Name: nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles
Uploaded: 2021-03-28T14:00:00
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Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (ES030973-01A1, R01ES025225, R01DK066525, P30DK026687, P30DK063608). Nous reconnaissons Jeffrey Bodycomb, Ph.D. de HORIBA Instruments Incorporated pour son aide à calibrer l’instrument.

Tous les travaux avec ces échantillons ont été effectués conformément aux lignes directrices du Comité de soins et d’utilisation des animaux en établissement et du Comité d’examen de l’établissement. Une vue d’ensemble schématique de la méthode NTA est illustrée à la figure 2.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62447/62447fig02.jpg"> Figure 2: Vue...

<ol>
	<li>Colombo, M., Raposo, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+secretion,+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).</li><li>Hessvik, N. P., Llorente, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+knowledge+on+exosome+biogenesis+and+release.">Current knowledge on exosome biogenesis and release.</a> Cellular and molecular life sciences: CMLS. 75, 193-208 (2018).</li><li>Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+formation+during+reticulocyte+maturation.+Association+of+plasma+membrane+activities+with+released+vesicles+(exosomes).">Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes).</a> The Journal of Biological Chemistry. 262, 9412-9420 (1987).</li><li>Th&#233;ry, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses.">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).</li><li>Y&#225;&#241;ez-M&#243;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).</li><li>Lo Cicero, A., Stahl, A., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+shuffling+intercellular+messages:+for+good+or+for+bad.">Extracellular vesicles shuffling intercellular messages: for good or for bad.</a> Current Opinion in Cell Biology. 35, 69-77 (2015).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200, 373-383 (2013).</li><li>Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. 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Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 89, 123-134 (2016).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Extracellular+Vesicles:+General+Methodologies+and+Latest+Trends.">Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends.</a> BioMed Research International. 2018, 1-27 (2018).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li><li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Desd&#237;n-Mic&#243;, G., Mittelbrunn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+exosomes+in+the+protection+of+cellular+homeostasis.">Role of exosomes in the protection of cellular homeostasis.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 11, 127-134 (2017).</li><li>Kanemoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+body+formation+enhancement+and+exosome+release+during+endoplasmic+reticulum+stress.">Multivesicular body formation enhancement and exosome release during endoplasmic reticulum stress.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 480, 166-172 (2016).</li><li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+extract+induced+exosome+release+is+mediated+by+depletion+of+exofacial+thiols+and+can+be+inhibited+by+thiol-antioxidants.">Cigarette smoke extract induced exosome release is mediated by depletion of exofacial thiols and can be inhibited by thiol-antioxidants.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 108, 334-344 (2017).</li><li>Saeed-Zidane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+exosome+mediated+molecular+defense+mechanism+in+bovine+granulosa+cells+exposed+to+oxidative+stress.">Cellular and exosome mediated molecular defense mechanism in bovine granulosa cells exposed to oxidative stress.</a> PloS One. 12, 0187569 (2017).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stress-dependent+autophagy+component+release+via+extracellular+nanovesicles+in+tumor+cells.">Mechanical stress-dependent autophagy component release via extracellular nanovesicles in tumor cells.</a> ACS Nano. 13, 4589-4602 (2019).</li><li>King, H. W., Michael, M. Z., Gleadle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic+enhancement+of+exosome+release+by+breast+cancer+cells.">Hypoxic enhancement of exosome release by breast cancer cells.</a> BMC Cancer. 12, 421 (2012).</li><li>Bonzini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+particulate+matter+exposure+induces+extracellular+vesicle+release+in+overweight+subjects.">Short-term particulate matter exposure induces extracellular vesicle release in overweight subjects.</a> Environment Research. 155, 228-234 (2017).</li><li>Neri, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particulate+matter+induces+prothrombotic+microparticle+shedding+by+human+mononuclear+and+endothelial+cells.">Particulate matter induces prothrombotic microparticle shedding by human mononuclear and endothelial cells.</a> Toxicology In Vitro. 32, 333-338 (2016).</li><li>Flaherty, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lipase-independent+pathway+of+lipid+release+and+immune+modulation+by+adipocytes.">A lipase-independent pathway of lipid release and immune modulation by adipocytes.</a> Science. 363, 989-993 (2019).</li><li>van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles.">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 213-228 (2018).</li><li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7, 780-788 (2011).</li><li>Saveyn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+particle+size+distribution+determination+by+nanoparticle+tracking+analysis+based+on+2-D+Brownian+dynamics+simulation.">Accurate particle size distribution determination by nanoparticle tracking analysis based on 2-D Brownian dynamics simulation.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 352, 593-600 (2010).</li><li>Vander Meeren, P., Kasinos, M., Saveyn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+two-dimensional+Brownian+motion+dynamics+in+applying+nanoparticle+tracking+analysis.">Relevance of two-dimensional Brownian motion dynamics in applying nanoparticle tracking analysis.</a> Methods in Molecular Biology. , 525-534 (2012).</li><li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+evaluation+of+Nanoparticle+Tracking+Analysis+(NTA)+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates.">Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27, 796-810 (2010).</li><li>Bachurski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+measurements+with+nanoparticle+tracking+analysis+-+An+accuracy+and+repeatability+comparison+between+NanoSight+NS300+and+ZetaView.">Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1596016 (2019).</li><li>Varga, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hollow+organosilica+beads+as+reference+particles+for+optical+detection+of+extracellular+vesicles.">Hollow organosilica beads as reference particles for optical detection of extracellular vesicles.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16, 1646-1655 (2018).</li><li>Serrano-Pertierra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Current+analytical+techniques+for+detection+and+quantification.">Extracellular vesicles: Current analytical techniques for detection and quantification.</a> Biomolecules. 10, (2020).</li><li>Maguire, C. M., R&#246;sslein, M., Wick, P., Prina-Mello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+particles+in+solution+-+a+perspective+on+light+scattering+and+comparative+technologies.">Characterisation of particles in solution - a perspective on light scattering and comparative technologies.</a> Science and Technology of Advanced Materials. 19, 732-745 (2018).</li><li>Bohren, C. F., Huffman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , (1983).</li></ol>

Ici, nous démontrons un protocole pour la NTA des VE pour mesurer simultanément la distribution granulométrique d’une large gamme de tailles de particules et mesurer la concentration totale de VE dans un échantillon polydispersé. Dans cette étude, le tissu adipeux périgornadique de souris et le plasma humain ont été utilisés comme source de VE. Cependant, les VE isolés d’autres tissus ou liquides biologiques tels que le sérum, l’urine, la salive, le lait maternel, le liquide amniotique et le surnageant ...

Les vésicules extracellulaires (VE) sont de petites vésicules membranaires (0,03-2 μm) sécrétées par presque tous les types de cellules1. Ils sont souvent appelés « exosomes », « microvésicules » ou « corps apoptotiques » en fonction de leur mécanisme de libération et de leur taille2. Alors qu’on pensait au départ que les VE étaient simplement un moyen d’éliminer les déchets de la cellule pour maintenir l’homéostasie3,nous savons maintenant qu’ils peuvent également participer à la communication intercellulaire via le transfert de matériel moléculaire - y compris l’ADN, l’ARN (ARNm, microARN), les lipides et les protéines4,5 - et qu’ils sont d’importants régulateurs de la physiologie normale ainsi que des processus pathologiques1, 5,6,7,8.
Il existe de nombreuses méthodes différentes pour isoler et quantifier les VE, qui ont été décritesailleurs 9,10,11,12. Le protocole d’isolement utilisé ainsi que la source des véhicules électriques peuvent avoir un impact considérable sur le rendement et la pureté des véhicules électriques. Même la centrifugation différentielle, longtemps considérée comme l’approche « étalon-or » pour l’isolement des exosomes, peut être sujette à une variabilité substantielle ayant par la suite un impact sur la population de VE obtenue et les analyses en aval13. Ainsi, les différentes méthodologies d’isolement et de quantification des VE rendent difficile la comparaison, la reproduction et l’interprétation des résultats des expériences rapportées dans la littérature14. En outre, la libération de VE peut être régulée par des conditions cellulaires ou divers facteurs externes. Il a été suggéré que les VE jouent un rôle dans le maintien de l’homéostasie cellulaire en protégeant les cellules contre le stress intracellulaire15, car plusieurs études ont montré que le stress cellulaire stimule la sécrétion de VE. Parexemple, une augmentation de la libération de VE a été rapportée après une exposition cellulaire à l’hypoxie, au stress du réticulum endoplasmique, au stress oxydatif, au stress mécanique, à l’extrait de fumée de cigarette et à la pollution de l’air par les particules16,17,18,19, 20,21,22. Il a également été démontré que la libération de VE est modifiée in vivo; les souris soumises à un régime riche en graisses ou à un jeûne pendant seize heures ont libéré plus de VE adipocytaires23. Pour déterminer si un traitement ou une affection spécifique modifie la libération de VE, le nombre de VE doit être déterminé avec précision. L’évaluation de la distribution de la taille des VE peut également indiquer l’origine subcellulaire prédominante des VE (p. ex., fusion d’endosomes/corps multivésiculaires tardifs avec la membrane plasmique par rapport au bourgeonnement de la membrane plasmique)24. Il est donc nécessaire de mettre au point des méthodes robustes pour mesurer avec précision la concentration totale et la distribution granulométrique de la préparation ev étudiée.
Une méthode rapide et très sensible pour la visualisation et la caractérisation des véhicules électriques en solution est l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA). Une explication détaillée des principes de cette méthode et une comparaison avec d’autres méthodes d’évaluation de la taille et de la concentration des VE ont été décrites précédemment25,26,27,28. En bref, lors de la mesure NTA, les véhicules électriques sont visualisés par la lumière diffusée lorsqu’ils sont irradiés avec un faisceau laser. La lumière diffusée est focalée par un microscope sur une caméra qui enregistre le mouvement des particules. Le logiciel NTA suit le mouvement thermique aléatoire de chaque particule, connu sous le nom de mouvement brownien, pour déterminer le coefficient de diffusion qui est utilisé pour calculer la taille de chaque particule à l’aide de l’équation de Stokes-Einstein. La NTA a été appliquée pour la première fois à la mesure des VE dans un échantillon biologique en 201125. Jusqu’à récemment, il n’y avait que deux sociétés grand public offrant des instruments NTA commerciaux29 jusqu’à l’introduction du ViewSizer 3000 (ci-après dénommé l’instrument de suivi des particules) qui utilise une combinaison de nouvelles solutions matérielles et logicielles pour surmonter les limites importantes d’autres techniques NTA.
L’instrument de suivi des particules caractérise les nanoparticules dans les échantillons liquides en analysant leur mouvement brownien et caractérise les particules plus grosses de la taille d’un micron en analysant la décantation gravitationnelle. Le système optique unique de cet instrument, qui comprend un éclairage multispectral avec trois sources de lumière laser (à 450 nm, 520 nm et 635 nm), permet aux chercheurs d’analyser simultanément un large éventail de tailles de particules (par exemple, exosomes, microvésicules). Un schéma de la configuration de l’instrument est illustré à la figure 1.
Ici, nous montrons comment effectuer des mesures de distribution granulométrique et de concentration de véhicules électriques isolés de souris et d’humains à l’aide d’un nouvel instrument NTA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62447/62447fig01.jpg"> Figure 1: Système optique d’instrument de suivi des particules. L’instrument NTA éclaire les particules à l’aide de trois lasers avec les longueurs d’onde suivantes : 450 nm, 520 nm, 635 nm. L’enregistrement vidéo de la lumière diffusée à partir de particules individuelles est détecté et suivi par une caméra vidéo numérique orientée à 90 ° de la cuvette. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62447/62447fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X dPBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0119-1000</td>
			<td>To dilute samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 nm bead standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3100A</td>
			<td>To test ViewSizer 3000 calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 nm bead standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3400A</td>
			<td>To test ViewSizer 3000 calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>To filter PBS diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collection tubes, 2 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19201</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed air duster</td>
			<td>DustOff</td>
			<td>DPSJB-12</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette insert</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette jig</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>To align magnetic stir bar while placing inserts inside cuvette; Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>De-ionized water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0201-1000</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer with monitor, keyboard, mouse, and all necessary cables</td>
			<td>Dell</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70-100%)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>-</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoQuick ULTRA</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>EQULTRA-20A-1</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass scintillation vials with lids</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B780020</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#34;Hook&#34; tool</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-free microfiber cloth</td>
			<td>Texwipe</td>
			<td>TX629</td>
			<td>To clean cuvettes and cover work surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363344</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bar</td>
			<td>Sp Scienceware</td>
			<td>F37119-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suprasil Quartz cuvette with cap</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>AG1000-0544</td>
			<td>Initially provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViewSizer 3000</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Nanoparticle tracking instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles

Les rôles physiologiques et physiopathologiques des vésicules extracellulaires (VE) sont de plus en plus reconnus, faisant du domaine des VÉHICULES électriques un domaine de recherche en évolution rapide. Il existe de nombreuses méthodes différentes pour l’isolation des véhicules électriques, chacune présentant des avantages et des inconvénients distincts qui affectent le rendement en aval et la pureté des véhicules électriques. Ainsi, caractériser la préparation EV isolée d’une source donnée par une méthode choisie est importante pour l’interprétation des résultats en aval et la comparaison des résultats entre les laboratoires. Diverses méthodes existent pour déterminer la taille et la quantité de VE, qui peuvent être modifiées par des états pathologiques ou en réponse à des conditions externes. L’analyse de suivi des nanoparticules (NTA) est l’une des principales technologies utilisées pour l’analyse à haut débit des véhicules électriques individuels. Nous présentons ici un protocole détaillé pour la quantification et la détermination de la taille des VE isolés du tissu adipeux périgornadique de souris et du plasma humain à l’aide d’une technologie révolutionnaire pour la NTA représentant des avancées majeures dans le domaine. Les résultats démontrent que cette méthode peut fournir des données reproductibles et valides sur la concentration totale des particules et la distribution granulométrique pour les VE isolés de différentes sources à l’aide de différentes méthodes, comme le confirme la microscopie électronique à transmission. L’adaptation de cet instrument à la NTA permettra de répondre à la nécessité d’une normalisation des méthodes de la NTA afin d’accroître la rigueur et la reproductibilité dans la recherche sur les VE.

Avant cette démonstration, l’étalonnage de l’instrument a d’abord été testé pour s’assurer de la validité des données acquises en mesurant la distribution granulométrique des étalons de billes de polystyrène. Nous avons testé la distribution de taille des billes de 100 nm et 400 nm en utilisant les paramètres d’enregistrement par défaut et les paramètres de traitement recommandés dans ce protocole (Figure 8).
Pour l’étalon de billes de ...

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Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Nous montrons comment utiliser un nouvel instrument d’analyse de suivi des nanoparticules pour estimer la distribution de taille et la concentration totale de particules de vésicules extracellulaires isolées du tissu adipeux périgornadique de souris et du plasma humain.

Analyse de suivi des nanoparticules pour la quantification et la détermination de la taille des vésicules extracellulaires

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Les résultats de la NTA sont très sujets au biais de l’opérateur. Ce protocole démontre les effets de la modification des paramètres de l’ATN sur les résultats obtenus. Une méthode normalisée aidera à accroître la rigueur et la reproductibilité dans l’analyse NTA.L’analyse de l’échantillon dans une cuvette permet de capturer un échantillon statistiquement aléatoire dans chaque vidéo. Il en résulte des données plus reproductibles et la visualisation de particules sur une large gamme de tailles. Comme il peut être difficile d’obtenir un échantillon dans la plage de concentration de particules recommandée, assurez-vous d’effectuer une dilution en série pour identifier le facteur de dilution idéal.Kungheng Cai, un doctorant du laboratoire d’Anthony Ferrante, fera la démonstration de la procédure. Pour préparer la cuvette pour l’analyse de suivi des nanoparticules, couvrez l’espace de travail avec un matériau non pelucheux pour empêcher les fibres de pénétrer dans les cuvettes. En portant des gants, placez une cuvette contenant une barre de remuage sur le gabarit de cuvette magnétique.Utilisez un outil à crochet pour placer l’insert dans la cuvette avec l’encoche de l’insert visible à l’avant de la cuvette. Utilisez une pipette pour ajouter lentement 400 à 500 microlitres de vésicules extracellulaires purifiées sur la cuvette à travers le trou dans l’insert et mélangez l’échantillon en pipetant doucement sans introduire de bulles d’air, puis coiffez la cuvette, en tapotant des bulles si nécessaire et utilisez un chiffon non pelucheux pour essuyer la surface extérieure de la cuvette. Pour analyser la concentration de particules du diluant ou d’un échantillon, allumez le poste de travail et l’instrument informatiques et démarrez le programme d’analyse de suivi des particules.Lorsque vous y êtes invité, cliquez sur NTA et ouvrez l’onglet d’enregistrement. Suivez les instructions à l’écran pour remplir tous les exemples d’informations nécessaires. Pour l’analyse du suivi ev, réglez le diluant sur PBS.La salinité se remplira automatiquement à 9% Pour obtenir la concentration de diluant ou de particules de l’échantillon, ouvrez le couvercle de l’instrument et retirez le couvercle du capuchon de protection à l’endroit où la cuvette sera placée. Chargez la cuvette dans l’instrument dans la bonne orientation avec l’encoche de l’insert face à la caméra et remplacez le capuchon et le couvercle de l’instrument. Cliquez sur la flèche de diffusion en continu pour allumer l’appareil photo, puis cliquez sur la flèche en chevron pour développer les paramètres d’enregistrement.Ajustez la mise au point jusqu’à ce que les particules relativement petites soient clairement visibles. Pour définir l’analyse pour une petite quantification EV, réglez la fréquence d’images à 30 images par seconde, l’exposition à 15 millisecondes, le temps d’agitation à cinq secondes, le temps d’attente à trois secondes, les puissances laser bleues, vertes et rouges à 210, 12 et 8 milliwatts respectivement, les images par vidéo à 300 et le gain à 30 décibels. Ajustez la mise au point jusqu’à ce que les particules relativement petites soient clairement visibles.L’augmentation du zoom et/ou du gain peut aider à la mise au point des particules. Mais si vous augmentez le gain, n’oubliez pas de le régler à 30 décibels avant l’enregistrement. Une fois que les particules sont au point, réglez le paramètre de zoom sur 0,5X pour économiser de la bande passante et éviter la perte d’images et cliquez sur Enregistrer pour commencer à enregistrer la vidéo.Lorsqu’une invite s’affiche indiquant que les vidéos ont été enregistrées, cliquez sur OK pour terminer l’enregistrement et sélectionnez l’onglet processus. Si de très grosses particules étaient visibles dans une vidéo pendant l’enregistrement, accédez au répertoire des vidéos enregistrées et supprimez toute vidéo problématique avant le traitement. Cochez la case Désactiver le remplacement de la détection audio et définissez le diamètre de la fonction sur 30.Cliquez sur Processus pour lancer le traitement vidéo et afficher un graphique de distribution en direct. Une fois le traitement terminé, cliquez sur OK et sélectionnez l’onglet Tracé. Pour les véhicules électriques, affichez le tableau principal sous forme de silice de bac à journaux.D’autres fonctionnalités du graphique, telles que la modification de l’axe des x pour définir la zone d’intégration de la figure produite, peuvent être personnalisées. Pour créer un rapport PDF des résultats, cliquez sur le bouton Rapport. La moyenne, la médiane, la taille du mode et la concentration ajustées en fonction du facteur de dilution et de la largeur de distribution seront affichées.La NTA du diluant doit être effectuée avant tout échantillon afin que la concentration de ce blanc puisse être soustraite de la concentration de particules de l’échantillon EV. Pour nettoyer les cuvettes après analyse, videz la cuvette et remplissez complètement les cuvettes 10 à 15 fois avec de l’eau désionisée et les trois fois avec 70 à 100% d’éthanol pour éliminer tout échantillon résiduel. Séchez l’extérieur des cuvettes avec un chiffon en microfibre non pelucheux et séchez l’intérieur avec un duster à air comprimé.Pour nettoyer les inserts et les barres d’agitation, placez les matériaux dans un flacon de scintillation en verre contenant de 70 à 100% d’éthanol et secouez vigoureusement le flacon. Rincez ensuite les inserts et remuez les barres dans de l’eau désionisée en les agitant comme démontré et séchez-les à l’aide de chiffons non pelucheux. Après séchage, placez immédiatement tous les composants propres dans le stockage jusqu’à la prochaine analyse.Avant d’effectuer une analyse, l’étalonnage de l’instrument a été testé à l’aide de billes de polystyrène pour s’assurer de la validité des données acquises. Comme observé, l’instrument de suivi des particules a rapporté avec précision la taille des perles de manodisperse de 100 nanomètres, mais n’a rapporté que de près la taille des perles de 400 nanomètres. Par conséquent, les réglages de l’instrument pour ce protocole étaient plus précis pour les particules plus petites, de taille plus proche de 100 nanomètres.À l’aide de ces paramètres, la concentration de particules rapportée s’échelonnes en conséquence, le facteur de dilution démontrant que l’instrument peut détecter avec précision la concentration de particules à diverses dilutions avec peu de variabilité entre les réplicants techniques. La dilution optimale pour un échantillon de TISSU DE SOURIS de 4,41 fois 10 à 10e par millilitre de tissu de souris a été déterminée entre 1 000 et 3 000. Dans cette analyse, l’augmentation du gain a augmenté la sensibilité de la caméra, permettant une augmentation de la visualisation d’un plus grand nombre de particules plus petites.L’augmentation de la puissance du laser bleu de 70 à 210 milliwatts tout en maintenant les puissances laser vertes et rouges constantes a déplacé la taille moyenne des particules signalée de 122 à 105 nanomètres et a augmenté la concentration totale de particules signalée de 1,1 fois 10 à la huitième à 1,7 fois 10 à la huitième. L’augmentation de la puissance du laser rouge a augmenté la taille moyenne des particules signalée de 175 à 246 nanomètres et a diminué la concentration totale de particules signalée. L’augmentation de la puissance du laser vert a entraîné une diminution de la taille moyenne des particules signalée et une augmentation de la concentration totale de particules signalée.Trouver la bonne dilution pour placer un échantillon dans la plage de détection optimale peut prendre quelques essais pour chaque échantillon. Le nettoyage de la cuvette nécessite également une manipulation très prudente. Nous recommandons d’appliquer plus d’une méthode orthogonale pour les mesures de la taille et de la concentration des particules EV.La diffusion dynamique de la lumière, la détection d’impulsions résistives, la microscopie électronique à transmission et la détection par imagerie par réflectance interférométrique à particule unique peuvent également être effectuées pour caractériser les VE.

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Isolement et purification évolutifs de vésicules extracellulaires à partir d’Escherichia coli et d’autres bactéries

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