Name: tumor transplantation for assessing the dynamics of tumor-infiltrating cd8+ t cells in mice
Uploaded: 2021-06-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice at JoVE.com

Bu çalışma, Seçkin Genç Akademisyenler için Ulusal Doğa Bilimleri Fonu (LY'ye No. 31825011) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (QH'ye No. 31900643, ZW'ye No. 31900656) hibelerle desteklenmiştir.

Tüm fare deneyleri, Üçüncü Askeri Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitelerinin yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi. 6-8 haftalık C57BL/6 fareleri ve 18-22 g ağırlığındaki naif OT-I transgenik fareleri kullanın. Hem erkek hem de dişi randomizasyon veya "körleştirme" olmadan kullanın.
1. Ortam ve reaktiflerin hazırlanması
<ol><li>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamına %10 fetal sığır serumu (FBS), 100 U/mL penisilin, 100 mg/mL streptomisi...

<ol>
	<li>Blank, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+'T+cell+exhaustion.">Defining 'T cell exhaustion.</a> Nature Reviews Immunology. 19 (11), 665-674 (2019).</li><li>Leko, V., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+and+targeting+human+tumor+antigens+for+T+cell-based+immunotherapy+of+solid+tumors.">Identifying and targeting human tumor antigens for T cell-based immunotherapy of solid tumors.</a> Cancer Cell. 38 (4), 454-472 (2020).</li><li>McLane, L. M., Abdel-Hakeem, M. S., Wherry, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+T+cell+exhaustion+during+chronic+viral+infection+and+cancer.">CD8 T cell exhaustion during chronic viral infection and cancer.</a> Annual Review of Immunology. 37, 457-495 (2019).</li><li>Davis, M. M., Brodin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rebooting+human+immunology.">Rebooting human immunology.</a> Annual Review of Immunology. 36, 843-864 (2018).</li><li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+immune+checkpoint+therapy.">The future of immune checkpoint therapy.</a> Science. 348 (6230), 56-61 (2015).</li><li>Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Releasing+the+brakes+on+cancer+immunotherapy.">Releasing the brakes on cancer immunotherapy.</a> Cell. 373 (16), 1490-1492 (2015).</li><li>Verma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1+blockade+in+subprimed+CD8+cells+induces+dysfunctional+PD-1(+)CD38(hi)+cells+and+anti-PD-1+resistance.">PD-1 blockade in subprimed CD8 cells induces dysfunctional PD-1(+)CD38(hi) cells and anti-PD-1 resistance.</a> Nature Immunology. 20, 1231-1243 (2019).</li><li>Hashimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+T+cell+exhaustion+in+chronic+infection+and+cancer:+opportunities+for+interventions.">CD8 T cell exhaustion in chronic infection and cancer: opportunities for interventions.</a> Annual Review of Medicine. 69, 301-318 (2018).</li><li>Dammeijer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+PD-1/PD-L1-checkpoint+restrains+T+cell+immunity+in+tumor-draining+lymph+nodes.">The PD-1/PD-L1-checkpoint restrains T cell immunity in tumor-draining lymph nodes.</a> Cancer Cell. 38 (5), 685-700 (2020).</li><li>Buchwald, Z. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-draining+lymph+node+is+important+for+a+robust+abscopal+effect+stimulated+by+radiotherapy.">Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 8 (2), 000867 (2020).</li><li>Philip, M., Schietinger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+and+fate+choice:+T+cell+exhaustion+in+cancer+and+chronic+infections.">Heterogeneity and fate choice: T cell exhaustion in cancer and chronic infections.</a> Current Opinion in Immunology. 58, 98-103 (2019).</li><li>Miller, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsets+of+exhausted+CD8(+)+T+cells+differentially+mediate+tumor+control+and+respond+to+checkpoint+blockade.">Subsets of exhausted CD8(+) T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade.</a> Nature Immunology. 20, 326-336 (2019).</li><li>Wu, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+T+cell+expansion+predicts+tumour+infiltration+and+clinical+response.">Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response.</a> Nature. 579, 274-278 (2020).</li><li>Im, S. J., Konieczny, B. T., Hudson, W. H., Masopust, D., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PD-1++stemlike+CD8+T+cells+are+resident+in+lymphoid+tissues+during+persistent+LCMV+infection.">PD-1+ stemlike CD8 T cells are resident in lymphoid tissues during persistent LCMV infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 117 (8), 4292-4299 (2020).</li><li>Beltra, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+relationships+of+four+exhausted+CD8(+)+T+cell+subsets+reveals+underlying+transcriptional+and+epigenetic+landscape+control+mechanisms.">Developmental relationships of four exhausted CD8(+) T cell subsets reveals underlying transcriptional and epigenetic landscape control mechanisms.</a> Immunity. 52 (5), 825-841 (2020).</li><li>Myers, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+subset+of+CD8(+)+T+cells+during+chronic+exhaustion+is+defined+by+SIRPalpha+expression.">A functional subset of CD8(+) T cells during chronic exhaustion is defined by SIRPalpha expression.</a> Nature Communications. 10 (1), 794 (2019).</li><li>Jansen, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intra-tumoral+niche+maintains+and+differentiates+stem-like+CD8+T+cells.">An intra-tumoral niche maintains and differentiates stem-like CD8 T cells.</a> Nature. 576, 465-470 (2019).</li><li>Jadhav, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+signature+of+PD-1++TCF1++CD8+T+cells+that+act+as+resource+cells+during+chronic+viral+infection+and+respond+to+PD-1+blockade.">Epigenetic signature of PD-1+ TCF1+ CD8 T cells that act as resource cells during chronic viral infection and respond to PD-1 blockade.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 116 (28), 14113-14118 (2019).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+CD8+T+cells+form+a+proliferative,+dynamically+regulated+compartment+within+human+melanoma.">Dysfunctional CD8 T cells form a proliferative, dynamically regulated compartment within human melanoma.</a> Cell. 176 (4), 775-789 (2018).</li><li>Kurtulus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Checkpoint+blockade+immunotherapy+induces+dynamic+changes+in+PD-1(-)CD8(+)+tumor-infiltrating+T+cells.">Checkpoint blockade immunotherapy induces dynamic changes in PD-1(-)CD8(+) tumor-infiltrating T cells.</a> Immunity. 50 (1), 181-194 (2019).</li><li>Fransen, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-draining+lymph+nodes+are+pivotal+in+PD-1/PD-L1+checkpoint+therapy.">Tumor-draining lymph nodes are pivotal in PD-1/PD-L1 checkpoint therapy.</a> JCI Insight. 3 (23), 124507 (2018).</li><li>E, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8(+)CXCR5(+)+T+cells+in+tumor-draining+lymph+nodes+are+highly+activated+and+predict+better+prognosis+in+colorectal+cancer.">CD8(+)CXCR5(+) T cells in tumor-draining lymph nodes are highly activated and predict better prognosis in colorectal cancer.</a> Human Immunology. 79 (6), 446-452 (2018).</li><li>Snell, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8(+)+T+cell+priming+in+established+chronic+viral+infection+preferentially+directs+differentiation+of+memory-like+cells+for+sustained+immunity.">CD8(+) T cell priming in established chronic viral infection preferentially directs differentiation of memory-like cells for sustained immunity.</a> Immunity. 49 (4), 678-694 (2018).</li><li>Siddiqui, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumoral+Tcf1(+)PD-1(+)CD8(+)+T+cells+with+stem-like+properties+promote+tumor+control+in+response+to+vaccination+and+checkpoint+blockade+immunotherapy.">Intratumoral Tcf1(+)PD-1(+)CD8(+) T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy.</a> Immunity. 50 (1), 195-211 (2019).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+TCF1+preserves+the+effector+function+of+exhausted+CD8+T+cells+during+chronic+viral+infection.">The transcription factor TCF1 preserves the effector function of exhausted CD8 T cells during chronic viral infection.</a> Frontiers in Immunology. 10, 169 (2019).</li><li>Krishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-like+CD8+T+cells+mediate+response+of+adoptive+cell+immunotherapy+against+human+cancer.">Stem-like CD8 T cells mediate response of adoptive cell immunotherapy against human cancer.</a> Science. 370 (6522), 1328-1334 (2020).</li><li>Yost, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+replacement+of+tumor-specific+T+cells+following+PD-1+blockade.">Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade.</a> Nature Medicine. 25, 1251-1259 (2019).</li><li>Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillere, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+in+oncoimmunology.">Mouse models in oncoimmunology.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bcl6+preserves+the+suppressive+function+of+regulatory+T+cells+during+tumorigenesis.">Bcl6 preserves the suppressive function of regulatory T cells during tumorigenesis.</a> Frontiers in Immunology. 11, 806 (2020).</li><li>Yu, D., Ye, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+portrait+of+CXCR5(+)+follicular+cytotoxic+CD8(+)+T+cells.">A portrait of CXCR5(+) follicular cytotoxic CD8(+) T cells.</a> Trends in Immunology. 39 (12), 965-979 (2018).</li><li>Bracci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophosphamide+enhances+the+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+immune+cells+through+the+induction+of+cytokine+expression,+B-cell+and+T-cell+homeostatic+proliferation,+and+specific+tumor+infiltration.">Cyclophosphamide enhances the antitumor efficacy of adoptively transferred immune cells through the induction of cytokine expression, B-cell and T-cell homeostatic proliferation, and specific tumor infiltration.</a> Clinical Cancer Research. 13 (2), 644-653 (2007).</li><li>Salem, M. L., El-Naggar, S. A., Mahmoud, H. A., Elgharabawy, R. M., Bader, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophosphamide+eradicates+murine+immunogenic+tumor+coding+for+a+non-self-antigen+and+induces+antitumor+immunity.">Cyclophosphamide eradicates murine immunogenic tumor coding for a non-self-antigen and induces antitumor immunity.</a> International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 32, 1-5 (2018).</li><li>Thorsson, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Immune+landscape+of+cancer.">The Immune landscape of cancer.</a> Immunity. 48 (4), 812-830 (2018).</li></ol>

T hücre aracılı bağışıklık, tümörlere karşı bağışıklık yanıtlarında çok önemli bir rol oynarken, CTL'ler kanserli hücrelerin yok edilmesinde öncü rol oynamaktadır. Bununla birlikte, TME içindeki tümör antijenine özgü CTL'lerin kökenleri aydınlatılamamıştır30. Bu tümör transplantasyon protokolünün kullanılması, kök benzeri TCF1 + progenitör CD8 + T hücrelerinin varlığına rağmen, intratümöral antijene özgü CD8 + T hücrelerin...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62442">Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+&#160;T Cells in Mice</a>. The Protocol&#160;was&#160;updated.
Step 6.10 of the Protocol was updated from:
Administer penicillin every 8-12 h after the surgery for 3 days. Monitor the mouse&#39;s eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered. 
NOTE: The administration of buprenorphine is suggested to prevent post-surgical pain [delete sentence]. The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
to:
Administer buprenorphine subcutaneously at a dose of 0.1 mg/kg body weight every 8 h three times after surgery to alleviate the pain. Monitor the mouse&#39;s eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered. 
NOTE: The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62442">Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+&#160;T Cells in Mice</a>. The Protocol&#160;was&#160;updated.

Erratum: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

CD8 + T hücre aracılı immün yanıt, tümör büyümesini kontrol etmede çok önemli bir rol oynar. Tümörigenez sırasında, naif CD8 + T hücreleri, MHC sınıf I kısıtlı bir şekilde antijen tanınması üzerine aktive olur ve daha sonra efektör hücrelere farklılaşır ve tümör kütlesi 1,2'ye sızar. Bununla birlikte, tümör mikroortamında (TME), uzun süreli antijen maruziyeti ve immünosüpresif faktörler, infiltre edilmiş tümöre özgü CD8 + T hücrelerini "tükenme" olarak bilinen hiporesponsive bir duruma yönlendirir3. Tükenmiş T hücreleri (Tex), akut viral enfeksiyonda hem transkripsiyonel hem de epigenetik olarak üretilen efektör veya hafıza T hücrelerinden farklıdır. Bu Tex hücreleri esas olarak bir dizi inhibitör reseptörün sürekli ve yüksek ekspresyonunun yanı sıra efektör fonksiyonlarının hiyerarşik kaybı ile karakterizedir. Ayrıca, tükenmiş CD8 + T hücrelerinin bozulmuş proliferatif kapasitesi, tümöre özgü T hücrelerinin sayısının azalmasına neden olur, böylece TME içindeki artık CD8 + T hücreleri, tümör progresyonuna karşı yeterli koruyucu bağışıklığı zar zor sağlayabilir3. Bu nedenle, intratümöral antijene özgü CD8 + T hücrelerinin bakımı veya güçlendirilmesi, tümör represyonu için vazgeçilmezdir.
Ayrıca, immün kontrol noktası blokajı (ICB) tedavisinin, T hücresi infiltrasyonunu artırarak tümörlerde Tex'i yeniden canlandırdığına ve dolayısıyla T hücre sayılarını ve tümör baskısını artırmak için T hücresi fonksiyonlarını gençleştirdiğine inanılmaktadır. ICB tedavisinin yaygın olarak uygulanması, kanser tedavisi manzarasını değiştirmiş ve hastaların önemli bir alt kümesi kalıcı yanıtlar yaşamıştır 4,5,6. Bununla birlikte, hastaların ve kanser türlerinin çoğunluğu ICB'ye yanıt vermez veya sadece geçici olarak yanıt vermez. TME'de yetersiz T hücre infiltrasyonunun ICB direncini oluşturan temel mekanizmalardan biri olduğu varsayılmıştır 7,8.
Birçok çalışma, tümör infiltrasyonu yapan CD8 + T hücrelerinin (TIL'ler) hem hastalarda hem de fare modellerinde heterojenliğini göstermiştir 9,10,11,12. Bir tümör kütlesinde T hücre faktörü-1'i (TCF1) eksprese eden CD8 + T hücrelerinin bir alt kümesinin, ölümcül tükenmiş T hücrelerine yol açabilecek kök hücre benzeri özellikler sergilediği ve ICB tedavisi 12,13,14,15,16,17,18,19,20 sonrası proliferasyon patlamasından sorumlu olduğu doğrulanmıştır. 21,22. Bununla birlikte, TME'de antijene özgü TCF1 + CD8 + T hücrelerinin sadece küçük bir kısmının bulunduğu ve ICB 23,24,25,26'ya yanıt olarak genişlemiş bir farklılaşmış soy havuzu oluşturduğu kanıtlanmıştır. Bu popülasyonun sınırlı büyüklüğünün, tümör progresyonunu kontrol etmek için sitotoksik T lenfositlerin (CTL'ler) kalıcılığını sağlamak için yeterli olup olmadığı bilinmemektedir ve çevre dokulardan yenilenme olup olmadığı daha fazla araştırma gerektirmektedir. Ayrıca, son araştırmalar, önceden var olan tümöre özgü T hücrelerinin yetersiz canlandırma kapasitesini ve anti-programlanmış hücre ölümü proteini 1 tedavisinden sonra yeni, daha önce var olmayan klonotiplerin ortaya çıktığını göstermektedir. Bu, kontrol noktası blokajına T hücresi yanıtının, T hücresi klonlarının farklı bir repertuarının yeni akışından kaynaklanabileceğini göstermektedir27. TME'de tümör reaktif olmayan sitotoksik T hücre fraksiyonunun varlığı ile birlikte, bu bulgular periferi kaynaklı CD8 + T hücrelerinin rolünü incelemek için bir tümör allogreft modelinin kurulmasını sağlamıştır11.
Şimdiye kadar, çeşitli tümör implantasyonlarının yanı sıra immün hücre evlat edinen transferi, tümör immünolojisi alanında yaygın olarak kullanılmaktadır28. TIL'ler, periferik kan mononükleer hücreleri ve diğer dokulardan kaynaklanan tümör-reaktif bağışıklık hücreleri bu yöntemler kullanılarak iyi karakterize edilebilir. Bununla birlikte, sistemik ve lokal antitümör bağışıklık arasındaki etkileşimleri incelerken, bu modeller periferiden ve TME'den türetilen bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri incelemek için yetersiz görünmektedir. Burada, tümör dokuları, alıcı kaynaklı bağışıklık hücrelerinin akışını kesin olarak izlemek ve TME'deki donör kaynaklı hücreleri eşzamanlı olarak gözlemlemek için donörlerden tümörle eşleşen alıcı farelere nakledildi.
Bu çalışmada, vekil neoantijen ovalbümini kararlı bir şekilde eksprese eden B16F10-OVA melanom hücre hattı ile murin sinjenik bir melanom modeli oluşturulmuştur. CD8 + T hücrelerinin% 90'ından fazlasının, sınıf I MHC molekülü H2-Kb'ye bağlı OVA türevi peptid OVA 257-264'ü (SIINFEKL) spesifik olarak tanıdığı TCR transgenik OT-I fareleri, B16F10-OVA tümör modelinde geliştirilen antijene özgü T hücresi yanıtlarının incelenmesini sağlar. Bu model tümör transplantasyonu ile birleştirildiğinde, tümöre özgü ve periferi kaynaklı antijen spesifik CD8 + T hücrelerinin immün yanıtları karşılaştırılarak bu iki popülasyon arasında dinamik bir geçiş ortaya çıkarıldı. Toplu olarak, bu deneysel tasarım, TME'deki CD8 + T hücrelerinin bağışıklık tepkilerini tam olarak araştırmak için başka bir yaklaşım sağlamıştır ve bu da TME'deki tümöre özgü T hücresi bağışıklık yanıtlarının dinamiklerine yeni bir ışık tutmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL tuberculin syringe</td>
			<td>KDL</td>
			<td>BB000925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tube</td>
			<td>KIRGEN</td>
			<td>KG2211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 U insulin syringe</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>320310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>BEAVER</td>
			<td>43008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T48402-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Methyl-2-butanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>240486-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m nylon cell strainer</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD45.1</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>110714</td>
			<td>Clone:A20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B16F10-OVA cell line</td>
			<td>bluefbio</td>
			<td>BFN607200447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA-V (bovine serum albumin)</td>
			<td>Bioss</td>
			<td>bs-0292P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 Mouse Anti-Mouse CD45.2</td>
			<td>BD Horizon</td>
			<td>562895</td>
			<td>Clone:104</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell culture dish</td>
			<td>BEAVER</td>
			<td>43701/43702/43703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R-A462/5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyclophosphamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0768-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>19853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>EDS-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACSCanto II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>PorLab Scientific</td>
			<td>HM330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>RWD life science</td>
			<td>R510-22-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KHCO3</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501195-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L10199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle carrier</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>F31034-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A501569-0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0099-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse TCR V&#945;2</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>127808</td>
			<td>Clone:B20.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep Glutamine (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100734</td>
			<td>Clone:53-6.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical forceps</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>F12005-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical scissors</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>S12003-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suture thread</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>F34004-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tumor transplantation for assessing the dynamics of tumor-infiltrating cd8+ t cells in mice

T hücresi aracılı bağışıklık, tümörlere karşı immün yanıtlarda çok önemli bir rol oynarken, sitotoksik T lenfositler (CTL'ler) kanserli hücrelerin eradikasyonunda öncü rol oynamaktadır. Bununla birlikte, tümör mikroçevresi (TME) içindeki tümör antijenine özgü CD8 + T hücrelerinin kökenleri ve yenilenmesi belirsizliğini korumaktadır. Bu protokol, vekil neoantijen, ovalbümin (OVA) ve TCR transgenik OT-I farelerini istikrarlı bir şekilde eksprese eden B16F10-OVA melanom hücre hattını kullanır; burada CD8 + T hücrelerinin% 90'ından fazlası, sınıf I majör histouyumluluk kompleksi (MHC) molekülü H2-Kb'ye bağlı OVA türevi peptid OVA 257-264'ü (SIINFEKL) spesifik olarak tanır. Bu özellikler, tümörigenez sırasında antijene özgü T hücre yanıtlarının incelenmesini sağlar.
Bu modeli tümör nakli cerrahisi ile birleştirerek, donörlerden gelen tümör dokuları, alıcı kaynaklı bağışıklık hücrelerinin nakledilen donör dokulara akışını kesin olarak izlemek için tümörle eşleşen sinjenik alıcı farelere nakledildi ve tümöre özgü ve periferi kaynaklı antijene özgü CD8 + 'nın bağışıklık yanıtlarının analizine izin verdi. T hücreleri. Bu iki popülasyon arasında dinamik bir geçişin gerçekleştiği bulunmuştur. Toplu olarak, bu deneysel tasarım, TME'deki CD8 + T hücrelerinin bağışıklık tepkilerini tam olarak araştırmak için başka bir yaklaşım sağlamıştır ve bu da tümör immünolojisine yeni bir ışık tutacaktır.

Bu protokolün şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Tümör aşılamasından sekiz gün sonra, CD45.1 + ve CD45.1 + CD45.2 + OT-I hücreleri, B16F10-OVA tümörü taşıyan C57BL / 6 farelere enjekte edildi. Tümör, transfer sonrası 8. günde CD45.1+ OT-I hücre implante edilmiş farelerden (donör) cerrahi olarak diseke edildi ve implante edilen tümörle aynı taraftaki dorsal kanatta tümörle eşleşen CD45.1 + CD45.2 +</sup...

Watch this Scientific Journal Video about Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice at JoVE.com

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

Burada, bir fare tümörü modelinde tümöre özgü ve periferi kaynaklı tümör kaynaklı lenfositlerin karakterizasyonu için bir tümör transplantasyon protokolü sunulmaktadır. Alıcı kaynaklı immün hücrelerin akışının akım sitometrisi ile spesifik olarak izlenmesi, antitümör immün yanıtlar sırasında bu hücrelerin fenotipik ve fonksiyonel değişikliklerinin dinamiklerini ortaya koymaktadır.

Farelerde Tümör Sızan CD8 + T Hücrelerinin Dinamiğini Değerlendirmek için Tümör Transplantasyonu

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

Bu yöntem, tümör immünolojisinde, periferik dokulardan tümöre özgü bağışıklık hücrelerinin yenilenmesi olup olmadığı, tümör mikroortamında yeni sızmış ve zaten var olan bağışıklık hücreleri arasındaki geçişler ve immünoterapiye verdikleri yanıtlar dahil olmak üzere kilit soruların cevaplanmasına yardımcı olabilir. Bu, periferi kaynaklı hücreleri tümör kaynaklı bağışıklık hücrelerinden ayırt etmek ve bu hücrelerin dinamik, fenotipik ve fonksiyonel değişikliklerini uzunlamasına tahlillerde izlemek için kullanışlı ve takip edilmesi kolay bir tekniktir. Hazırlanan B16F10-OVA hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini 1 mL'lik bir tüberkülin şırıngasına çekerek başlayın.Herhangi bir kabarcığı üste taşımak için namluya dokunun ve hava kabarcıklarını gidermek için pistonu yavaşça itin. Karnını açığa çıkarmak için fareyi kısıtlayın. Sol kasık bölgesinin derisini sıkılaştırmak için sol arka bacağına serçe parmağınızla bastırın.Farenin saçını sol alt karnından elektrikli tıraş makinesi ile çıkarın. Sol karın bölgesinin arka kadranını temizlemek için% 75 etanol içine batırılmış pamuk kullanın. Şırıngayı 0 ila 15 derece arasında sığ bir açıyla tutun ve iğnenin eğimi yukarı bakacak şekilde sol üst uyluğun yanına yerleştirin.İğneyi deri altı dokusundan kasık bölgesine 0,5 ila 1 santimetre ilerletin. Enjekte etmeden önce pistonu geri çekin. Negatif basınç varsa, pistonu tamamen bastırın ve subkutiste küçük bir sıvı cebinin veya bir bolusun oluşumunu gözlemleyin.Enjeksiyon yapıldıktan sonra iğneyi çıkarın. Fareyi serbest bırakın ve tekrar kafese yerleştirin. B16F10-OVA implantasyonundan sonraki altıncı ila sekizinci günde, tümör boyutunu vernier bir ölçekle ölçün.Yaklaşık üç milimetre çapında veya maş fasulyesi büyüklüğünde bir tümöre sahip fareleri seçin ve bunları eşit ve rastgele iki gruba bölün. 200 mikrolitre OT-1 hücre süspansiyonunu 100 üniteli 29 gauge insülin şırıngasına çekin ve kabarcıkları çıkarın. Kuyruk damarını genişletmek için fareyi ayrı ayrı bir kafese yerleştirin, kafesin üzerinde 5 ila 10 dakika boyunca kızılötesi bir lamba kullanın.Fareyi uygun boyutta bir kısıtlama cihazıyla hareketsiz hale getirin. Düzeltmek için kuyruğu tutun ve damarı görünür kılmak için% 75 etanol püskürtün. Şırıngayı damara paralel tutun ve damara 0 ila 15 derecelik bir açıyla yerleştirin.Pistonu hafifçe geri çekin ve namluya kan girerse, süspansiyonu dakikada bir mililitreden fazla olmayan bir hızda yavaşça ve sabit bir şekilde enjekte edin. Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, şırıngayı çıkarın ve kanamayı durdurmak için enjeksiyon bölgesine üç ila beş saniye boyunca hafifçe bastırın. Fareyi kafese geri döndürün ve olumsuz reaksiyonlar için birkaç dakika boyunca yakından gözlemleyin.Normal hareketliliğe ve burun akıntısına sahipse, diğer farelerin yanına geri yerleştirin. Evlat edinilen transferden 8 ila 10 gün sonra, transplantasyon cerrahisi için yaklaşık beş milimetre çapında karşılaştırılabilir tümör kütlesi taşıyan donör fareleri seçin. Bir biyogüvenlik dolabına 100 milimetre x 20 mililitrelik bir tabak yerleştirin ve 10 mililitre steril, buz gibi soğuk PBS ekleyin.Fareyi ötenazi yaptıktan sonra, üç ila beş dakika boyunca% 75 etanol içine batırın. Fareyi, biyogüvenlik kabinindeki temiz emici kağıtla kaplı bir diseksiyon panosu üzerine sırtüstü konuma getirin. Fare uzuvlarını diseksiyon iğneleriyle kısıtlayın.Cildi orta hat boyunca üretral deliğin üstünden makasla ksifoide doğru kesin. Cildi cımbızla fare gövdesinin sol tarafına doğru gerin ve cildi diseksiyon iğneleriyle kısıtlayın. Kapsülünü mümkün olduğunca sağlam tutarak tümörü tüketin.Tümörün yakınındaki bağ dokusunu cerrahi makasla dikkatlice ve nazikçe çıkarın, ardından tümör dokusunu sonraki nakil için steril, buz gibi soğuk PBS içeren kaba yerleştirin. Kurumasını önlemek için gözlerde veteriner merhem kullanın. Farenin sol kanadını elektrikli tıraş makinesiyle tıraş edin, ardından kalan saçları çıkarmak için tüy dökücü bir krem uygulayın.Fareyi biyogüvenlik kabininin içine, temiz emici kağıtla kaplı bir diseksiyon panosu üzerinde, farenin dikey ekseni paralel ve başı deneycinin sağ tarafına gelecek şekilde eğilimli bir konumda yerleştirin. Tıraş edilen bölgenin cildini povidon-iyota batırılmış pamukla ovalayın. Cerrahi cımbızla fare kalça eklemleri arasındaki orta noktada cildi kaldırın.Beş milimetre uzunluğunda dikey eksizyon yapmak için makası kullanın ve kesimi dorsal orta hat boyunca rostral olarak yaklaşık 10 ila 15 milimetreye kadar uzatın. Makasın kapalı uçlarını kesiye sokarak ve ardından sol kanadın peritonunu deriden ve yumuşak dokudan ayırmak için açarak keskin bir diseksiyon yapın. Sol kanatta bir cilt cebi oluşturmak için birkaç kez keskin diseksiyon yapın.Kapsüllenmiş, sağlam, donör kaynaklı tümör kütlesini cebe koyun. Her kesi için iki veya üç dikiş kullanarak kesilmiş bir dikişle insizyonu kapatın. Kesimin etrafındaki cildi povidon-iyota batırılmış pamukla dezenfekte edin.Fareyi yanal konuma temiz ve ılık bir kafese yerleştirin. Sternal yassılığı korumak için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar sürekli olarak izleyin. Buprenorfin'i deri altından, her sekiz saatte bir vücut ağırlığının kilogramı başına 0.1 miligramlık bir dozda, toplam üç doz boyunca uygulayın.Nakil alıcısını diğer hayvanların şirketine ancak tamamen iyileştikten sonra iade edin. Akım sitometrisi kullanılarak, CD45.1-pozitif donör kaynaklı ve CD45.1-negatif ve CD45.2-pozitif alıcı kaynaklı tümör infiltrasyonu CD8-pozitif T hücreleri dahil olmak üzere CD44-negatif ve CD8-pozitif tümör antijenine özgü T hücrelerinin iki popülasyonu tümör mikroortamında kolayca tanımlanmıştır. Transplantasyon sonrası ikinci günde, nakledilen tümör içinde donör kaynaklı antijen spesifik CD8-pozitif T hücrelerinin yaklaşık% 83'ü vardı ve alıcı kaynaklı meslektaşlarından daha baskındı.Alıcı kaynaklı OT-1 hücrelerinin oranı, tümörigenezin geç evresinde, donörden türetilen tümöre özgü OT-1 hücrelerini aşarak yükselmiştir. Hatırlanması gereken en önemli şey, deri altı tümör nakli sırasında, özellikle granüler lenf nodunda, çevre dokularda yaralanmaları önlemek için nazik bir diseksiyon yapılmasıdır.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

<em&gt; Drosophila</em&gt; Hayali Disk Tümör Modeli: Genetik Mozaikler kullanma Gen İfade ve Tümör invazivliğinin Görselleştirme ve

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

Ex Vivo İnsan akciğer tümörü içinde ikamet CD8 T lenfositlerin görüntüleme Confocal mikroskobu kullanma dilim

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Monosit/makrofajlar tümör Microenvironment için işe alım çalışmaya kanser hücre hatlarında gen ifadesinin koşullu nakavt

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells

Multiplexed ayirt analizi ve Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8 miktar+ T hücreleri

Immune cells are important components of the tumor microenvironment and influence tumor growth and evolution at all stages of carcinogenesis. Notably, it ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Dijital polimeraz zincir reaksiyonu tahlil için tüp içinde çip biçimini kullanarak bir sporadik ailesel Adenomatous poliposis hastada genetik varyasyon

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Gerçek zamanlı hafiye-in Vitro tümör hücre Apoptosis içinde CD8 tarafından indüklenen+ T hücreleri Myeloid hücrelerin tümör infiltre bağışıklık baskılayıcı işlevlerini çalışmaya

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

The Clinical Application of Tumor Treating Fields Therapy in Glioblastoma

Glioblastoma içinde alanları terapi tedavi tümör klinik uygulama

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% ...

In Vitro Tumor Cell Rechallenge For Predictive Evaluation of Chimeric Antigen Receptor T Cell Antitumor Function

Vitro tümör hücre Rechallenge içinde akıllı Chimeric antijen reseptör T hücre antitümör işlevi değerlendirilmesi için

The field of chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapy is rapidly advancing with improvements in CAR design, gene-engineering approaches and ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Tümör Antijene Özgü T Hücrelerinin Üretimi için İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Kullanılması

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Ortotopik Pankreas Tümörlerinin Üretimi ve Tümör Efiltrasyonu T Hücre Sitotoksisitesinin Ex vivo Karakterizasyonu

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...