Name: nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles
Uploaded: 2021-03-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (ES030973-01A1, R01ES025225, R01DK066525, P30DK026687, P30DK063608) unterstützt. Wir danken Jeffrey Bodycomb, Ph.D. von HORIBA Instruments Incorporated für seine Hilfe bei der Kalibrierung des Instruments.

Alle Arbeiten mit diesen Proben wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee und des Institutional Review Board durchgeführt. Eine schematische Übersicht über die NTA-Methode ist in Abbildung 2dargestellt.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62447/62447fig02.jpg"> Abbildung 2: Überblick über die NTA-Methode mit dem...

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	<li>Colombo, M., Raposo, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+secretion,+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).</li><li>Hessvik, N. P., Llorente, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+knowledge+on+exosome+biogenesis+and+release.">Current knowledge on exosome biogenesis and release.</a> Cellular and molecular life sciences: CMLS. 75, 193-208 (2018).</li><li>Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. 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D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Desd&#237;n-Mic&#243;, G., Mittelbrunn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+exosomes+in+the+protection+of+cellular+homeostasis.">Role of exosomes in the protection of cellular homeostasis.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 11, 127-134 (2017).</li><li>Kanemoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+body+formation+enhancement+and+exosome+release+during+endoplasmic+reticulum+stress.">Multivesicular body formation enhancement and exosome release during endoplasmic reticulum stress.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 480, 166-172 (2016).</li><li>Benedikter, B. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lipase-independent+pathway+of+lipid+release+and+immune+modulation+by+adipocytes.">A lipase-independent pathway of lipid release and immune modulation by adipocytes.</a> Science. 363, 989-993 (2019).</li><li>van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles.">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 213-228 (2018).</li><li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7, 780-788 (2011).</li><li>Saveyn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+particle+size+distribution+determination+by+nanoparticle+tracking+analysis+based+on+2-D+Brownian+dynamics+simulation.">Accurate particle size distribution determination by nanoparticle tracking analysis based on 2-D Brownian dynamics simulation.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 352, 593-600 (2010).</li><li>Vander Meeren, P., Kasinos, M., Saveyn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+two-dimensional+Brownian+motion+dynamics+in+applying+nanoparticle+tracking+analysis.">Relevance of two-dimensional Brownian motion dynamics in applying nanoparticle tracking analysis.</a> Methods in Molecular Biology. , 525-534 (2012).</li><li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+evaluation+of+Nanoparticle+Tracking+Analysis+(NTA)+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates.">Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27, 796-810 (2010).</li><li>Bachurski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+measurements+with+nanoparticle+tracking+analysis+-+An+accuracy+and+repeatability+comparison+between+NanoSight+NS300+and+ZetaView.">Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1596016 (2019).</li><li>Varga, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hollow+organosilica+beads+as+reference+particles+for+optical+detection+of+extracellular+vesicles.">Hollow organosilica beads as reference particles for optical detection of extracellular vesicles.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16, 1646-1655 (2018).</li><li>Serrano-Pertierra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Current+analytical+techniques+for+detection+and+quantification.">Extracellular vesicles: Current analytical techniques for detection and quantification.</a> Biomolecules. 10, (2020).</li><li>Maguire, C. M., R&#246;sslein, M., Wick, P., Prina-Mello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+particles+in+solution+-+a+perspective+on+light+scattering+and+comparative+technologies.">Characterisation of particles in solution - a perspective on light scattering and comparative technologies.</a> Science and Technology of Advanced Materials. 19, 732-745 (2018).</li><li>Bohren, C. F., Huffman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , (1983).</li></ol>

Hier demonstrieren wir ein Protokoll für NTA von Elektrofahrzeugen, um die Größenverteilung eines breiten Spektrums von Partikelgrößen gleichzeitig zu messen und die Gesamtkonzentration von Elektrofahrzeugen in einer polydispersen Probe zu messen. In dieser Studie wurden periguronadales Fettgewebe und menschliches Plasma der Maus als Quelle für EVs verwendet. EVs, die aus anderen Geweben oder biologischen Flüssigkeiten wie Serum, Urin, Speichel, Muttermilch, Fruchtwasser und Zellkulturüberstand isoliert wurden, k...

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind kleine (0,03-2 μm) membrangebundene Vesikel, die von fast allen Zelltypen abgesondert werden1. Sie werden oft als "Exosomen", "Mikrovesikel" oder "apoptotische Körper" bezeichnet, abhängig von ihrem Freisetzungsmechanismus und ihrer Größe2. Während man anfangs dachte, dass EVs nur ein Mittel sind, um Abfälle aus der Zelle zu entfernen, um die Homöostaseaufrechtzuerhalten 3,wissen wir jetzt, dass sie auch an der interzellulären Kommunikation durch Transfer von molekularem Material - einschließlich DNA, RNA (mRNA, microRNA), Lipiden und Proteinen4,5 - teilnehmen können und dass sie wichtige Regulatoren der normalen Physiologie sowie pathologischer Prozesse sind1. 5,6,7,8.
Es gibt viele verschiedene Methoden zur Isolierung und Quantifizierung von EVs, die an anderer Stelle beschrieben wurden9,10,11,12. Das verwendete Isolationsprotokoll sowie die Quelle von Elektrofahrzeugen können die EV-Ausbeute und -Reinheit stark beeinflussen. Selbst die differentielle Zentrifugation, die lange als "Goldstandard" -Ansatz für die Exosomenisolierung galt, kann einer erheblichen Variabilität unterliegen, die sich anschließend auf die erhaltene EV-Population und die nachgelagerten Analysen auswirkt13. Daher erschweren die verschiedenen Methoden zur Isolierung und Quantifizierung von Elektrofahrzeugen den Vergleich, die Reproduktion und die Interpretation der Ergebnisse von Experimenten, die in der Literaturberichtet wurden 14. Darüber hinaus kann die EV-Freisetzung durch zelluläre Bedingungen oder verschiedene externe Faktoren reguliert werden. Es wurde vorgeschlagen, dass EVs eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase spielen, indem sie Zellen vor intrazellulärem Stressschützen 15, da mehrere Studien gezeigt haben, dass zellulärer Stress die EV-Sekretion stimuliert. Zum Beispiel wurde eine erhöhte EV-Freisetzung nach zellulärer Exposition gegenüber Hypoxie, endoplasmatischem Retikulumstress, oxidativem Stress, mechanischem Stress, Zigarettenrauchextrakt und Feinstaubluftverschmutzung berichtet16,17,18,19,20,21,22. Es wurde auch gezeigt, dass die EV-Freisetzung in vivo modifiziert wurde; Mäuse, die sechzehn Stunden lang einer fettreichen Diät oder einem Fasten unterzogen wurden, setzten mehr Adipozyten-EVsfrei 23. Um zu untersuchen, ob eine bestimmte Behandlung oder bedingung die Ev-Freisetzung verändert, muss die Anzahl der EVs genau bestimmt werden. Die Beurteilung der EV-Größenverteilung kann auch auf den vorherrschenden subzellulären Ursprung von EVs hinweisen (z. B. Fusion von späten Endosomen / multivesikulären Körpern mit der Plasmamembran vs. Knospung der Plasmamembran)24. Daher besteht ein Bedarf an robusten Methoden, um die Gesamtkonzentration und die Größenverteilung des untersuchten EV-Preps genau zu messen.
Eine schnelle und hochempfindliche Methode zur Visualisierung und Charakterisierung von Elektrofahrzeugen in Lösung ist die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA). Eine detaillierte Erläuterung der Prinzipien dieser Methode und der Vergleich mit alternativen Methoden zur Beurteilung der EV-Größe und -Konzentration wurden zuvor beschrieben25,26,27,28. Kurz gesagt, während der NTA-Messung werden EVs durch das Licht visualisiert, das gestreut wird, wenn sie mit einem Laserstrahl bestrahlt werden. Das Streulicht wird von einem Mikroskop auf eine Kamera fokussiert, die die Partikelbewegung aufzeichnet. Die NTA-Software verfolgt die zufällige thermische Bewegung jedes Teilchens, bekannt als Brownsche Bewegung, um den Diffusionskoeffizienten zu bestimmen, der verwendet wird, um die Größe jedes Teilchens mit der Stokes-Einstein-Gleichung zu berechnen. NTA wurde erstmals 2011 zur Messung von Elektrofahrzeugen in einer biologischen Probe angewendet25. Bis vor kurzem gab es nur zwei Mainstream-Unternehmen, die kommerzielle NTA-Instrumente29 anboten, bis zur Einführung des ViewSizer 3000 (im Folgenden als Partikelverfolgungsinstrument bezeichnet), das eine Kombination aus neuartigen Hardware- und Softwarelösungen verwendet, um erhebliche Einschränkungen anderer NTA-Techniken zu überwinden.
Das Partikelverfolgungsinstrument charakterisiert Nanopartikel in flüssigen Proben durch Analyse ihrer Brownschen Bewegung und charakterisiert größere mikrometergroße Partikel durch Analyse der Gravitationsablagerung. Das einzigartige optische System dieses Instruments, das eine multispektrale Beleuchtung mit drei Laserlichtquellen (bei 450 nm, 520 nm und 635 nm) umfasst, ermöglicht es den Forschern, eine Vielzahl von Partikelgrößen (z. B. Exosomen, Mikrovesikel) gleichzeitig zu analysieren. Ein Schema des Geräteaufbaus ist in Abbildung 1 dargestellt.
Hier zeigen wir, wie man Partikelgrößenverteilungs- und Konzentrationsmessungen von isolierten Maus- und Human-EVs mit einem neuartigen NTA-Instrument durchführt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62447/62447fig01.jpg"> Abbildung 1:Optisches System des Partikelverfolgungsinstruments. Das NTA-Instrument beleuchtet Partikel mit drei Lasern mit folgenden Wellenlängen: 450 nm, 520 nm, 635 nm. Die Videoaufzeichnung des Streulichts einzelner Partikel wird von einer digitalen Videokamera, die 90° von der Küvette ausgerichtet ist, detektiert und verfolgt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62447/62447fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X dPBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0119-1000</td>
			<td>To dilute samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 nm bead standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3100A</td>
			<td>To test ViewSizer 3000 calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 nm bead standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3400A</td>
			<td>To test ViewSizer 3000 calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>To filter PBS diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collection tubes, 2 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19201</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed air duster</td>
			<td>DustOff</td>
			<td>DPSJB-12</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette insert</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette jig</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>To align magnetic stir bar while placing inserts inside cuvette; Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>De-ionized water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0201-1000</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer with monitor, keyboard, mouse, and all necessary cables</td>
			<td>Dell</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70-100%)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>-</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoQuick ULTRA</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>EQULTRA-20A-1</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass scintillation vials with lids</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B780020</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#34;Hook&#34; tool</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-free microfiber cloth</td>
			<td>Texwipe</td>
			<td>TX629</td>
			<td>To clean cuvettes and cover work surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363344</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bar</td>
			<td>Sp Scienceware</td>
			<td>F37119-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suprasil Quartz cuvette with cap</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>AG1000-0544</td>
			<td>Initially provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViewSizer 3000</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Nanoparticle tracking instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles

Die physiologischen und pathophysiologischen Rollen extrazellulärer Vesikel (EVs) werden zunehmend anerkannt, was das EV-Feld zu einem sich schnell entwickelnden Forschungsgebiet macht. Es gibt viele verschiedene Methoden zur Isolierung von Elektrofahrzeugen, die jeweils unterschiedliche Vor- und Nachteile haben, die sich auf die nachgelagerte Ausbeute und Reinheit von Elektrofahrzeugen auswirken. Daher ist die Charakterisierung der EV-Vorbereitung, die aus einer bestimmten Quelle durch eine gewählte Methode isoliert wurde, wichtig für die Interpretation der nachgelagerten Ergebnisse und den Vergleich der Ergebnisse zwischen Labors. Es gibt verschiedene Methoden zur Bestimmung der Größe und Menge von Elektrofahrzeugen, die durch Krankheitszustände oder als Reaktion auf äußere Bedingungen verändert werden können. Die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) ist eine der führenden Technologien für die Hochdurchsatzanalyse einzelner Elektrofahrzeuge. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Quantifizierung und Größenbestimmung von EVs, die aus periguronadalem Fettgewebe und menschlichem Plasma der Maus isoliert wurden, wobei eine bahnbrechende Technologie für NTA verwendet wurde, die große Fortschritte auf diesem Gebiet darstellt. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Methode reproduzierbare und valide Daten zur Gesamtpartikelkonzentration und -größenverteilung für EVs liefern kann, die mit verschiedenen Methoden aus verschiedenen Quellen isoliert wurden, wie durch die Transmissionselektronenmikroskopie bestätigt. Die Anpassung dieses Instruments an NTA wird die Notwendigkeit einer Standardisierung von NTA-Methoden adressieren, um die Strenge und Reproduzierbarkeit in der EV-Forschung zu erhöhen.

Vor dieser Demonstration wurde zunächst die Kalibrierung des Instruments getestet, um die Gültigkeit der erfassten Daten durch Messung der Größenverteilung von Polystyrolperlenstandards sicherzustellen. Wir haben die Größenverteilung von 100 nm und 400 nm Perlen mit den Standardaufzeichnungsparametern und den in diesem Protokoll empfohlenen Verarbeitungseinstellungen getestet (Abbildung 8).
Für den 100 nm Polystyrolperlenstandard wurde eine Konzentration vo...

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Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Wir zeigen, wie man ein neuartiges Nanopartikel-Tracking-Analyseinstrument verwendet, um die Größenverteilung und Gesamtpartikelkonzentration von extrazellulären Vesikeln abzuschätzen, die aus dem periigonadalen Fettgewebe der Maus und dem menschlichen Plasma isoliert wurden.

Nanopartikel-Tracking-Analyse zur Quantifizierung und Größenbestimmung extrazellulärer Vesikel

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

NTA-Ergebnisse sind sehr anfällig für Bedienerverzerrungen. Dieses Protokoll demonstriert die Auswirkungen veränderter NTA-Parameter auf die erzielten Ergebnisse. Eine standardisierte Methode wird dazu beitragen, die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der NTA-Analyse zu erhöhen.Durch die Analyse der Probe in einer Küvette kann in jedem Video eine statistisch zufällige Stichprobe erfasst werden. Dies führt zu reproduzierbareren Daten und der Visualisierung von Partikeln über einen breiten Größenbereich. Da es schwierig sein kann, eine Probe im empfohlenen Partikelkonzentrationsbereich zu erhalten, sollten Sie unbedingt eine serielle Verdünnung durchführen, um den idealen Verdünnungsfaktor zu identifizieren.Demonstriert wird das Verfahren von Kungheng Cai, einem Doktoranden aus anthony Ferrantes Labor. Um die Küvette für die Analyse der Nanopartikelverfolgung vorzubereiten, bedecken Sie den Arbeitsbereich mit einem fusselfreien Material, um zu verhindern, dass Fasern in die Küvetten gelangen. Legen Sie mit Handschuhen eine Küvette mit einem Rührstab auf die magnetische Küvettenvorrichtung.Verwenden Sie ein Hakenwerkzeug, um den Einsatz in die Küvette zu legen, wobei die Keiler des Einsatzes an der Vorderseite der Küvette sichtbar ist. Verwenden Sie eine Pipette, um langsam 400 bis 500 Mikroliter gereinigter extrazellulärer Vesikel durch das Loch im Einsatz auf die Küvette zu geben, und mischen Sie die Probe durch sanftes Pipettieren ohne Luftblasen, dann verschließen Sie die Küvette, klopfen Sie blasen nach Bedarf heraus und verwenden Sie ein fusselfreies Tuch, um die Außenfläche der Küvette abzuwischen. Um die Partikelkonzentration des Verdünnungss oder einer Probe zu analysieren, schalten Sie den Computerarbeitsplatz und das Instrument ein und starten Sie das Partikelverfolgungsanalyseprogramm.Wenn Sie dazu aufgefordert werden, klicken Sie auf NTA und öffnen Sie die Registerkarte Aufzeichnung. Folgen Sie den Anweisungen auf dem Bildschirm, um alle erforderlichen Beispielinformationen auszufüllen. Stellen Sie für die EV-Tracking-Analyse das Verdünnungssent auf PBS ein.Der Salzgehalt füllt sich automatisch auf 9%Um die Verdünnungs- oder Probenpartikelkonzentration zu erhalten, öffnen Sie den Instrumentendeckel und entfernen Sie die Schutzkappe, auf der die Küvette platziert wird. Laden Sie die Küvette in der richtigen Ausrichtung mit der Der Kamera zugewandten Einlegekung in das Instrument und ersetzen Sie die Kappe und den Instrumentendeckel. Klicken Sie auf den Streaming-Pfeil, um die Kamera einzuschalten, und klicken Sie auf den Chevron-Pfeil, um die Aufnahmeeinstellungen zu erweitern.Stellen Sie den Fokus ein, bis die relativ kleinen Partikel deutlich sichtbar sind. Um die Analyse für eine kleine EV-Quantifizierung einzustellen, stellen Sie die Bildrate auf 30 Bilder pro Sekunde, die Belichtung auf 15 Millisekunden, die Rührzeit auf fünf Sekunden, die Wartezeit auf drei Sekunden, die blauen, grünen und roten Laserleistungen auf 210, 12 bzw. 8 Milliwatt, die Bilder pro Video auf 300 und die Verstärkung auf 30 Dezibel ein. Stellen Sie den Fokus ein, bis die relativ kleinen Partikel deutlich sichtbar sind.Das Erhöhen des Zooms und/oder der Verstärkung kann bei der Partikelfokussierung helfen. Wenn Sie jedoch die Verstärkung erhöhen, denken Sie daran, sie vor der Aufnahme auf 30 Dezibel einzustellen. Sobald die Partikel im Fokus sind, stellen Sie die Zoomeinstellung auf 0,5X ein, um Bandbreite zu sparen und Den Verlust von Frames zu vermeiden, und klicken Sie auf Aufnahme, um mit der Aufnahme des Videos zu beginnen.Wenn eine Eingabeaufforderung angezeigt wird, dass die Videos aufgezeichnet wurden, klicken Sie auf OK, um die Aufzeichnung abzuschließen, und wählen Sie die Registerkarte Prozess aus. Wenn während der Aufnahme sehr große Partikel in einem Video sichtbar waren, navigieren Sie zum Verzeichnis der aufgenommenen Videos und entfernen Sie alle problematischen Videos vor der Verarbeitung. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Audioerkennung deaktivieren, und legen Sie den Funktionsdurchmesser auf 30 fest.Klicken Sie auf Prozess, um die Videoverarbeitung zu starten und ein Live-Verteilungsdiagramm anzuzeigen. Wenn die Verarbeitung abgeschlossen ist, klicken Sie auf OK und wählen Sie die Registerkarte Plot aus. Zeigen Sie bei Elektrofahrzeugen das Hauptdiagramm als Holzbehälter-Kieselsäure an.Andere Funktionen des Diagramms, wie z. B. das Ändern der x-Achse, um den Bereich für die Integration der erzeugten Figur festzulegen, können angepasst werden. Um einen PDF-Bericht der Ergebnisse zu erstellen, klicken Sie auf die Schaltfläche Bericht. Der Mittelwert, der Median, die Modusgröße und die Konzentration, die für den Verdünnungsfaktor und die Verteilungsbreite angepasst sind, werden angezeigt.Die NTA des Verdünnungsmittels sollte vor jeder Probe durchgeführt werden, damit die Konzentration dieses Rohlings von der Partikelkonzentration der EV-Probe subtrahiert werden kann. Um die Küvetten nach der Analyse zu reinigen, entleeren Sie die Küvette und füllen Sie die Küvetten 10 bis 15 Mal vollständig mit entionisiertem Wasser und dreimal mit 70 bis 100% Ethanol, um Restproben zu entfernen. Trocknen Sie die Außenseite der Küvetten mit einem fusselfreien Mikrofasertuch und trocknen Sie die Innenseite mit einem Druckluftstaubwedel.Um die Einsätze und Rührstäbe zu reinigen, legen Sie die Materialien in eine Glasszintillationsfläschchen mit 70 bis 100% Ethanol und schütteln Sie die Durchstechflasche kräftig. Dann spülen Sie die Einsätze und Rühren sie in entionisiertem Wasser mit Schütteln wie gezeigt und trocknen Sie sie mit fusselfreien Tüchern. Nach dem Trocknen sofort alle sauberen Komponenten bis zur nächsten Analyse einlagern.Vor der Durchführung einer Analyse wurde die Gerätekalibrierung mit Polystyrolperlen getestet, um die Gültigkeit der erfassten Daten sicherzustellen. Wie beobachtet, meldete das Partikelverfolgungsinstrument genau die Größe der 100-Nanometer-Schmelzperlen, aber nur die Größe der 400-Nanometer-Perlen. Daher waren die Geräteeinstellungen für dieses Protokoll für kleinere Partikel genauer, näher an 100 Nanometern in der Größe.Unter Verwendung dieser Einstellungen skaliert die gemeldete Partikelkonzentration entsprechend, wobei der Verdünnungsfaktor zeigt, dass das Gerät die Partikelkonzentration bei verschiedenen Verdünnungen mit geringer Variabilität zwischen technischen Replikanten genau detektieren kann. Die optimale Verdünnung für eine 4,41 mal 10 bis 10-fache Partikel pro Milliliter Mausgewebe-abgeleitete EV-Probe wurde zwischen 1.000 und 3.000 bestimmt. In dieser Analyse erhöhte die Erhöhung der Verstärkung die Empfindlichkeit der Kamera, was eine Erhöhung der Visualisierung einer höheren Anzahl kleinerer Partikel ermöglichte.Die Erhöhung der blauen Laserleistung von 70 auf 210 Milliwatt bei konstanter grüner und roter Laserleistung verschob die gemeldete durchschnittliche Partikelgröße von 122 auf 105 Nanometer und erhöhte die gemeldete Gesamtpartikelkonzentration von 1,1 mal 10 auf die achte auf 1,7 mal 10 auf die achte. Durch die Erhöhung der Leistung des roten Lasers erhöhte sich die gemeldete durchschnittliche Partikelgröße von 175 auf 246 Nanometer und verringerte die gemeldete Gesamtpartikelkonzentration. Die Erhöhung der grünen Laserleistung führte zu einer Abnahme der gemeldeten durchschnittlichen Partikelgröße und einer Erhöhung der gemeldeten Gesamtpartikelkonzentration.Die richtige Verdünnung zu finden, um eine Probe innerhalb des optimalen Nachweisbereichs zu platzieren, kann für jede Probe einige Versuche in Anspruch nehmen. Auch die Küvettenreinigung erfordert eine besonders sorgfältige Handhabung. Wir empfehlen, mehr als eine orthogonale Methode für EV-Partikelgrößen- und Konzentrationsmessungen anzuwenden.Dynamische Lichtstreuung, resistive Pulserfassung, Transmissionselektronenmikroskopie und interferometrische Reflexionsmessung mit einem Partikel können ebenfalls durchgeführt werden, um EVs zu charakterisieren.

Research

JoVE Journal

Biology

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

Die Bedeutung der richtigen Protein-Konzentration für Kinetik und Affinity Bestimmung in Struktur-Funktions-Analyse

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Forschung

Biologie

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Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

Eine schnelle und spezifische Mikroplatten-Assay zur Bestimmung der Intra-und extrazelluläre Ascorbat in kultivierten Zellen

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Techniken für die Analyse der extrazellulären Vesikeln mittels Durchflusszytometrie

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Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Fließen Sie durchflusszytometrischen Analyse der extrazellulären Vesikel aus Zelle konditioniertes Medien

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Reinigung und Analyse von Caenorhabditis elegans Extrazelluläre Vesikel

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes

Automatisierte Bildgebung und Analyse zur Quantifizierung fluoreszenzmarkierter Makropinosomen

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and ...

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Extrazellulärer Vesikelaufnahme-Assay mittels konfokaler Mikroskop-Bildgebungsanalyse

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular ...

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

Direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie extrazellulärer Vesikel in drei Dimensionen

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Skalierbare Isolierung und Reinigung extrazellulärer Vesikel aus Escherichia coli und anderen Bakterien

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...