Name: tumor transplantation for assessing the dynamics of tumor-infiltrating cd8+ t cells in mice
Uploaded: 2021-06-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice at JoVE.com

Denne studien ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Fund for Distinguished Young Scholars (No. 31825011 to LY) og National Natural Science Foundation of China (Nr. 31900643 til QH, Nr. 31900656 til ZW).

Alle museeksperimenter ble utført i samsvar med retningslinjene fra institusjonell dyrepleie og brukskomiteer ved Det tredje militære medisinske universitet. Bruk 6-8 uker gamle C57BL/6 mus og naive OT-I transgene mus som veier 18-22 g. Bruk både mann og kvinne uten randomisering eller "blinding".
1. Tilberedning av medium og reagenser
<ol><li>Forbered cellekultur medium D10 som tidligere beskrevet29 ved å legge til 10% foster bovint serum (FBS), 100 U / ml penici...

<ol>
	<li>Blank, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+'T+cell+exhaustion.">Defining 'T cell exhaustion.</a> Nature Reviews Immunology. 19 (11), 665-674 (2019).</li><li>Leko, V., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+and+targeting+human+tumor+antigens+for+T+cell-based+immunotherapy+of+solid+tumors.">Identifying and targeting human tumor antigens for T cell-based immunotherapy of solid tumors.</a> Cancer Cell. 38 (4), 454-472 (2020).</li><li>McLane, L. M., Abdel-Hakeem, M. S., Wherry, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+T+cell+exhaustion+during+chronic+viral+infection+and+cancer.">CD8 T cell exhaustion during chronic viral infection and cancer.</a> Annual Review of Immunology. 37, 457-495 (2019).</li><li>Davis, M. M., Brodin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebooting+human+immunology.">Rebooting human immunology.</a> Annual Review of Immunology. 36, 843-864 (2018).</li><li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+immune+checkpoint+therapy.">The future of immune checkpoint therapy.</a> Science. 348 (6230), 56-61 (2015).</li><li>Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Releasing+the+brakes+on+cancer+immunotherapy.">Releasing the brakes on cancer immunotherapy.</a> Cell. 373 (16), 1490-1492 (2015).</li><li>Verma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+blockade+in+subprimed+CD8+cells+induces+dysfunctional+PD-1(+)CD38(hi)+cells+and+anti-PD-1+resistance.">PD-1 blockade in subprimed CD8 cells induces dysfunctional PD-1(+)CD38(hi) cells and anti-PD-1 resistance.</a> Nature Immunology. 20, 1231-1243 (2019).</li><li>Hashimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+T+cell+exhaustion+in+chronic+infection+and+cancer:+opportunities+for+interventions.">CD8 T cell exhaustion in chronic infection and cancer: opportunities for interventions.</a> Annual Review of Medicine. 69, 301-318 (2018).</li><li>Dammeijer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PD-1/PD-L1-checkpoint+restrains+T+cell+immunity+in+tumor-draining+lymph+nodes.">The PD-1/PD-L1-checkpoint restrains T cell immunity in tumor-draining lymph nodes.</a> Cancer Cell. 38 (5), 685-700 (2020).</li><li>Buchwald, Z. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-draining+lymph+node+is+important+for+a+robust+abscopal+effect+stimulated+by+radiotherapy.">Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 8 (2), 000867 (2020).</li><li>Philip, M., Schietinger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+fate+choice:+T+cell+exhaustion+in+cancer+and+chronic+infections.">Heterogeneity and fate choice: T cell exhaustion in cancer and chronic infections.</a> Current Opinion in Immunology. 58, 98-103 (2019).</li><li>Miller, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsets+of+exhausted+CD8(+)+T+cells+differentially+mediate+tumor+control+and+respond+to+checkpoint+blockade.">Subsets of exhausted CD8(+) T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade.</a> Nature Immunology. 20, 326-336 (2019).</li><li>Wu, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+T+cell+expansion+predicts+tumour+infiltration+and+clinical+response.">Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response.</a> Nature. 579, 274-278 (2020).</li><li>Im, S. J., Konieczny, B. T., Hudson, W. H., Masopust, D., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1++stemlike+CD8+T+cells+are+resident+in+lymphoid+tissues+during+persistent+LCMV+infection.">PD-1+ stemlike CD8 T cells are resident in lymphoid tissues during persistent LCMV infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 117 (8), 4292-4299 (2020).</li><li>Beltra, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+relationships+of+four+exhausted+CD8(+)+T+cell+subsets+reveals+underlying+transcriptional+and+epigenetic+landscape+control+mechanisms.">Developmental relationships of four exhausted CD8(+) T cell subsets reveals underlying transcriptional and epigenetic landscape control mechanisms.</a> Immunity. 52 (5), 825-841 (2020).</li><li>Myers, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+subset+of+CD8(+)+T+cells+during+chronic+exhaustion+is+defined+by+SIRPalpha+expression.">A functional subset of CD8(+) T cells during chronic exhaustion is defined by SIRPalpha expression.</a> Nature Communications. 10 (1), 794 (2019).</li><li>Jansen, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intra-tumoral+niche+maintains+and+differentiates+stem-like+CD8+T+cells.">An intra-tumoral niche maintains and differentiates stem-like CD8 T cells.</a> Nature. 576, 465-470 (2019).</li><li>Jadhav, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+signature+of+PD-1++TCF1++CD8+T+cells+that+act+as+resource+cells+during+chronic+viral+infection+and+respond+to+PD-1+blockade.">Epigenetic signature of PD-1+ TCF1+ CD8 T cells that act as resource cells during chronic viral infection and respond to PD-1 blockade.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 116 (28), 14113-14118 (2019).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+CD8+T+cells+form+a+proliferative,+dynamically+regulated+compartment+within+human+melanoma.">Dysfunctional CD8 T cells form a proliferative, dynamically regulated compartment within human melanoma.</a> Cell. 176 (4), 775-789 (2018).</li><li>Kurtulus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Checkpoint+blockade+immunotherapy+induces+dynamic+changes+in+PD-1(-)CD8(+)+tumor-infiltrating+T+cells.">Checkpoint blockade immunotherapy induces dynamic changes in PD-1(-)CD8(+) tumor-infiltrating T cells.</a> Immunity. 50 (1), 181-194 (2019).</li><li>Fransen, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-draining+lymph+nodes+are+pivotal+in+PD-1/PD-L1+checkpoint+therapy.">Tumor-draining lymph nodes are pivotal in PD-1/PD-L1 checkpoint therapy.</a> JCI Insight. 3 (23), 124507 (2018).</li><li>E, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8(+)CXCR5(+)+T+cells+in+tumor-draining+lymph+nodes+are+highly+activated+and+predict+better+prognosis+in+colorectal+cancer.">CD8(+)CXCR5(+) T cells in tumor-draining lymph nodes are highly activated and predict better prognosis in colorectal cancer.</a> Human Immunology. 79 (6), 446-452 (2018).</li><li>Snell, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8(+)+T+cell+priming+in+established+chronic+viral+infection+preferentially+directs+differentiation+of+memory-like+cells+for+sustained+immunity.">CD8(+) T cell priming in established chronic viral infection preferentially directs differentiation of memory-like cells for sustained immunity.</a> Immunity. 49 (4), 678-694 (2018).</li><li>Siddiqui, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral+Tcf1(+)PD-1(+)CD8(+)+T+cells+with+stem-like+properties+promote+tumor+control+in+response+to+vaccination+and+checkpoint+blockade+immunotherapy.">Intratumoral Tcf1(+)PD-1(+)CD8(+) T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy.</a> Immunity. 50 (1), 195-211 (2019).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+TCF1+preserves+the+effector+function+of+exhausted+CD8+T+cells+during+chronic+viral+infection.">The transcription factor TCF1 preserves the effector function of exhausted CD8 T cells during chronic viral infection.</a> Frontiers in Immunology. 10, 169 (2019).</li><li>Krishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-like+CD8+T+cells+mediate+response+of+adoptive+cell+immunotherapy+against+human+cancer.">Stem-like CD8 T cells mediate response of adoptive cell immunotherapy against human cancer.</a> Science. 370 (6522), 1328-1334 (2020).</li><li>Yost, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+replacement+of+tumor-specific+T+cells+following+PD-1+blockade.">Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade.</a> Nature Medicine. 25, 1251-1259 (2019).</li><li>Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillere, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+in+oncoimmunology.">Mouse models in oncoimmunology.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl6+preserves+the+suppressive+function+of+regulatory+T+cells+during+tumorigenesis.">Bcl6 preserves the suppressive function of regulatory T cells during tumorigenesis.</a> Frontiers in Immunology. 11, 806 (2020).</li><li>Yu, D., Ye, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+portrait+of+CXCR5(+)+follicular+cytotoxic+CD8(+)+T+cells.">A portrait of CXCR5(+) follicular cytotoxic CD8(+) T cells.</a> Trends in Immunology. 39 (12), 965-979 (2018).</li><li>Bracci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophosphamide+enhances+the+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+immune+cells+through+the+induction+of+cytokine+expression,+B-cell+and+T-cell+homeostatic+proliferation,+and+specific+tumor+infiltration.">Cyclophosphamide enhances the antitumor efficacy of adoptively transferred immune cells through the induction of cytokine expression, B-cell and T-cell homeostatic proliferation, and specific tumor infiltration.</a> Clinical Cancer Research. 13 (2), 644-653 (2007).</li><li>Salem, M. L., El-Naggar, S. A., Mahmoud, H. A., Elgharabawy, R. M., Bader, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophosphamide+eradicates+murine+immunogenic+tumor+coding+for+a+non-self-antigen+and+induces+antitumor+immunity.">Cyclophosphamide eradicates murine immunogenic tumor coding for a non-self-antigen and induces antitumor immunity.</a> International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 32, 1-5 (2018).</li><li>Thorsson, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Immune+landscape+of+cancer.">The Immune landscape of cancer.</a> Immunity. 48 (4), 812-830 (2018).</li></ol>

T cellemediert immunitet spiller en avgjørende rolle i immunresponser mot svulster, med CTLer som spiller hovedrollen i å utrydde kreftceller. Opprinnelsen til tumorantigenspesifikke CTLer i TME har imidlertid ikke blitt belyst30. Bruken av denne tumortransplantasjonsprotokollen har gitt en viktig anelse om at intratumorale antigenspesifikke CD8+ T-celler kanskje ikke vedvarer i lang tid, til tross for eksistensen av stamceller som TCF1 + stamfar CD8 + T-celler. ...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62442">Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+&#160;T Cells in Mice</a>. The Protocol&#160;was&#160;updated.
Step 6.10 of the Protocol was updated from:
Administer penicillin every 8-12 h after the surgery for 3 days. Monitor the mouse&#39;s eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered. 
NOTE: The administration of buprenorphine is suggested to prevent post-surgical pain [delete sentence]. The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
to:
Administer buprenorphine subcutaneously at a dose of 0.1 mg/kg body weight every 8 h three times after surgery to alleviate the pain. Monitor the mouse&#39;s eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered. 
NOTE: The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62442">Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+&#160;T Cells in Mice</a>. The Protocol&#160;was&#160;updated.

Erratum: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

CD8+ T cellemediert immunrespons spiller en sentral rolle i å kontrollere tumorvekst. Under tumorigenese aktiveres naive CD8+ T-celler ved antigengjenkjenning på en MHC-klasse I-begrenset måte og skiller seg deretter ut i effektorceller og infiltrerer i tumormasse 1,2. Men innenfor tumormikromiljøet (TME), langvarig antigeneksponering, samt immundempende faktorer, driver infiltrerte tumorspesifikke CD8+ T-celler inn i en hyporesponsiv tilstand kjent som "utmattelse"3. Utmattede T-celler (Tex) skiller seg fra effektor- eller minne T-celler generert i akutt virusinfeksjon, både transkripsjonelt og epigenetisk. Disse Tex-cellene er hovedsakelig preget av det vedvarende og forhøyede uttrykket av en rekke hemmende reseptorer, samt det hierarkiske tapet av effektorfunksjoner. Videre resulterer den svekkede proliferative kapasiteten til utmattede CD8 + T-celler i synkende antall tumorspesifikke T-celler, slik at de resterende CD8 + T-cellene i TME knapt kan gi tilstrekkelig beskyttende immunitet mot tumorprogresjon3. Dermed er vedlikehold eller forsterkning av intratumorale antigenspesifikke CD8 + T-celler uunnværlig for tumorundertrykkelse.
Videre antas immunkontrollpunktblokade (ICB) terapi å gjenopplive Tex i svulster ved å øke T-celleinfiltrasjonen og dermed T-celletall og forynge T-cellefunksjoner for å øke tumorundertrykkelsen. Den utbredte anvendelsen av ICB-behandling har endret kreftterapilandskapet, med en betydelig undergruppe av pasienter som opplever holdbare responser 4,5,6. Likevel reagerer de fleste pasienter og krefttyper ikke eller bare midlertidig på ICB. Utilstrekkelig T-celleinfiltrasjon i TME er postulert til å være en av de underliggende mekanismene som står for ICB-resistens 7,8.
Flere studier har vist heterogeniteten til tumorinfiltrerende CD8+ T-celler (TILer) hos både pasienter og musemodeller 9,10,11,12. Det har blitt bekreftet at en undergruppe av CD8+ T-celler som uttrykker T-cellefaktor-1 (TCF1) i en tumormasse viser stamcellelignende egenskaper, noe som ytterligere kan gi opphav til terminalt utmattede T-celler og er ansvarlig for spredningsutbruddet etter ICB-terapi 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Imidlertid har det vist seg at bare en liten andel av antigenspesifikke TCF1 + CD8 + T-celler eksisterer i TME og genererer et utvidet utvalg av differensiert avkom som svar på ICB 23,24,25,26. Hvorvidt den begrensede størrelsen på denne befolkningen er nok til å sikre utholdenheten til cytotoksiske T-lymfocytter (CTLer) for å kontrollere tumorprogresjon, forblir ukjent, og om det er etterfylling fra periferivev krever videre undersøkelse. Videre antyder nyere forskning den utilstrekkelige gjenoppfriskningskapasiteten til eksisterende tumorspesifikke T-celler og utseendet på nye, tidligere ikke-eksisterende clonotyper etter antiprogrammert celledødsprotein 1-behandling. Dette indikerer at T-cellerespons på kontrollpunktblokade kan skyldes den nye tilstrømningen av et tydelig repertoar av T-cellekloner27. Sammen med tilstedeværelsen av tilskuer ikke-tumor-reaktiv cytotoksisk T-cellefraksjon i TME, førte disse funnene til etableringen av en tumor allograft modell for å studere rollen som periferi-avledede CD8 + T-celler11.
Inntil nå har flere typer tumorimplantasjon, samt immuncelle adoptivoverføring, blitt mye brukt innen tumorimmunologi28. TILer, perifere mononukleære celler i blodet og tumorreaktive immunceller som stammer fra andre vev, kan karakteriseres godt ved hjelp av disse metodene. Men når man studerer interaksjonene mellom systemisk og lokal antitumorimmunitet, virker disse modellene utilstrekkelige til å undersøke samspillet mellom immunceller avledet fra periferien og TME. Her ble tumorvev transplantert fra donorer til tumortilpassede mottakermus for å spore tilstrømningen av mottakeravledede immunceller og observere donoravledede celler i TME samtidig.
I denne studien ble det etablert en murine syngeneisk modell av melanom med cellelinjen B16F10-OVA melanom, som stabilt uttrykker surrogat neoantigen ovalbumin. TCR transgene OT-I-mus, der over 90% av CD8 + T-cellene spesifikt gjenkjenner det OVA-avledede peptidet OVA257-264 (SIINFEKL) bundet til klassen I MHC-molekyl H2-Kb, muliggjør studiet av antigenspesifikke T-celleresponser utviklet i B16F10-OVA tumormodellen. Ved å kombinere denne modellen med tumortransplantasjon ble immunresponsene til tumor-iboende og periferi-stammer antigenspesifikke CD8+ T-celler sammenlignet med å avsløre en dynamisk overgang mellom disse to populasjonene. Samlet har denne eksperimentelle designen gitt en annen tilnærming for å nøyaktig undersøke immunresponsene til CD8 + T-celler i TME, som kaster nytt lys over dynamikken i tumorspesifikke T-celleimmuneresponser i TME.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL tuberculin syringe</td>
			<td>KDL</td>
			<td>BB000925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tube</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG2211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 U insulin syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>320310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>BEAVER</td>
			<td>43008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T48402-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methyl-2-butanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>240486-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m nylon cell strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD45.1</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>110714</td>
			<td>Clone:A20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16F10-OVA cell line</td>
			<td>bluefbio</td>
			<td>BFN607200447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-V (bovine serum albumin)</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>bs-0292P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 Mouse Anti-Mouse CD45.2</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>562895</td>
			<td>Clone:104</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture dish</td>
			<td>BEAVER</td>
			<td>43701/43702/43703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R-A462/5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyclophosphamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0768-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>19853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>EDS-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACSCanto II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>PorLab Scientific</td>
			<td>HM330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>RWD life science</td>
			<td>R510-22-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KHCO3</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501195-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L10199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle carrier</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>F31034-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501569-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0099-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse TCR V&#945;2</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>127808</td>
			<td>Clone:B20.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep Glutamine (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100734</td>
			<td>Clone:53-6.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical forceps</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>F12005-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical scissors</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>S12003-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suture thread</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>F34004-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tumor transplantation for assessing the dynamics of tumor-infiltrating cd8+ t cells in mice

T cellemediert immunitet spiller en avgjørende rolle i immunresponser mot svulster, med cytotoksiske T-lymfocytter (CTLer) som spiller hovedrollen i å utrydde kreftceller. Opprinnelsen og etterfyllingen av tumorantigenspesifikke CD8+ T-celler i tumormikromiljøet (TME) forblir imidlertid uklare. Denne protokollen bruker cellelinjen B16F10-OVA melanom, som stabilt uttrykker surrogat neoantigen, ovalbumin (OVA) og TCR transgene OT-I mus, der over 90% av CD8 + T-cellene spesifikt gjenkjenner det OVA-avledede peptidet OVA257-264 (SIINFEKL) bundet til klassen I store histokompatibilitetskompleks (MHC) molekyl H2-Kb. Disse funksjonene muliggjør studiet av antigenspesifikke T-celleresponser under tumorigenese.
Ved å kombinere denne modellen med tumortransplantasjonskirurgi ble tumorvev fra donorer transplantert til tumortilpassede syngeneiske mottakermus for å spore tilstrømningen av mottakeravledede immunceller til transplantert donorvev, slik at analysen av immunresponsene til tumor-iboende og periferi-stammer antigenspesifikk CD8+ T celler. Det ble funnet en dynamisk overgang mellom disse to populasjonene. Samlet har denne eksperimentelle designen gitt en annen tilnærming for å nøyaktig undersøke immunresponsene til CD8 + T-celler i TME, som vil kaste nytt lys over tumorimmunologi.

Skjemaet for denne protokollen vises i figur 1. Åtte dager etter tumorinokulering ble CD45.1+ og CD45.1+CD45.2+ OT-I celler injisert i B16F10-OVA tumorbærende C57BL/6 mus. Svulsten ble kirurgisk dissekert fra CD45.1+ OT-I celle-implanterte mus (donor) på dag 8 etter overføring og transplantert til tumor-matchet CD45.1 + CD45.2 + OT-I celle-implanterte mus (mottaker) i dorsal flanken på samme side som den implanterte svuls...

Watch this Scientific Journal Video about Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice at JoVE.com

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Her presenterer vi en tumortransplantasjonsprotokoll for karakterisering av tumor-iboende og periferi-avledede tumorinfiltrerte lymfocytter i en musesvulstmodell. Spesifikk sporing av tilstrømningen av mottakeravledede immunceller med strømningscytometri avslører dynamikken i fenotypiske og funksjonelle endringer i disse cellene under antitumor immunresponser.

Tumortransplantasjon for å vurdere dynamikken i tumorinfiltrerende CD8 + T-celler hos mus

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

Denne metoden kan bidra til å svare på de viktigste spørsmålene i tumorimmunologi, inkludert om det er en etterfylling av tumorspesifikke immunceller fra perifert vev, overgangene mellom nylig infiltrerte og allerede eksisterende immunceller innen tumormikromiljø, og deres respons på immunterapi. Dette er praktisk og lettfattelig teknikk for å skille de periferi-avledede cellene fra tumorinfiltrerte immunceller og spore de dynamiske, fenotypiske og funksjonelle endringene i disse cellene i langsgående analyser. Begynn med å trekke ut 100 mikroliter av den tilberedte B16F10-OVA cellefjæringen i en 1 ml tuberkulinsprøyte.Trykk på fatet for å flytte eventuelle bobler til toppen og skyv stempelet forsiktig for å fjerne luftbobler. Hold musen for å utsette magen. Trykk på venstre bakben med lillefingeren for å stramme huden på venstre inngangsregion.Fjern musens hår fra venstre underliv med en elektrisk barbermaskin. Bruk bomull gjennomvåt i 75% etanol for å rengjøre den bakre kvadranten i venstre mage. Hold sprøyten i en grunne vinkel mellom 0 og 15 grader, og sett den på siden av venstre øvre lår med nålen vendt oppover.Før nålen 0,5 til 1 centimeter gjennom det subkutane vevet inn i inngangsregionen. Trekk stempelet tilbake før injisering. Hvis det er negativt trykk, trykk stempelet helt ned og observere dannelsen av en liten væskelomme, eller en bolus, i subcutis.Fjern kanylen etter at injeksjonen er utført. Slipp og legg musen tilbake i buret. På dag seks til åtte etter B16F10-OVA implantasjon, måle svulststørrelsen med en vernier skala.Velg musene med en omtrent tre millimeter diameter eller en mung bønne-størrelse svulst, og del dem likt og tilfeldig i to grupper. Trekk ut 200 mikroliter OT-1 cellefjæring i en 100-enhet 29-gauge insulinsprøyte og fjern bobler. Plasser musen separat i et bur, med en infrarød lampe over buret i 5 til 10 minutter for å utvide halevenen.Immobiliser musen med en begrensende enhet av passende størrelse. Hold halen for å rette den og spray 75% etanol for å gjøre venen synlig. Hold sprøyten parallelt med venen og sett den inn i venen i en vinkel på 0 til 15 grader.Trekk stempelet litt tilbake, og hvis blodet kommer inn i fatet, injiser suspensjonen sakte og jevnt med en hastighet på ikke mer enn en milliliter per minutt. Når injeksjonen er fullført, fjerner du sprøyten og trykker forsiktig på injeksjonsområdet i tre til fem sekunder for å stoppe blødningen. Returner musen til buret og følg den nøye i noen minutter for bivirkninger.Hvis den har normal mobilitet og neseutslipp, plasser den tilbake i selskap med de andre musene. 8 til 10 dager etter adoptivoverføringen, velg donormus med sammenlignbar tumormasse på omtrent fem millimeter diameter for transplantasjonskirurgi. Legg en 100 millimeter x 20 milliliter tallerken i et biosikkerhetsskap og tilsett 10 milliliter steril, iskald PBS.Etter å ha euthanizing musen, senk den i 75% etanol i tre til fem minutter. Plasser musen i liggende stilling på et disseksjonskort dekket med rent absorberende papir i biosikkerhetsskapet. Hold muselemmene tilbake med disseksjonsnåler.Klipp huden langs midtlinjen ovenfra urinrørsåpningen til xiphoid med saks. Strekk huden mot venstre side av musekroppen med pinsett og hold huden tilbake med disseksjonsnåler. Slukn svulsten, og hold kapselen så intakt som mulig.Fjern forsiktig og forsiktig bindevevet nær svulsten med kirurgisk saks, og legg deretter tumorvevet i parabolen som inneholder steril, iskald PBS for etterfølgende transplantasjon. Bruk veterinær salve på øynene for å forhindre at de tørker. Barber venstre flanke av musen med en elektrisk barbermaskin, og påfør deretter en depilatorisk krem for å fjerne det gjenværende håret.Plasser musen inne i biosikkerhetsskapet i en utsatt posisjon på et disseksjonskort dekket med rent absorberende papir, med musens vertikale akse parallelt med og hodet til høyre side av eksperimentet. Gni huden på det barberte området med bomull gjennomvåt i povidon-jod. Løft huden midt mellom musens hofteledd med kirurgiske pinsett.Bruk saksen til å lage et fem millimeter langt vertikalt eksisjon og forlenge kuttet rostrally langs dorsal midtlinjen til rundt 10 til 15 millimeter. Utfør en skarp disseksjon ved å sette de lukkede spissene på saksen inn i snittet og deretter åpne for å skille bukhinnen på venstre flanke fra huden og bløtvevet. Utfør skarp disseksjon flere ganger for å generere en hudlomme på venstre flanke.Deponer den innkapslede, intakte, donoravledede tumormassen i lommen. Lukk snittet med en avbrutt sutur, ved hjelp av to eller tre masker for hvert snitt. Desinfiser huden rundt kuttet med bomull gjennomvåt i povidon-jod.Plasser musen i sidestilling i et rent og varmt bur. Overvåk den kontinuerlig til den har fått tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal heftelse. Administrer buprenorfin subkutant i en dose på 0,1 milligram per kilo kroppsvekt hver åttende time, i totalt tre doser.Returner transplantasjonsmottakeren til selskap med andre dyr først etter at den er fullstendig gjenopprettet. Ved hjelp av strømningscytometri ble to populasjoner av CD44-negative og CD8-positive tumorantigenspesifikke T-celler lett identifisert i tumormikromiljøet, inkludert CD45.1-positiv donor-avledet og CD45.1-negativ og CD45.2-positiv mottaker-avledet tumorinfiltrerende CD8-positive T-celler. På dag to etter transplantasjon var det omtrent 83% av donor-avledede antigenspesifikke CD8-positive T-celler i den transplanterte svulsten, mer dominerende enn deres mottakeravledede kolleger.Andelen mottakeravledede OT-1-celler ble forhøyet i sen fase av tumorigenesis, overgår tumor-iboende OT-1 celler avledet fra donoren. Det viktigste å huske er at å utføre en mild disseksjon under subkutan tumortransplantasjon for å unngå skader på omkringliggende vev, spesielt i granulær lymfeknute.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: Visualisering og Kvantifisering av genekspresjon og Tumor Invasivitet Bruke Genetic Mosaikk

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Avbildning av bosatt CD8 T-lymfocytter i menneskelig lunge svulst skiver bruker AC Confocal mikroskopi

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Betinget Knockdown av genuttrykk i kreftcelle linjer å studere rekruttering av monocytter/makrofager til Tumor Microenvironment

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Multiplekset Immunofluorescence analyse og måling av Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T celler

Immune cells are important components of the tumor microenvironment and influence tumor growth and evolution at all stages of carcinogenesis. Notably, it ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digital Polymerase kjedereaksjon analysen for den genetisk variasjonen i en sporadisk familiær adenomatøse polypose pasient i Chip-i-en-t-format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Sanntid påvisning av i Vitro svulst celle apoptose indusert av CD8+ T celler å studere immun undertrykkende funksjoner av svulst-infiltrere myeloide celler

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

The Clinical Application of Tumor Treating Fields Therapy in Glioblastoma

Klinisk anvendelse av svulst behandling av feltene terapi i glioblastom

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

I Vitro svulst celle Rechallenge For prediktiv evaluering av Chimeric Antigen reseptor T celle Antitumor funksjon

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Bruke Human indusert Pluripotent stamceller for generering av tumor antigen-spesifikke T celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generering av Orthotopic bukspyttkjertel svulster og ex vivo karakterisering av tumor-infiltrere T Cell cytotoksisitet

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...