Name: nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles
Uploaded: 2021-03-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة (ES030973-01A1، R01ES025225، R01DK066525، P30DK026687، P30DK063608). ونحن نعترف جيفري Bodycomb، دكتوراه من هوريبا الصكوك المدمجة لمساعدته في معايرة الصك.

وقد تم تنفيذ جميع الأعمال مع هذه العينات وفقا للجنة المؤسسية للعناية بالحيوانات واستخدامها والمبادئ التوجيهية لمجلس المراجعة المؤسسية. يتم تصوير نظرة عامة تخطيطية لطريقة NTA في الشكل 2.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62447/62447fig02.jpg"> <strong class...

<ol>
	<li>Colombo, M., Raposo, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+secretion,+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).</li><li>Hessvik, N. P., Llorente, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+knowledge+on+exosome+biogenesis+and+release.">Current knowledge on exosome biogenesis and release.</a> Cellular and molecular life sciences: CMLS. 75, 193-208 (2018).</li><li>Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+formation+during+reticulocyte+maturation.+Association+of+plasma+membrane+activities+with+released+vesicles+(exosomes).">Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes).</a> The Journal of Biological Chemistry. 262, 9412-9420 (1987).</li><li>Th&#233;ry, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses.">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).</li><li>Y&#225;&#241;ez-M&#243;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).</li><li>Lo Cicero, A., Stahl, A., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+shuffling+intercellular+messages:+for+good+or+for+bad.">Extracellular vesicles shuffling intercellular messages: for good or for bad.</a> Current Opinion in Cell Biology. 35, 69-77 (2015).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200, 373-383 (2013).</li><li>Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+extracellular+organelles+important+in+intercellular+communication.">Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication.</a> Journal of Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+and+technologies+for+exosome+isolation+and+characterization.">Methods and technologies for exosome isolation and characterization.</a> Small Methods. 2, 1800021 (2018).</li><li>Szatanek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+methods+of+choice+for+extracellular+vesicles+(EVs)+characterization.">The methods of choice for extracellular vesicles (EVs) characterization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).</li><li>Erdbr&#252;gger, U., Lannigan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+challenges+of+extracellular+vesicle+detection:+A+comparison+of+different+techniques.">Analytical challenges of extracellular vesicle detection: A comparison of different techniques.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 89, 123-134 (2016).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Extracellular+Vesicles:+General+Methodologies+and+Latest+Trends.">Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends.</a> BioMed Research International. 2018, 1-27 (2018).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li><li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Desd&#237;n-Mic&#243;, G., Mittelbrunn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+exosomes+in+the+protection+of+cellular+homeostasis.">Role of exosomes in the protection of cellular homeostasis.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 11, 127-134 (2017).</li><li>Kanemoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+body+formation+enhancement+and+exosome+release+during+endoplasmic+reticulum+stress.">Multivesicular body formation enhancement and exosome release during endoplasmic reticulum stress.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 480, 166-172 (2016).</li><li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+extract+induced+exosome+release+is+mediated+by+depletion+of+exofacial+thiols+and+can+be+inhibited+by+thiol-antioxidants.">Cigarette smoke extract induced exosome release is mediated by depletion of exofacial thiols and can be inhibited by thiol-antioxidants.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 108, 334-344 (2017).</li><li>Saeed-Zidane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+exosome+mediated+molecular+defense+mechanism+in+bovine+granulosa+cells+exposed+to+oxidative+stress.">Cellular and exosome mediated molecular defense mechanism in bovine granulosa cells exposed to oxidative stress.</a> PloS One. 12, 0187569 (2017).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stress-dependent+autophagy+component+release+via+extracellular+nanovesicles+in+tumor+cells.">Mechanical stress-dependent autophagy component release via extracellular nanovesicles in tumor cells.</a> ACS Nano. 13, 4589-4602 (2019).</li><li>King, H. W., Michael, M. Z., Gleadle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic+enhancement+of+exosome+release+by+breast+cancer+cells.">Hypoxic enhancement of exosome release by breast cancer cells.</a> BMC Cancer. 12, 421 (2012).</li><li>Bonzini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+particulate+matter+exposure+induces+extracellular+vesicle+release+in+overweight+subjects.">Short-term particulate matter exposure induces extracellular vesicle release in overweight subjects.</a> Environment Research. 155, 228-234 (2017).</li><li>Neri, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particulate+matter+induces+prothrombotic+microparticle+shedding+by+human+mononuclear+and+endothelial+cells.">Particulate matter induces prothrombotic microparticle shedding by human mononuclear and endothelial cells.</a> Toxicology In Vitro. 32, 333-338 (2016).</li><li>Flaherty, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lipase-independent+pathway+of+lipid+release+and+immune+modulation+by+adipocytes.">A lipase-independent pathway of lipid release and immune modulation by adipocytes.</a> Science. 363, 989-993 (2019).</li><li>van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles.">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 213-228 (2018).</li><li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7, 780-788 (2011).</li><li>Saveyn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+particle+size+distribution+determination+by+nanoparticle+tracking+analysis+based+on+2-D+Brownian+dynamics+simulation.">Accurate particle size distribution determination by nanoparticle tracking analysis based on 2-D Brownian dynamics simulation.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 352, 593-600 (2010).</li><li>Vander Meeren, P., Kasinos, M., Saveyn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+two-dimensional+Brownian+motion+dynamics+in+applying+nanoparticle+tracking+analysis.">Relevance of two-dimensional Brownian motion dynamics in applying nanoparticle tracking analysis.</a> Methods in Molecular Biology. , 525-534 (2012).</li><li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+evaluation+of+Nanoparticle+Tracking+Analysis+(NTA)+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates.">Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27, 796-810 (2010).</li><li>Bachurski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+measurements+with+nanoparticle+tracking+analysis+-+An+accuracy+and+repeatability+comparison+between+NanoSight+NS300+and+ZetaView.">Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1596016 (2019).</li><li>Varga, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hollow+organosilica+beads+as+reference+particles+for+optical+detection+of+extracellular+vesicles.">Hollow organosilica beads as reference particles for optical detection of extracellular vesicles.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16, 1646-1655 (2018).</li><li>Serrano-Pertierra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Current+analytical+techniques+for+detection+and+quantification.">Extracellular vesicles: Current analytical techniques for detection and quantification.</a> Biomolecules. 10, (2020).</li><li>Maguire, C. M., R&#246;sslein, M., Wick, P., Prina-Mello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+particles+in+solution+-+a+perspective+on+light+scattering+and+comparative+technologies.">Characterisation of particles in solution - a perspective on light scattering and comparative technologies.</a> Science and Technology of Advanced Materials. 19, 732-745 (2018).</li><li>Bohren, C. F., Huffman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , (1983).</li></ol>

هنا، ونحن نثبت بروتوكول لNTA من المركبات الكهربائية لقياس توزيع حجم مجموعة واسعة من أحجام الجسيمات في وقت واحد وقياس تركيز EV الكلي في عينة متعددة الأضلاع. في هذه الدراسة، استخدمت الأنسجة الدهنية بيريغودال الماوس والبلازما البشرية كمصدر للمركبات الكهربائية. ومع ذلك، يمكن أيضا استخدام المر...

الحويصلات خارج الخلية (EVs) صغيرة (0.03-2 ميكرومتر) الحويصلات المرتبطة بالغشاء التي تفرزها جميع أنواع الخلايا تقريبا1. وغالبا ما يشار إليها باسم "exosomes" ، "microvesicles" ، أو "الهيئات المبرمج" اعتمادا على آلية الإفراج عنها وحجم2. في حين كان يعتقد في البداية أن المركبات الكهربائية كانت مجرد وسيلة للقضاء على النفايات من الخلية للحفاظ على التوازن3، ونحن نعلم الآن أنها يمكن أن تشارك أيضا في الاتصالات بين الخلايا عن طريق نقل المواد الجزيئية -- بما في ذلك الحمض النووي ، الجيش الملكي النيبالي (ميرنا ، ميكرورنا) ، والدهون ، والبروتينات4،5 -- وأنها هي المنظمين المهمين لعلم وظائف الأعضاء الطبيعية ، فضلا عن العمليات المرضية1، 5،6،7،8.
هناك العديد من الطرق المختلفة لعزل وقياس المركبات الكهربائية، والتي تم وصفها في مكان آخر9،10،11،12. بروتوكول العزل المستخدمة وكذلك مصدر المركبات الكهربائية يمكن أن تؤثر بشكل كبير EV الغلة والنقاء. وحتى الطرد المركزي التفاضلي، الذي طالما اعتبر نهج "المعيار الذهبي" للعزلة الخارجية، يمكن أن يخضع لتباين كبير يؤثر في وقت لاحق على السكان EV التي تم الحصول عليها وتحليلات المصب13. وهكذا، فإن مختلف المنهجيات المختلفة لعزل EV وتحديد كمي تجعل من الصعب مقارنة واستنساخ وتفسير نتائج التجارب المبلغ عنها في الأدب14. وعلاوة على ذلك، يمكن تنظيم إطلاق EV من خلال الظروف الخلوية أو عوامل خارجية مختلفة. وقد اقترح أن المركبات الكهربائية تلعب دورا في الحفاظ على التوازن الخلوي من خلال حماية الخلايا ضد الإجهاد داخل الخلايا15, كما أظهرت العديد من الدراسات أن الإجهاد الخلوي يحفز إفراز EV. على سبيل المثال، تم الإبلاغ عن زيادة إطلاق EV بعد التعرض الخلوي لنقص الأكسيجة، والإجهاد الشبكي بطانة الرحم، والإجهاد التأكسدي، والإجهاد الميكانيكي، ومستخلص دخان السجائر، وتلوث الهواء الجسيمات16،17،18،19،20،21،22. كما تبين أن إطلاق EV قد تم تعديله في الجسم الحي؛ الفئران التي تعرضت لنظام غذائي عالي الدهون أو الصيام لمدة ستة عشر ساعة صدر أكثر المركبات EVsadipocyte 23. للتحقيق فيما إذا كان علاج أو حالة معينة يغير إطلاق EV، يجب تحديد عدد المركبات الكهربائية بدقة. تقييم توزيع حجم EV قد تشير أيضا إلى الأصل شبه الخلوي السائد من المركبات الكهربائية (على سبيل المثال، الانصهار من الأجسام الاندوسومات المتأخرة / متعددة المركبات مع غشاء البلازما مقابل الناشئة من غشاء البلازما)24. وبالتالي، هناك حاجة إلى أساليب قوية لقياس بدقة التركيز الكلي وتوزيع حجم الإعدادية EV التي تجري دراستها.
طريقة سريعة وحساسة للغاية لتصور وتوصيف المركبات الكهربائية في الحل هو تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA). وقد وصف شرح مفصل لمبادئ هذه الطريقة والمقارنة مع الطرق البديلة لتقييم حجم EV والتركيز سابقا25،26،27،28. باختصار، أثناء قياس NTA، يتم تصور المركبات الكهربائية بواسطة الضوء المتناثر عندما يتم تشعيعها بشعاع ليزر. يركز الضوء المتناثر بواسطة المجهر على الكاميرا التي تسجل حركة الجسيمات. يتتبع برنامج NTA الحركة الحرارية العشوائية لكل جسيم ، والمعروفة باسم الحركة البراونية ، لتحديد معامل الانتشار الذي يستخدم لحساب حجم كل جسيم باستخدام معادلة ستوكس آينشتاين. تم تطبيق NTA لأول مرة على قياس المركبات الكهربائية في عينة بيولوجية في عام 201125. حتى وقت قريب، كان هناك سوى شركتين التيار الرئيسي التي تقدم أدوات NTA التجارية29 حتى إدخال ViewSizer 3000 (يشار إليها فيما بعد باسم أداة تتبع الجسيمات) الذي يستخدم مزيجا من الأجهزة الجديدة وحلول البرمجيات للتغلب على قيود كبيرة من تقنيات NTA الأخرى.
تميز أداة تتبع الجسيمات الجسيمات النانوية في العينات السائلة من خلال تحليل حركتها البراونية وتميز جزيئات أكبر بحجم ميكرون من خلال تحليل استقرار الجاذبية. يسمح النظام البصري الفريد لهذا الجهاز، والذي يتضمن إضاءة متعددة الأطياف مع ثلاثة مصادر ضوء ليزر (عند 450 نانومتر و520 نانومتر و635 نانومتر)، للباحثين بتحليل مجموعة واسعة من أحجام الجسيمات (على سبيل المثال، إكسوسومات، ميكروفيسيكليس) في وقت واحد. يظهر تخطيطي لإعداد الأداة في الشكل 1.
هنا، ونحن نبين كيفية تنفيذ توزيع حجم الجسيمات وقياسات تركيز الماوس المعزولة والمركبات الكهربائية البشرية باستخدام أداة NTA جديدة.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62447/62447fig01.jpg"> الشكل 1: نظام بصري أداة تتبع الجسيمات. تضيء أداة NTA الجسيمات باستخدام ثلاثة أشعة ليزر ذات أطوال موجية تالية: 450 نانومتر، 520 نانومتر، 635 نانومتر. يتم الكشف عن تسجيل الفيديو للضوء المتناثر من الجسيمات الفردية وتتبعها بواسطة كاميرا فيديو رقمية موجهة 90 درجة من cuvette. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62447/62447fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X dPBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0119-1000</td>
			<td>To dilute samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 nm bead standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3100A</td>
			<td>To test ViewSizer 3000 calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 nm bead standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3400A</td>
			<td>To test ViewSizer 3000 calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>To filter PBS diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collection tubes, 2 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19201</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed air duster</td>
			<td>DustOff</td>
			<td>DPSJB-12</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette insert</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette jig</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>To align magnetic stir bar while placing inserts inside cuvette; Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>De-ionized water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0201-1000</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer with monitor, keyboard, mouse, and all necessary cables</td>
			<td>Dell</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70-100%)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>-</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoQuick ULTRA</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>EQULTRA-20A-1</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass scintillation vials with lids</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B780020</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#34;Hook&#34; tool</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-free microfiber cloth</td>
			<td>Texwipe</td>
			<td>TX629</td>
			<td>To clean cuvettes and cover work surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363344</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bar</td>
			<td>Sp Scienceware</td>
			<td>F37119-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suprasil Quartz cuvette with cap</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>AG1000-0544</td>
			<td>Initially provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViewSizer 3000</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Nanoparticle tracking instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles

أصبحت الأدوار الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية لل الحويصلات خارج الخلية (EVs) معترف بها بشكل متزايد ، مما يجعل مجال EV مجالا سريعا من مجالات البحث. هناك العديد من الطرق المختلفة لعزل EV ، ولكل منها مزايا وعيوب متميزة تؤثر على العائد النهائي ونقاء المركبات الكهربائية. وبالتالي، فإن توصيف الإعدادية EV معزولة عن مصدر معين من قبل طريقة مختارة مهم لتفسير نتائج المصب ومقارنة النتائج عبر المختبرات. توجد طرق مختلفة لتحديد حجم وكمية المركبات الكهربائية، والتي يمكن تغييرها من قبل حالات المرض أو استجابة للظروف الخارجية. تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) هي واحدة من التقنيات البارزة المستخدمة لتحليل الإنتاجية العالية للمركبات الكهربائية الفردية. هنا، نقدم بروتوكول مفصل للقياس الكمي وتحديد حجم المركبات الكهربائية المعزولة عن الأنسجة الدهنية perigonadal الماوس والبلازما البشرية باستخدام تكنولوجيا اختراق لNTA تمثل التقدم الكبير في هذا المجال. وتبين النتائج أن هذه الطريقة يمكن أن توفر تركيز الجسيمات الكلي القابل للاستنساخ والصالح وبيانات توزيع الحجم للمركبات الكهربائية المعزولة عن مصادر مختلفة باستخدام أساليب مختلفة، كما أكد ذلك المجهر الإلكتروني الإرسال. تكييف هذا الصك لNTA سوف تلبي الحاجة إلى توحيد في أساليب NTA لزيادة الدقة والتكرار في البحوث EV.

قبل هذا العرض التوضيحي، تم اختبار معايرة الجهاز لأول مرة لضمان صحة البيانات المكتسبة من خلال قياس توزيع حجم معايير حبة البوليسترين. اختبرنا حجم توزيع 100 نانومتر و 400 نانومتر الخرز باستخدام معلمات التسجيل الافتراضية وإعدادات المعالجة الموصى بها في هذا البروتوكول(الشكل 8).</p...

Watch this Scientific Journal Video about Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles at JoVE.com

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

نحن نبين كيفية استخدام أداة جديدة لتحليل تتبع الجسيمات النانوية لتقدير توزيع الحجم والتركيز الكلي للجسيمات الحويصلات خارج الخلية المعزولة عن الأنسجة الدهنية perigonadal الماوس والبلازما البشرية.

تحليل تتبع الجسيمات النانوية لتحديد كمي وحجم الحويصلات خارج الخلية

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

نتائج NTA عرضة جدا لتحيز المشغل. يوضح هذا البروتوكول تأثيرات معلمات NTA المعدلة على النتائج التي تم الحصول عليها. وهناك طريقة موحدة تساعد على زيادة الصرامة والتكرار في تحليل NTA.تحليل العينة في cuvette يسمح لعينة عشوائية إحصائيا ليتم التقاطها في كل فيديو. وهذا يؤدي إلى بيانات أكثر قابلية للاستنساخ وتصور الجسيمات على مدى مجموعة واسعة من الأحجام. كما الحصول على عينة في نطاق تركيز الجسيمات الموصى بها يمكن أن يكون صعبا، تأكد من إجراء تخفيف المسلسل لتحديد عامل التخفيف المثالي.إثبات الإجراء سيكون كونغهنغ كاي، طالب دكتوراه من مختبر أنتوني فيرانتي. لإعداد cuvette لتحليل تتبع الجسيمات النانوية ، قم بتغطية مساحة العمل بمادة خالية من الوبر لمنع الألياف من دخول cuvettes. ارتداء قفازات، ووضع cuvette تحتوي على شريط ضجة على الرقصة cuvette المغناطيسي.استخدام أداة هوك لوضع إدراج في cuvette مع درجة إدراج مرئية في الجزء الأمامي من cuvette. استخدام ماصة لإضافة ببطء 400 إلى 500 ميكرولتر من الحويصلات خارج الخلية المنقى على cuvette من خلال ثقب في إدراج وخلط العينة عن طريق الأنابيب بلطف دون إدخال فقاعات الهواء، ثم سقف cuvette، والتنصت على فقاعات حسب الضرورة واستخدام قطعة قماش خالية من الوبر لمسح السطح الخارجي للكوفيت. لتحليل تركيز الجسيمات من المعادن أو عينة، بدوره على محطة عمل الكمبيوتر وأداة وبدء برنامج تحليل تتبع الجسيمات.عند مطالبتك، انقر فوق NTA ثم افتح علامة التبويب التسجيل. اتبع الإرشادات التي تظهر على الشاشة لملء جميع المعلومات اللازمة للعينة. لتحليل تتبع EV، تعيين الذوبان إلى برنامج تلفزيوني.الملوحة سوف لصناعة السيارات في ملء إلى 9٪ للحصول على تركيز الجسيمات الذوبان أو عينة، وفتح غطاء الصك وإزالة غطاء واقية حيث سيتم وضع cuvette. تحميل cuvette في الصك في الاتجاه الصحيح مع درجة من إدراج تواجه الكاميرا واستبدال غطاء وغطاء الصك. انقر فوق سهم الدفق لتشغيل الكاميرا وانقر فوق سهم شيفرون لتوسيع إعدادات السجل.ضبط التركيز حتى الجسيمات الصغيرة نسبيا مرئية بوضوح. لتعيين التحليل لتحديد كم EV صغير، قم بتعيين معدل الإطار إلى 30 إطارا في الثانية، والتعرض ل 15 مللي ثانية، ووقت التقليب إلى خمس ثوان، ووقت الانتظار إلى ثلاث ثوان، وقوى الليزر الزرقاء والخضراء والحمراء إلى 210 و12 و8 ملليواط على التوالي، والإطارات لكل فيديو إلى 300، والمكاسب إلى 30 ديسيبل. ضبط التركيز حتى الجسيمات الصغيرة نسبيا مرئية بوضوح.زيادة التكبير و / أو الكسب يمكن أن تساعد مع تركيز الجسيمات. ولكن إذا قمت بزيادة المكاسب، تذكر لتعيينه إلى 30 ديسيبل قبل التسجيل. بمجرد تركيز الجسيمات، قم بتعيين إعداد التكبير/التصغير إلى 0.5X لحفظ عرض النطاق الترددي ومنع فقدان الإطارات والنقر فوق السجل لبدء تسجيل الفيديو.عندما تظهر مطالبة تفيد بأنه تم تسجيل مقاطع الفيديو، انقر فوق موافق لإكمال التسجيل وحدد علامة التبويب العملية. إذا كانت الجسيمات الكبيرة جدا مرئية في أي فيديو أثناء التسجيل ، فانتقل إلى دليل مقاطع الفيديو المسجلة وأزل أي فيديو إشكالي قبل المعالجة. تحقق من مربع تجاوز الكشف عن الصوت تعطيل وتعيين قطر الميزة إلى 30.انقر فوق عملية لبدء معالجة الفيديو وعرض رسم بياني للتوزيع المباشر. عند اكتمال المعالجة، انقر فوق موافق وحدد علامة التبويب رسم. بالنسبة إلى المركبات الكهربائية، اعرض المخطط الرئيسي كسجل بن سيليكا.يمكن تخصيص ميزات أخرى من الرسم البياني، مثل تغيير المحور س لتعيين منطقة لدمج الشكل المنتج. لإنشاء تقرير PDF للنتائج، انقر فوق الزر التقرير. سيتم عرض المتوسط والمتوسط وحجم الوضع والتركيز المعدل لعامل التخفيف وعرض التوزيع.يجب إجراء NTA من الذوبان قبل أي عينة بحيث يمكن طرح تركيز هذا الفراغ من تركيز الجسيمات عينة EV. لتنظيف cuvettes بعد التحليل، إفراغ cuvette وملء تماما cuvettes 10 إلى 15 مرات مع الماء deionized وثلاث مرات مع 70 إلى 100٪ الإيثانول لإزالة أي عينة المتبقية. جفف الجزء الخارجي من اللحاف بقطعة قماش خالية من الوبر وجفف الداخل بمغبرة هواء مضغوطة.لتنظيف الإدراجات وتقليب القضبان، ضع المواد في قارورة زجاج متألقة تحتوي على الإيثانول بنسبة 70 إلى 100٪، وهز القارورة بقوة. ثم شطف إدراج واثارة القضبان في الماء deionized مع اهتزاز كما هو موضح وتجفيفها باستخدام الملابس الخالية من الوبر. بعد التجفيف، ضع على الفور جميع المكونات النظيفة في التخزين حتى التحليل التالي.قبل إجراء تحليل، تم اختبار معايرة الأداة باستخدام حبات البوليسترين لضمان صحة البيانات المكتسبة. وكما لوحظ، أبلغت أداة تتبع الجسيمات بدقة عن حجم حبات المنوديسبيرز التي يبلغ عددها 100 نانومتر، ولكنها لم تبلغ إلا عن كثب عن حجم حبات النانومتر التي يبلغ عددها 400 حبة. لذلك، كانت إعدادات الجهاز لهذا البروتوكول أكثر دقة للجسيمات الصغيرة، أقرب إلى 100 نانومتر في الحجم.باستخدام هذه الإعدادات، ذكرت جداول تركيز الجسيمات وفقا لذلك مع عامل التخفيف مما يدل على أن الصك يمكن الكشف بدقة تركيز الجسيمات في تخفيفات مختلفة مع القليل من التباين بين replicants التقنية. تم تحديد التخفيف الأمثل لعينة EV المشتقة من أنسجة الماوس 4.41 مرة 10 إلى 10 لكل عينة EV المشتقة من أنسجة الماوس بالملليلتر بين 1 و 000 و 3000. في هذا التحليل، وزيادة كسب زيادة حساسية الكاميرا، مما يسمح بزيادة في التصور لعدد أكبر من الجسيمات الصغيرة.زيادة قوة الليزر الزرقاء من 70 إلى 210 ملليواط مع الحفاظ على قوى الليزر الخضراء والحمراء ثابتة حولت متوسط حجم الجسيمات المبلغ عنها من 122 إلى 105 نانومتر وزيادة تركيز الجسيمات الإجمالي المبلغ عنه من 1.1 مرة 10 إلى الثامن إلى 1.7 مرة 10 إلى الثامن. زيادة قوة الليزر الأحمر زيادة متوسط حجم الجسيمات المبلغ عنها من 175 إلى 246 نانومتر وانخفاض تركيز الجسيمات الإجمالي المبلغ عنها. أدت زيادة طاقة الليزر الخضراء إلى انخفاض في متوسط حجم الجسيمات المبلغ عنه وزيادة في تركيز الجسيمات الإجمالي المبلغ عنه.العثور على التخفيف الصحيح لوضع عينة ضمن نطاق الكشف الأمثل يمكن أن يستغرق بضع محاولات لكل عينة. تنظيف cuvette يتطلب أيضا التعامل معها بعناية إضافية. نوصي بتطبيق أكثر من طريقة متعامدة واحدة لقياس حجم الجسيمات EV وتركيزها.كما يمكن إجراء تشتت الضوء الديناميكي، واستشعار النبض المقاوم، والمجهر الإلكتروني الإرسالي، واستشعار التصوير الانعكاسي التداخلي أحادي الجسيمات لتوصيف المركبات الكهربائية.

Research

JoVE Journal

Biology

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

على أهمية تركيز البروتين الصحيح لحركية وتقارب في تحديد هيكل وظيفة التحليل

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

طريقة مبتكرة لExosome الكمي وقياس الحجم

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

A السريع والنوعي صفيحة ميكروسكوبية الفحص لتحديد أسكوربات البينية وخارج الخلية في الخلايا المستزرعة

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

تقنيات لتحليل خارج الخلية الحويصلات عن طريق التدفق الخلوي

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

تحليل سيتوميتريك من حويصلات خارج الخلية من خلية مكيفة وسائل الإعلام تدفق

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

تنقية وتحليل Caenorhabditis elegans خارج الخلية الحويصلات

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes

التصوير والتحليل الآليان لتحديد كمية الماكروبينوسومات الموسومة بالفلورسنت

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and ...

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

خارج الخلية Vesicle امتصاص المقايسة عبر تحليل التصوير المجهر Confocal

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular ...

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

المجهر المباشر لإعادة البناء البصري العشوائي للحوالق خارج الخلية في ثلاثة أبعاد

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

عزل وتنقية الحويصلات خارج الخلية من الإشريكية القولونية والبكتيريا الأخرى قابلة للتطوير

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...