상되지 않은 공여체 유래 종양 덩어리를 주머니에 넣으십시오. 각 절개에 대해 두 개 또는 세 개의 바늘을 사용하여 중단 된 봉합사로 절개를 닫습니다. 포비돈 요오드에 적신 면화로 컷 주위의 피부를 소독하십시오.마우스를 깨끗하고 따뜻한 케이지의 옆 위치에 놓습니다. 흉골 잔해를 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 지속적으로 모니터링하십시오. 부프레노르핀을 8시간마다 체중 1kg당 0.1밀리그램의 용량으로 피하 투여하여 총 세 번 복용한다.이식 수혜자를 완전히 회복 한 후에 만 다른 동물의 회사로 돌려 보내십시오. 유세포 분석기를 사용하여, CD44 음성 및 CD8 양성 종양 항원-특이적 T 세포의 두 집단을 종양 미세환경에서 쉽게 동정하였고, 여기에는 CD45.1 양성 공여자 유래 및 CD45.1 음성 및 CD45.2 양성 수용자 유래 종양 침윤 CD8 양성 T 세포가 포함된다. 이식 후 둘째 날에, 이식된 종양 내에 공여체 유래 항원 특이적 CD8 양성 T 세포의 약 83%가 존재하였으며, 이는 그들의 수용자 유래 대응물보다 더 우세하였다.수용자 유래 OT-1 세포의 비율은 종양 발생의 후기 단계에서 상승하였고, 공여자로부터 유래된 종양 고유 OT-1 세포를 초과하였다. 기억해야 할 가장 중요한 것은 주변 조직, 특히 과립 림프절에서 부상을 피하기 위해 피하 종양 이식 중에 부드러운 해부를 수행하는 것입니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

그만큼<em&gt; 초파리</em&gt; 가상적인 디스크 종양 모델 : 유전 모자이크를 사용하여 유전자 발현 및 종양 침윤의 시각화 및 정량화

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

연구

암 연구학

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

전 비보 인간의 폐 종양에 거주 CD8 T 림프 톨의 이미징 조각 사용 하 여 Confocal 현미경 검사 법

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

암 세포 선 종양 Microenvironment에 Monocytes/대 식 세포의 모집 연구에서 유전자 발현의 조건부 최저

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

면역 형광 분석 및 Intratumoral+ PD-1 팀-3+ CD8의 정량화를 다중화+ T 세포

Immune cells are important components of the tumor microenvironment and influence tumor growth and evolution at all stages of carcinogenesis. Notably, it ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

튜브에 칩 형식을 사용 하 여 산발적 인 가족 용 대 환자에 있는 유전 변이 대 한 디지털 중 합 효소 연쇄 반응 분석 결과

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

실시간 탐지의 체 외 종양 세포 Apoptosis에 CD8에 의해 유도 된+ T 세포 종양 침투 골수성 세포의 면역 진압 기능 연구

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

The Clinical Application of Tumor Treating Fields Therapy in Glioblastoma

종양 세포종 필드 치료 치료의 임상 적용

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

체 외 종양 세포 Rechallenge 공상 항 원 수용 체 T 세포 Antitumor 기능 예측 평가

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

종양 항원 특이적 T 세포의 생성을 위한 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하여

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

종양 침투 T 세포 독성의 정형 외 췌장 종양 및 Ex 생체 특성의 생성

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...