Name: nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles
Uploaded: 2021-03-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (ES030973-01A1, R01ES025225, R01DK066525, P30DK026687, P30DK063608). Vi anerkender Jeffrey Bodycomb, Ph.D. af HORIBA Instruments Incorporated for hans hjælp kalibrere instrumentet.

Alt arbejde med disse prøver blev udført i overensstemmelse med Institutional Animal Care and Use Committee og Institutional Review Board retningslinjer. En skematisk oversigt over NTA-metoden er afbildet i figur 2.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62447/62447fig02.jpg"> Figur 2: Oversigt over NTA-metoden ved hjælp af partikelsporingsinstrumentet. Prøve...

<ol>
	<li>Colombo, M., Raposo, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+secretion,+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).</li><li>Hessvik, N. P., Llorente, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+knowledge+on+exosome+biogenesis+and+release.">Current knowledge on exosome biogenesis and release.</a> Cellular and molecular life sciences: CMLS. 75, 193-208 (2018).</li><li>Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+formation+during+reticulocyte+maturation.+Association+of+plasma+membrane+activities+with+released+vesicles+(exosomes).">Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes).</a> The Journal of Biological Chemistry. 262, 9412-9420 (1987).</li><li>Th&#233;ry, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses.">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).</li><li>Y&#225;&#241;ez-M&#243;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).</li><li>Lo Cicero, A., Stahl, A., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+shuffling+intercellular+messages:+for+good+or+for+bad.">Extracellular vesicles shuffling intercellular messages: for good or for bad.</a> Current Opinion in Cell Biology. 35, 69-77 (2015).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200, 373-383 (2013).</li><li>Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+extracellular+organelles+important+in+intercellular+communication.">Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication.</a> Journal of Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+and+technologies+for+exosome+isolation+and+characterization.">Methods and technologies for exosome isolation and characterization.</a> Small Methods. 2, 1800021 (2018).</li><li>Szatanek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+methods+of+choice+for+extracellular+vesicles+(EVs)+characterization.">The methods of choice for extracellular vesicles (EVs) characterization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).</li><li>Erdbr&#252;gger, U., Lannigan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+challenges+of+extracellular+vesicle+detection:+A+comparison+of+different+techniques.">Analytical challenges of extracellular vesicle detection: A comparison of different techniques.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 89, 123-134 (2016).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Extracellular+Vesicles:+General+Methodologies+and+Latest+Trends.">Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends.</a> BioMed Research International. 2018, 1-27 (2018).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li><li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Desd&#237;n-Mic&#243;, G., Mittelbrunn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+exosomes+in+the+protection+of+cellular+homeostasis.">Role of exosomes in the protection of cellular homeostasis.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 11, 127-134 (2017).</li><li>Kanemoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+body+formation+enhancement+and+exosome+release+during+endoplasmic+reticulum+stress.">Multivesicular body formation enhancement and exosome release during endoplasmic reticulum stress.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 480, 166-172 (2016).</li><li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+extract+induced+exosome+release+is+mediated+by+depletion+of+exofacial+thiols+and+can+be+inhibited+by+thiol-antioxidants.">Cigarette smoke extract induced exosome release is mediated by depletion of exofacial thiols and can be inhibited by thiol-antioxidants.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 108, 334-344 (2017).</li><li>Saeed-Zidane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+exosome+mediated+molecular+defense+mechanism+in+bovine+granulosa+cells+exposed+to+oxidative+stress.">Cellular and exosome mediated molecular defense mechanism in bovine granulosa cells exposed to oxidative stress.</a> PloS One. 12, 0187569 (2017).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stress-dependent+autophagy+component+release+via+extracellular+nanovesicles+in+tumor+cells.">Mechanical stress-dependent autophagy component release via extracellular nanovesicles in tumor cells.</a> ACS Nano. 13, 4589-4602 (2019).</li><li>King, H. W., Michael, M. Z., Gleadle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic+enhancement+of+exosome+release+by+breast+cancer+cells.">Hypoxic enhancement of exosome release by breast cancer cells.</a> BMC Cancer. 12, 421 (2012).</li><li>Bonzini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+particulate+matter+exposure+induces+extracellular+vesicle+release+in+overweight+subjects.">Short-term particulate matter exposure induces extracellular vesicle release in overweight subjects.</a> Environment Research. 155, 228-234 (2017).</li><li>Neri, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particulate+matter+induces+prothrombotic+microparticle+shedding+by+human+mononuclear+and+endothelial+cells.">Particulate matter induces prothrombotic microparticle shedding by human mononuclear and endothelial cells.</a> Toxicology In Vitro. 32, 333-338 (2016).</li><li>Flaherty, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lipase-independent+pathway+of+lipid+release+and+immune+modulation+by+adipocytes.">A lipase-independent pathway of lipid release and immune modulation by adipocytes.</a> Science. 363, 989-993 (2019).</li><li>van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles.">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 213-228 (2018).</li><li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7, 780-788 (2011).</li><li>Saveyn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+particle+size+distribution+determination+by+nanoparticle+tracking+analysis+based+on+2-D+Brownian+dynamics+simulation.">Accurate particle size distribution determination by nanoparticle tracking analysis based on 2-D Brownian dynamics simulation.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 352, 593-600 (2010).</li><li>Vander Meeren, P., Kasinos, M., Saveyn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+two-dimensional+Brownian+motion+dynamics+in+applying+nanoparticle+tracking+analysis.">Relevance of two-dimensional Brownian motion dynamics in applying nanoparticle tracking analysis.</a> Methods in Molecular Biology. , 525-534 (2012).</li><li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+evaluation+of+Nanoparticle+Tracking+Analysis+(NTA)+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates.">Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27, 796-810 (2010).</li><li>Bachurski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+measurements+with+nanoparticle+tracking+analysis+-+An+accuracy+and+repeatability+comparison+between+NanoSight+NS300+and+ZetaView.">Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1596016 (2019).</li><li>Varga, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hollow+organosilica+beads+as+reference+particles+for+optical+detection+of+extracellular+vesicles.">Hollow organosilica beads as reference particles for optical detection of extracellular vesicles.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16, 1646-1655 (2018).</li><li>Serrano-Pertierra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Current+analytical+techniques+for+detection+and+quantification.">Extracellular vesicles: Current analytical techniques for detection and quantification.</a> Biomolecules. 10, (2020).</li><li>Maguire, C. M., R&#246;sslein, M., Wick, P., Prina-Mello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+particles+in+solution+-+a+perspective+on+light+scattering+and+comparative+technologies.">Characterisation of particles in solution - a perspective on light scattering and comparative technologies.</a> Science and Technology of Advanced Materials. 19, 732-745 (2018).</li><li>Bohren, C. F., Huffman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , (1983).</li></ol>

Her demonstrerer vi en protokol for NTA af elbiler for at måle størrelsesfordelingen af en bred vifte af partikelstørrelser samtidigt og måle den samlede EV-koncentration i en polydispersprøve. I denne undersøgelse blev musemaigonadal fedtvæv og humant plasma brugt som kilde til elbiler. Men, Elbiler isoleret fra andre væv eller biologiske væsker såsom serum, urin, spyt, modermælk, fostervand, og celle kultur supernatant kan også anvendes til NTA. Målinger af polystyrenperlestandarder sikrede, at instrumente...

Ekstracellulære vesikler (elbiler) er små (0,03-2 μm) membranbundne vesikler, der udskilles af næsten alle celletyper1. De omtales ofte som "exosomer", "mikrovesicles" eller "apoptotiske kroppe" afhængigt af deres frigivelsesmekanisme og størrelse2. Mens det oprindeligt blev antaget, at elbiler simpelthen var et middel til at fjerne affald fra cellen for at opretholde homøostase3, ved vi nu, at de også kan deltage i intercellulær kommunikation via overførsel af molekylært materiale - herunder DNA, RNA (mRNA, microRNA), lipider og proteiner4,5 - og at de er vigtige regulatorer af normal fysiologi samt patologiske processer1, 5,6,7,8.
Der findes mange forskellige metoder til at isolere og kvantificere elbiler, som er beskrevet andetsteds9,10,11,12. Den anvendte isolationsprotokol samt kilden til elbiler kan i høj grad påvirke EV udbytte og renhed. Selv differentieret centrifugering, der længe har været betragtet som "guldstandardmetoden" for eksosome isolation, kan være genstand for betydelig variation, der efterfølgende påvirker den opnåede EV-population, og downstream-analyser13. Således gør de forskellige forskellige metoder til EV isolation og kvantificering det vanskeligt at sammenligne, reproducere og fortolke resultaterne af eksperimenter rapporteret i litteraturen14. Desuden kan EV-frigivelse reguleres af cellulære forhold eller forskellige eksterne faktorer. Det er blevet foreslået, at elbiler spiller en rolle i at opretholde cellulære homøostase ved at beskytte celler mod intracellulær stress15, som flere undersøgelser har vist, at cellulær stress stimulerer EV sekretion. For eksempel er øget EV-frigivelse blevet rapporteret efter cellulær eksponering for hypoxi, endoplasmisk reticulum stress, oxidativ stress, mekanisk stress, cigaretrøg ekstrakt, og partikler luftforurening16,17,18,19,20,21,22. Ev frigivelse har også vist sig at være ændret in vivo; mus, der er udsat for en kost med højt fedtindhold eller faste i seksten timer, frigav flere adipocyt-elbiler23. For at undersøge, om en bestemt behandling eller tilstand ændrer EV-frigivelsen, skal antallet af elbiler bestemmes nøjagtigt. Vurderingen af fordelingen af ev-størrelsen kan også indikere den fremherskende subcellulære oprindelse af elbiler (f.eks. fusion af sene endoomer/multivesikulære organer med plasmamembranen vs. spirende plasmamembran)24. Der er således behov for robuste metoder til nøjagtigt at måle den samlede koncentration og størrelsesfordelingen af den EV-forberedelse, der undersøges.
En hurtig og meget følsom metode til visualisering og karakterisering af elbiler i opløsning er nanopartikler tracking analyse (NTA). En detaljeret forklaring af principperne i denne metode og sammenligning med alternative metoder til vurdering af EV's størrelse og koncentration er tidligere blevet beskrevet25,26,27,28. Kort sagt, under NTA måling, elbiler visualiseres af lyset spredt, når de er bestrålet med en laserstråle. Det spredte lys er fokuseret af et mikroskop på et kamera, der registrerer partikelbevægelsen. NTA-softwaren sporer den tilfældige termiske bevægelse af hver partikel, kendt som Brownian motion, for at bestemme diffusionskoefficienten, der bruges til at beregne størrelsen af hver partikel ved hjælp af Stokes-Einstein-ligningen. NTA blev første gang anvendt til måling af elbiler i en biologisk prøve i 201125. Indtil for nylig var der kun to mainstream virksomheder, der tilbyder kommercielle NTA instrumenter29 indtil indførelsen af ViewSizer 3000 (i det følgende benævnt partikel tracking instrument), som bruger en kombination af nye hardware og softwareløsninger til at overvinde betydelige begrænsninger af andre NTA teknikker.
Partikelsporingsinstrumentet karakteriserer nanopartikler i flydende prøver ved at analysere deres Brownian bevægelse og karakteriserer større mikron-størrelse partikler ved at analysere gravitationel afregning. Dette instruments unikke optiske system, som omfatter multispektral belysning med tre laserlyskilder (ved 450 nm, 520 nm og 635 nm), gør det muligt for forskere at analysere en bred vifte af partikelstørrelser (f.eks. exosomer, mikrovesicles) samtidigt. Der vises et skema over instrumentopsætningen i figur 1.
Her demonstrerer vi, hvordan man udfører partikelstørrelsesfordeling og koncentrationsmålinger af isolerede mus og menneskelige elbiler ved hjælp af et nyt NTA-instrument.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62447/62447fig01.jpg"> Figur 1: Partikelsporingsinstrument optisk system. NTA-instrumentet belyser partikler ved hjælp af tre lasere med følgende bølgelængder: 450 nm, 520 nm, 635 nm. Videooptagelse af det spredte lys fra individuelle partikler registreres og spores af et digitalt videokamera orienteret 90° fra cuvette. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62447/62447fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X dPBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0119-1000</td>
			<td>To dilute samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 nm bead standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3100A</td>
			<td>To test ViewSizer 3000 calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 nm bead standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3400A</td>
			<td>To test ViewSizer 3000 calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>To filter PBS diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collection tubes, 2 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19201</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed air duster</td>
			<td>DustOff</td>
			<td>DPSJB-12</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette insert</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette jig</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>To align magnetic stir bar while placing inserts inside cuvette; Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>De-ionized water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0201-1000</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer with monitor, keyboard, mouse, and all necessary cables</td>
			<td>Dell</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70-100%)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>-</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoQuick ULTRA</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>EQULTRA-20A-1</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass scintillation vials with lids</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B780020</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#34;Hook&#34; tool</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-free microfiber cloth</td>
			<td>Texwipe</td>
			<td>TX629</td>
			<td>To clean cuvettes and cover work surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363344</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bar</td>
			<td>Sp Scienceware</td>
			<td>F37119-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suprasil Quartz cuvette with cap</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>AG1000-0544</td>
			<td>Initially provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViewSizer 3000</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Nanoparticle tracking instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles

De fysiologiske og patofysiologiske roller ekstracellulære vesikler (elbiler) er blevet mere og mere anerkendt, hvilket gør EV-feltet til et hurtigt udviklende forskningsområde. Der er mange forskellige metoder til EV isolation, hver med forskellige fordele og ulemper, der påvirker downstream udbytte og renhed af elbiler. Således er det vigtigt at karakterisere EV-prep isoleret fra en given kilde ved en valgt metode for fortolkning af downstream-resultater og sammenligning af resultater på tværs af laboratorier. Der findes forskellige metoder til bestemmelse af elbilers størrelse og mængde, som kan ændres af sygdomstilstande eller som reaktion på eksterne forhold. Nanopartikler tracking analyse (NTA) er en af de fremtrædende teknologier, der anvendes til high-throughput analyse af individuelle elbiler. Her præsenterer vi en detaljeret protokol til kvantificering og størrelsesbestemmelse af elbiler isoleret fra musesyigonadal fedtvæv og humant plasma ved hjælp af en banebrydende teknologi til NTA, der repræsenterer store fremskridt på området. Resultaterne viser, at denne metode kan levere reproducerbare og gyldige samlede partikelkoncentrations- og størrelsesfordelingsdata for elbiler isoleret fra forskellige kilder ved hjælp af forskellige metoder, som bekræftet af transmissionselektronmikroskopi. Tilpasningen af dette instrument til NTA vil tage fat på behovet for standardisering i NTA-metoder for at øge strengheden og reproducerbarheden i ev-forskning.

Før denne demonstration blev kalibreringen af instrumentet først testet for at sikre gyldigheden af de erhvervede data ved at måle størrelsesfordelingen af polystyrenperlestandarder. Vi testede størrelsesfordelingen af 100 nm og 400 nm perler ved hjælp af standardregistreringsparametrene og de behandlingsindstillinger, der anbefales i denne protokol (Figur 8).
For polystyrenperens standard på 100 nm blev der målt en koncentration på 4,205 x 107...

Watch this Scientific Journal Video about Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles at JoVE.com

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Vi demonstrerer, hvordan man bruger et nyt nanopartikler tracking analyseinstrument til at estimere størrelsesfordelingen og den samlede partikelkoncentration af ekstracellulære vesikler isoleret fra mus perigonadal fedtvæv og human plasma.

Nanopartikler Tracking Analyse for kvantificering og størrelse bestemmelse af ekstracellulære vesikler

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

NTA resultater er meget tilbøjelige til operatør bias. Denne protokol viser virkningerne af ændrede NTA-parametre på opnåede resultater. En standardiseret metode vil bidrage til at øge stringens og reproducerbarhed i NTA analyse.Analyse af prøven i en cuvette giver mulighed for en statistisk tilfældig prøve, der skal fanges i hver video. Dette resulterer i mere reproducerbare data og visualisering af partikler over en bred vifte af størrelser. Da det kan være svært at få en prøve i det anbefalede partikelkoncentrationsområde, skal du sørge for at udføre en seriel fortynding for at identificere den ideelle fortyndingsfaktor.Demonstrere proceduren vil være Kungheng Cai, en ph.d.-studerende fra Anthony Ferrante laboratorium. For at forberede cuvette til nanopartiklersporingsanalyse skal du dække arbejdsområdet med et fnugfrit materiale for at forhindre fibre i at komme ind i cuvetterne. Iført handsker, placere en cuvette indeholdende en rørestang på den magnetiske cuvette jig.Brug et krogværktøj til at placere indsatsen i cuvette med sættet synligt på forsiden af cuvette. Brug en pipette til langsomt at tilføje 400 til 500 mikroliter af rensede ekstracellulære vesikler på cuvette gennem hullet i indsatsen og bland prøven ved forsigtigt at pipettere uden at indføre luftbobler, derefter hætte cuvette, tappe bobler efter behov og bruge en fnugfri klud til at tørre den udvendige overflade af cuvette. Hvis du vil analysere partikelkoncentrationen af fortyndings energi eller en prøve, skal du tænde for computerarbejdsstationen og instrumentet og starte partikelsporingsanalyseprogrammet.Når du bliver bedt om det, skal du klikke på NTA og åbne fanen Optagelse. Følg vejledningen på skærmen for at udfylde alle de nødvendige eksempeloplysninger. Ved EV-sporingsanalyse skal fortyndingslut indstilles til PBS.Saltholdigheden vil automatisk udfylde til 9%For at opnå fortyndings- eller prøvepartikelkoncentrationen skal instrumentlåget åbnes og fjernes beskyttelseshætten, hvor cuvette vil blive placeret. Læg cuvette ind i instrumentet i den korrekte retning med hakket af indsatsen mod kameraet og udskift hætten og instrumentlåget. Klik på streamingpilen for at aktivere kameraet, og klik på chevronpilen for at udvide postindstillingerne.Juster fokus, indtil de relativt små partikler er tydeligt synlige. For at indstille analysen for en lille EV kvantificering, indstille billedhastigheden til 30 billeder i sekundet, eksponeringen for 15 millisekunder, røre tid til fem sekunder, ventetiden til tre sekunder, den blå, grønne og røde laser beføjelser til 210, 12 og 8 milliwatt henholdsvis rammerne pr video til 300, og gevinsten til 30 decibel. Juster fokus, indtil de relativt små partikler er tydeligt synlige.Øget zoom og/eller gain kan hjælpe med partikelfokusering. Men hvis du øger gevinsten, skal du huske at indstille den til 30 decibel før optagelse. Når partiklerne er i fokus, skal du indstille zoomindstillingen til 0,5 X for at spare båndbredde og for at forhindre tabsrammer og klikke på optage for at begynde at optage videoen.Når der vises en prompt om, at videoerne er optaget, skal du klikke på OK for at fuldføre optagelsen og vælge procesfanen. Hvis meget store partikler var synlige i en video under optagelsen, skal du navigere til biblioteket med optagede videoer og fjerne enhver problematisk video før behandling. Markér feltet Deaktiver tilsidesættelse af lydregistrering, og angiv funktionsdiameteren til 30.Klik på processen for at starte videobehandling og få vist en live distributionsgraf. Når behandlingen er fuldført, skal du klikke på OK og vælge fanen Plot. I tv'er skal du vise hoveddiagrammet som log bin silica.Andre funktioner i grafen, f.eks. Hvis du vil oprette en PDF-rapport over resultaterne, skal du klikke på rapportknappen. Middel-, median-, tilstandsstørrelse og -koncentration justeret for fortyndingsfaktoren og fordelingsbredden vises.NTA af fortyndingsvandet skal udføres før en prøve, således at koncentrationen af dette blank kan trækkes fra EV-prøven partikelkoncentrationen. For at rengøre cuvettes efter analyse skal cuvette tømmes og fylde cuvettes helt 10 til 15 gange med deioniseret vand og de tre gange med 70 til 100% ethanol for at fjerne eventuelle resterende prøver. Tør ydersiden af cuvettes med en fnugfri mikrofiber klud og tør indersiden med en trykluftstøvler.For at rengøre skær og rørstænger skal materialerne placeres i et glasscintillationsglas, der indeholder 70 til 100% ethanol og ryste hætteglasset kraftigt. Skyl derefter indsatserne og rørstængerne i deioniseret vand med rystelser som demonstreret, og tør dem ved hjælp af fnugfri klude. Efter tørring skal du straks opbevare alle de rene komponenter indtil næste analyse.Før der blev foretaget en analyse, blev instrumentkalibreringen testet ved hjælp af polystyrenperler for at sikre gyldigheden af de erhvervede data. Som observeret rapporterede partikelsporingsinstrumentet nøjagtigt størrelsen af de 100 nanometer manodisperseperler, men rapporterede kun nøje størrelsen af de 400 nanometerperler. Derfor var instrumentindstillingerne for denne protokol mere nøjagtige for mindre partikler, tættere på 100 nanometer i størrelse.Ved hjælp af disse indstillinger skal rapporteres partikelkoncentrationer i overensstemmelse hermed med fortyndingsfaktoren, der viser, at instrumentet nøjagtigt kan detektere partikelkoncentrationen ved forskellige fortyndinger med ringe variation mellem tekniske replikanter. Den optimale fortynding for en 4,41 gange 10 til 10. partikler pr. milliliter musevævsudledt EV-prøve blev bestemt til at være mellem 1.000 og 3.000. I denne analyse øgede forøgelsen af forstærkningen kameraets følsomhed, hvilket gjorde det muligt at øge visualiseringen af et højere antal mindre partikler.Øge den blå laser magt fra 70 til 210 milliwatt samtidig holde den grønne og røde laser beføjelser konstant flyttet den rapporterede gennemsnitlige partikelstørrelse fra 122 til 105 nanometer og øget den rapporterede samlede partikelkoncentration fra 1,1 gange 10 til den ottende til 1,7 gange 10 til den ottende. Forøgelse af effekten af den røde laser øget den rapporterede gennemsnitlige partikelstørrelse fra 175 til 246 nanometer og faldt den rapporterede samlede partikelkoncentration. Forøgelse af den grønne laserkraft resulterede i et fald i den rapporterede gennemsnitlige partikelstørrelse og en stigning i den rapporterede samlede partikelkoncentration.At finde den rigtige fortynding til at placere en prøve inden for det optimale detektionsområde kan tage et par forsøg for hver prøve. Cuvetterengøring kræver også ekstra omhyggelig håndtering. Vi anbefaler, at der anvendes mere end én ortogonal metode til EV partikelstørrelse og koncentrationsmålinger.Dynamisk lysspredning, resistiv pulsmåling, transmissionselektronmikroskopi og interferometrisk reflektionsmåling af enkeltpartikler kan også udføres for at karakterisere elbiler.

Research

JoVE Journal

Biology

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

En innovativ metode til exosome Kvantificering og størrelse måling

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

En hurtig og konkret Microplate Assay til bestemmelse af intra-og ekstracellulære Ascorbat i dyrkede celler

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Teknikker til analyse af ekstracellulær Vesikler anvendelse af flowcytometri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow Cytometric analyse af ekstracellulære vesikler fra celle-aircondition medier

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Rensning og analyse af Caenorhabditis elegans Ekstracellulære Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes

Automatiseret billeddannelse og analyse til kvantificering af fluorescerende mærkede makropinosomer

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and ...

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Ekstracellulære vesikel Optagelse Assay via Confocal Microscope Imaging Analyse

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular ...

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

Direkte stokastisk optisk rekonstruktion Mikroskopi af ekstracellulære vesikler i tre dimensioner

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Skalerbar isolering og oprensning af ekstracellulære vesikler fra Escherichia coli og andre bakterier

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...