Name: nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles
Uploaded: 2021-03-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (ES030973-01A1, R01ES025225, R01DK066525, P30DK026687, P30DK063608). אנו מכירים את ג'פרי בודיקומב, Ph.D. של HORIBA מכשירים בע"מ על עזרתו בכיול המכשיר.

כל העבודה עם דגימות אלה בוצעה בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש והנחיות הוועדה לביקורת מוסדית. סקירה סכמטית של שיטת NTA מתוארת באיור 2.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62447/62447fig02.jpg"> איור 2: סקירה כללי?...

<ol>
	<li>Colombo, M., Raposo, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+secretion,+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).</li><li>Hessvik, N. P., Llorente, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+knowledge+on+exosome+biogenesis+and+release.">Current knowledge on exosome biogenesis and release.</a> Cellular and molecular life sciences: CMLS. 75, 193-208 (2018).</li><li>Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+formation+during+reticulocyte+maturation.+Association+of+plasma+membrane+activities+with+released+vesicles+(exosomes).">Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes).</a> The Journal of Biological Chemistry. 262, 9412-9420 (1987).</li><li>Th&#233;ry, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses.">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).</li><li>Y&#225;&#241;ez-M&#243;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).</li><li>Lo Cicero, A., Stahl, A., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+shuffling+intercellular+messages:+for+good+or+for+bad.">Extracellular vesicles shuffling intercellular messages: for good or for bad.</a> Current Opinion in Cell Biology. 35, 69-77 (2015).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200, 373-383 (2013).</li><li>Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+extracellular+organelles+important+in+intercellular+communication.">Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication.</a> Journal of Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+and+technologies+for+exosome+isolation+and+characterization.">Methods and technologies for exosome isolation and characterization.</a> Small Methods. 2, 1800021 (2018).</li><li>Szatanek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+methods+of+choice+for+extracellular+vesicles+(EVs)+characterization.">The methods of choice for extracellular vesicles (EVs) characterization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).</li><li>Erdbr&#252;gger, U., Lannigan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+challenges+of+extracellular+vesicle+detection:+A+comparison+of+different+techniques.">Analytical challenges of extracellular vesicle detection: A comparison of different techniques.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 89, 123-134 (2016).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Extracellular+Vesicles:+General+Methodologies+and+Latest+Trends.">Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends.</a> BioMed Research International. 2018, 1-27 (2018).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li><li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Desd&#237;n-Mic&#243;, G., Mittelbrunn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+exosomes+in+the+protection+of+cellular+homeostasis.">Role of exosomes in the protection of cellular homeostasis.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 11, 127-134 (2017).</li><li>Kanemoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+body+formation+enhancement+and+exosome+release+during+endoplasmic+reticulum+stress.">Multivesicular body formation enhancement and exosome release during endoplasmic reticulum stress.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 480, 166-172 (2016).</li><li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+extract+induced+exosome+release+is+mediated+by+depletion+of+exofacial+thiols+and+can+be+inhibited+by+thiol-antioxidants.">Cigarette smoke extract induced exosome release is mediated by depletion of exofacial thiols and can be inhibited by thiol-antioxidants.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 108, 334-344 (2017).</li><li>Saeed-Zidane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+exosome+mediated+molecular+defense+mechanism+in+bovine+granulosa+cells+exposed+to+oxidative+stress.">Cellular and exosome mediated molecular defense mechanism in bovine granulosa cells exposed to oxidative stress.</a> PloS One. 12, 0187569 (2017).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stress-dependent+autophagy+component+release+via+extracellular+nanovesicles+in+tumor+cells.">Mechanical stress-dependent autophagy component release via extracellular nanovesicles in tumor cells.</a> ACS Nano. 13, 4589-4602 (2019).</li><li>King, H. W., Michael, M. Z., Gleadle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic+enhancement+of+exosome+release+by+breast+cancer+cells.">Hypoxic enhancement of exosome release by breast cancer cells.</a> BMC Cancer. 12, 421 (2012).</li><li>Bonzini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+particulate+matter+exposure+induces+extracellular+vesicle+release+in+overweight+subjects.">Short-term particulate matter exposure induces extracellular vesicle release in overweight subjects.</a> Environment Research. 155, 228-234 (2017).</li><li>Neri, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particulate+matter+induces+prothrombotic+microparticle+shedding+by+human+mononuclear+and+endothelial+cells.">Particulate matter induces prothrombotic microparticle shedding by human mononuclear and endothelial cells.</a> Toxicology In Vitro. 32, 333-338 (2016).</li><li>Flaherty, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lipase-independent+pathway+of+lipid+release+and+immune+modulation+by+adipocytes.">A lipase-independent pathway of lipid release and immune modulation by adipocytes.</a> Science. 363, 989-993 (2019).</li><li>van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles.">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 213-228 (2018).</li><li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7, 780-788 (2011).</li><li>Saveyn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+particle+size+distribution+determination+by+nanoparticle+tracking+analysis+based+on+2-D+Brownian+dynamics+simulation.">Accurate particle size distribution determination by nanoparticle tracking analysis based on 2-D Brownian dynamics simulation.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 352, 593-600 (2010).</li><li>Vander Meeren, P., Kasinos, M., Saveyn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+two-dimensional+Brownian+motion+dynamics+in+applying+nanoparticle+tracking+analysis.">Relevance of two-dimensional Brownian motion dynamics in applying nanoparticle tracking analysis.</a> Methods in Molecular Biology. , 525-534 (2012).</li><li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+evaluation+of+Nanoparticle+Tracking+Analysis+(NTA)+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates.">Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27, 796-810 (2010).</li><li>Bachurski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+measurements+with+nanoparticle+tracking+analysis+-+An+accuracy+and+repeatability+comparison+between+NanoSight+NS300+and+ZetaView.">Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1596016 (2019).</li><li>Varga, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hollow+organosilica+beads+as+reference+particles+for+optical+detection+of+extracellular+vesicles.">Hollow organosilica beads as reference particles for optical detection of extracellular vesicles.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16, 1646-1655 (2018).</li><li>Serrano-Pertierra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Current+analytical+techniques+for+detection+and+quantification.">Extracellular vesicles: Current analytical techniques for detection and quantification.</a> Biomolecules. 10, (2020).</li><li>Maguire, C. M., R&#246;sslein, M., Wick, P., Prina-Mello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+particles+in+solution+-+a+perspective+on+light+scattering+and+comparative+technologies.">Characterisation of particles in solution - a perspective on light scattering and comparative technologies.</a> Science and Technology of Advanced Materials. 19, 732-745 (2018).</li><li>Bohren, C. F., Huffman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , (1983).</li></ol>

כאן, אנו מדגימים פרוטוקול עבור NTA של EVs כדי למדוד את התפלגות הגודל של מגוון רחב של גדלי חלקיקים בו זמנית ולמדוד את הריכוז הכולל של EV במדגם polydisperse. במחקר זה, רקמת השומן perigonadal עכבר ופלזמה אנושית שימשו כמקור של כלי עבודה אלקטרוניים. עם זאת, EVs מבודד מרקמות אחרות או נוזלים ביולוגיים כגון סרום, שתן...

שלשלות חוץ-תאיות (EVs) הן שלשלות קטנות (0.03-2 מיקרומטר) הקשורות לקרום המופרשות על ידי כמעט כל סוגי התאים1. הם מכונים לעתים קרובות "exosomes", "microvesicles", או "גופים אפופוטוטיים" בהתאם למנגנון השחרור שלהם וגודל2. אמנם בתחילה חשבו כי EVs היו פשוט אמצעי לחיסול פסולת מהתא כדי לשמור על הומאוסטזיס3, עכשיו אנחנו יודעים שהם יכולים גם להשתתף בתקשורת בין תאית באמצעות העברת חומר מולקולרי - כולל DNA, RNA (mRNA, microRNA), שומנים, וחלבונים4,5 - וכי הם רגולטורים חשובים של פיזיולוגיה נורמלית, כמו גם תהליכים פתולוגיים1, 5,6,7,8.
ישנן שיטות רבות ושונות כדי לבודד ולכומת EVs, אשר תוארו במקומות אחרים9,10,11,12. פרוטוקול הבידוד המשמש, כמו גם את המקור של EVs יכול להשפיע מאוד על תשואה EV וטוהר. אפילו צנטריפוגה דיפרנציאלית, שנחשבה זה מכבר לגישת "תקן הזהב" לבידוד אקסוזום, יכולה להיות כפופה לשינויים משמעותיים המשפיעים לאחר מכן על אוכלוסיית EV שהושגה ובניתוחים במורד הזרם13. לכן, המתודולוגיות השונות לבידוד וכימות EV מקשות על השוואה, שחזור ופרשנות של תוצאות ניסויים שדווחו בספרות14. יתר על כן, שחרור EV יכול להיות מוסדר על ידי תנאים הסלולר או גורמים חיצוניים שונים. הוצע כי EVs לשחק תפקיד בשמירה על הומאוסטזיס הסלולר על ידי הגנה על תאים מפני מתח תאי15, כמו מספר מחקרים הראו כי מתח תאי מגרה הפרשת EV. לדוגמה, שחרור EV מוגבר דווח לאחר חשיפה תאית היפוקסיה, לחץ רשתית אנדופלסמי, עקה חמצונית, מתח מכני, תמצית עשן סיגריות, זיהום אוויר חומר חלקיקי16,17,18,19,20,21,22. גם שחרור EV הוכח להיות שונה ב vivo; עכברים נתונים לתזונה עתירת שומן או צום במשך 16 שעות שחררו יותר adipocyte EVs23. כדי לחקור אם טיפול או מצב ספציפיים משנים את שחרור EV, יש לקבוע במדויק את מספר ה- EVs. הערכת התפלגות גודל הרכב הרך EV עשויה גם להצביע על המקור התת-תאי השולט של רכבים לוויוניים (למשל, היתוך של אנדוזומים מאוחרים/גופים רב-תאיים עם קרום הפלזמה לעומת ניצנים של קרום הפלזמה)24. לכן, יש צורך בשיטות חזקות כדי למדוד במדויק את הריכוז הכולל ואת התפלגות הגודל של הכנת EV הנלמדת.
שיטה מהירה ורגישה מאוד להדמיה ואפיון של EVs בפתרון היא ניתוח מעקב ננו-חלקיקים (NTA). הסבר מפורט על עקרונות שיטה זו והשוואה עם שיטות חלופיות להערכת גודל EV וריכוז תוארו בעבר25,26,27,28. בקצרה, במהלך מדידת NTA, EVs דמיינו על ידי האור הפזור כאשר הם מוקרן עם קרן לייזר. האור המפוזר מתמקד במיקרוסקופ למצלמה המתעד את תנועת החלקיקים. תוכנת NTA עוקבת אחר התנועה התרמית האקראית של כל חלקיק, המכונה תנועה בראונית, כדי לקבוע את מקדם הדיפוזיה המשמש לחישוב הגודל של כל חלקיק באמצעות משוואת סטוקס-איינשטיין. NTA הוחל לראשונה על מדידת EVs במדגם ביולוגי בשנת 201125. עד לאחרונה, היו רק שתי חברות מיינסטרים המציעות מכשירים מסחריים של NTA29 עד כניסתו של ViewSizer 3000 (להלן מכשיר מעקב חלקיקים) המשתמש בשילוב של פתרונות חומרה ותוכנה חדשניים כדי להתגבר על מגבלות משמעותיות של טכניקות NTA אחרות.
מכשיר המעקב אחר חלקיקים מאפיין חלקיקים בדגימות נוזליות על ידי ניתוח התנועה הבראונית שלהם ומאפיין חלקיקים גדולים יותר בגודל מיקרון על ידי ניתוח התיישבות כבידה. המערכת האופטית הייחודית של מכשיר זה, הכוללת תאורה רב-ספקטרלית עם שלושה מקורות אור לייזר (ב-450 ננומטר, 520 ננומטר ו-635 ננומטר), מאפשרת לחוקרים לנתח מגוון רחב של גדלי חלקיקים (למשל אקסוזומים, מיקרו-vesicles) בו זמנית. תרשים של הגדרת המכשיר מוצג באיור 1.
כאן, אנו מדגימים כיצד לבצע התפלגות גודל חלקיקים ומדידות ריכוז של עכבר מבודד ו- EVs אנושי באמצעות מכשיר NTA חדשני.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62447/62447fig01.jpg"> איור 1: מערכת אופטית של מכשיר מעקב חלקיקים. מכשיר NTA מאיר חלקיקים באמצעות שלושה לייזרים עם אורכי הגל הבאים: 450 ננומטר, 520 ננומטר, 635 ננומטר. הקלטת וידאו של האור המפוזר מחלקיקים בודדים מזוהה ומעקב על ידי מצלמת וידאו דיגיטלית מכוונת 90 ° מן cuvette. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62447/62447fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X dPBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0119-1000</td>
			<td>To dilute samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 nm bead standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3100A</td>
			<td>To test ViewSizer 3000 calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 nm bead standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3400A</td>
			<td>To test ViewSizer 3000 calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>To filter PBS diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collection tubes, 2 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19201</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed air duster</td>
			<td>DustOff</td>
			<td>DPSJB-12</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette insert</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette jig</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>To align magnetic stir bar while placing inserts inside cuvette; Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>De-ionized water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0201-1000</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer with monitor, keyboard, mouse, and all necessary cables</td>
			<td>Dell</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70-100%)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>-</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoQuick ULTRA</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>EQULTRA-20A-1</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass scintillation vials with lids</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B780020</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#34;Hook&#34; tool</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-free microfiber cloth</td>
			<td>Texwipe</td>
			<td>TX629</td>
			<td>To clean cuvettes and cover work surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363344</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bar</td>
			<td>Sp Scienceware</td>
			<td>F37119-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suprasil Quartz cuvette with cap</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>AG1000-0544</td>
			<td>Initially provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViewSizer 3000</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Nanoparticle tracking instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles

התפקידים הפיזיולוגיים והפתופיזיולוגיים של שלשלות חוץ תאיות (EVs) הפכו מוכרים יותר ויותר, מה שהופך את שדה הרכב התגנבות לתחום מחקר המתפתח במהירות. ישנן שיטות רבות ושונות לבידוד EV, כל אחת עם יתרונות וחסרונות ברורים המשפיעים על התשואה במורד הזרם וטוהר של EVs. לכן, אפיון הכנת EV מבודד ממקור נתון על ידי שיטה שנבחרה חשוב לפרשנות של תוצאות במורד הזרם והשוואת תוצאות על פני מעבדות. קיימות שיטות שונות לקביעת הגודל והכמות של כלי עבודה אלקטרוניים, אשר ניתן לשנות על ידי מצבי מחלה או בתגובה לתנאים חיצוניים. ניתוח מעקב ננו-חלקיקים (NTA) היא אחת הטכנולוגיות הבולטות המשמשות לניתוח תפוקה גבוהה של EVs בודדים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לכימות וקביעת גודל של כלי עבודה אלקטרוניים מבודדים מרקמת שומן perigonadal עכבר ופלזמה אנושית באמצעות טכנולוגיה פורצת דרך עבור NTA המייצגת התקדמות משמעותית בתחום. התוצאות מראות כי שיטה זו יכולה לספק נתוני ריכוז חלקיקים כוללים וחלוקת חלקיקים חוקיים לשחזור עבור EVs המבודדים ממקורות שונים בשיטות שונות, כפי שאושר על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור. ההתאמה של מכשיר זה עבור נת"ע תתייחס לצורך בתקינה בשיטות נת"ע להגברת ההקפדה והשחזור במחקרי EV.

לפני הדגמה זו, הכיול של המכשיר נבדק לראשונה כדי להבטיח את תוקפם של הנתונים שנרכשו על ידי מדידת התפלגות הגודל של תקני חרוזים פוליסטירן. בדקנו את התפלגות הגודל של חרוזים של 100 ננומטר ו- 400 ננומטר באמצעות פרמטרי ההקלטה המוגדרים כברירת מחדל והגדרות העיבוד המומלצות בפרוטוקול זה (איור...

Watch this Scientific Journal Video about Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles at JoVE.com

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

אנו מדגימים כיצד להשתמש במכשיר ניתוח ננו-חלקיקים חדשני כדי להעריך את התפלגות הגודל ואת ריכוז החלקיקים הכולל של שלל חוץ תאי מבודד רקמת שומן perigonadal עכבר ופלזמה אנושית.

ניתוח מעקב חלקיקים לכימות וקביעת גודל של שלל חוץ-תאי

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

תוצאות NTA נוטות מאוד להטות מפעיל. פרוטוקול זה מדגים את ההשפעות של פרמטרי NTA שהשתנו על תוצאות שהושגו. שיטה מתוקננת תסייע להגביר את ההקפדה והשחזור בניתוח NTA.ניתוח המדגם בקובט מאפשר ללכוד דגימה אקראית סטטיסטית בכל סרטון. התוצאה היא נתונים ניתנים לשחזור יותר והדמיה של חלקיקים על פני מגוון רחב של גדלים. כמו מקבל מדגם בטווח ריכוז החלקיקים המומלץ יכול להיות קשה, הקפד לבצע דילול סדרתי כדי לזהות את גורם הדילול האידיאלי.מדגים את ההליך יהיה קונגהנג קאי, דוקטורנט מהמעבדה של אנתוני פרנטה. כדי להכין cuvette לניתוח מעקב ננו-חלקיקים, לכסות את סביבת העבודה עם חומר ללא מוך כדי למנוע סיבים מלהיכנס cuvettes. לובשים כפפות, מניחים cuvette המכיל מוט ערבוב על ג'יג cuvette מגנטי.השתמש בכלי וו כדי למקם את ההוספה לתוך cuvette עם חריץ של התוסף גלוי בחלק הקדמי של cuvette. השתמש פיפטה להוסיף לאט 400 עד 500 microliters של שלפוחיות חוץ תאיות מטוהרות על cuvette דרך החור בהכנס ומערבבים את המדגם על ידי pipetting בעדינות מבלי להציג בועות אוויר, ולאחר מכן לכסות את cuvette, הקשה על בועות לפי הצורך ולהשתמש בד ללא מוך כדי לנגב את המשטח החיצוני של cuvette. כדי לנתח את ריכוז החלקיקים של הדילול או המדגם, הפעל את תחנת העבודה והמכשיר של המחשב והפעל את תוכנית ניתוח מעקב החלקיקים.כאשר תתבקש, לחץ על NTA ופתח את כרטיסיית ההקלטה. בצע את ההוראות המופיעות על המסך כדי למלא את כל המידע לדוגמה הדרוש. לניתוח מעקב אחר EV, הגדר את הדילול ל- PBS.המליחות תאכלס אוטומטית ל -9%כדי להשיג את ריכוז החלקיקים המדולל או המדגם, פתח את מכסה המכשיר והסר את מכסה המגן המכסה שבו יוצב הקובט. טען את cuvette לתוך המכשיר בכיוון הנכון עם החרץ של להוסיף מול המצלמה ולהחליף את המכסה ואת מכסה המכשיר. לחץ על חץ ההזרמה כדי להפעיל את המצלמה ולחץ על חץ הסוגריים הזוויתיים כדי להרחיב את הגדרות הרשומה.התאם את המוקד עד שהחלקיקים הקטנים יחסית וגלים בבירור. כדי להגדיר את הניתוח לכימות EV קטן, הגדר את קצב הפריימים ל- 30 פריימים לשנייה, את החשיפה ל- 15 אלפיות השנייה, את זמן ההמתנה לחמש שניות, את זמן ההמתנה לשלוש שניות, את כוחות הלייזר הכחול, הירוק והאדום ל- 210, 12 ו- 8 מילי וואט בהתאמה, את המסגרות לסרטון ל - 300 ואת הרווח ל - 30 דציבלים. התאם את המוקד עד שהחלקיקים הקטנים יחסית וגלים בבירור.הגדלת הזום ו/או הרווח יכולה לעזור עם התמקדות החלקיקים. אבל אם תגדיל את הרווח, זכור להגדיר אותו ל 30 דציבלים לפני ההקלטה. לאחר שחלקיקים נמצאים במוקד, הגדר את הגדרת גודל התצוגה לפי 0.5 כדי לחסוך רוחב פס ולמנוע מסגרות אובדן ולחץ על הקלטה כדי להתחיל להקליט את הווידאו.כאשר מופיעה בקשה המציינת שהסרטונים הוקלטו, לחץ על אישור כדי להשלים את ההקלטה ובחר בכרטיסיית התהליך. אם חלקיקים גדולים מאוד נראו בכל סרטון בזמן ההקלטה, נווטו לספריה של סרטונים מוקלטים והסירו כל סרטון בעייתי לפני העיבוד. סמן את התיבה בטל עקיפה של זיהוי שמע והגדר את קוטר התכונה ל- 30.לחץ על תהליך כדי ליזום עיבוד וידאו ולהציג גרף הפצה חי. לאחר השלמת העיבוד, לחץ על אישור ובחר בכרטיסיית התוויית התוויה. עבור כלי רטטוי, הצג את התרשים הראשי כסיליקה של יומן רישום.ניתן להתאים אישית תכונות אחרות של הגרף, כגון שינוי ציר ה- x כדי להגדיר את האזור לשילוב הדמות המיוצרת. ליצירת דוח PDF של התוצאות, לחצו על לחצן 'דוח'. הממוצע, החציון, גודל המצב והריכוז המותאמים לגורם הדילול ורוחב ההפצה יוצגו.NTA של דילול צריך להתבצע לפני כל מדגם, כך הריכוז של ריק זה ניתן להפחית את ריכוז חלקיקי מדגם EV. כדי לנקות את cuvettes לאחר הניתוח, לרוקן את cuvette ולמלא לחלוטין את cuvettes 10 עד 15 פעמים עם מים deionized ואת שלוש פעמים עם 70 עד 100%אתנול כדי להסיר כל דגימה שיורית. יבשו את החלק החיצוני של הקובטים עם בד מיקרופייבר נטול מוך וייבשו את החלק הפנימי עם מטלית אוויר דחוסה.כדי לנקות את התוספות ומערבבים את הסורגים, מניחים את החומרים ב בקבוקון נוצץ מזכוכית המכיל 70 עד 100% אתנול ומנערים את הנקניקיה במרץ. לאחר מכן לשטוף את תוספות ומערבבים ברים במים deionized עם רועד כפי שהוכח ולייבש אותם באמצעות מטליות ללא מוך. לאחר הייבוש, יש להניח מיד את כל הרכיבים הנקיים באחסון עד לניתוח הבא.לפני ביצוע ניתוח, כיול המכשיר נבדק באמצעות חרוזי פוליסטירן כדי להבטיח את תוקפם של הנתונים שנרכשו. כפי שנצפה, מכשיר מעקב החלקיקים דיווח במדויק על גודלם של חרוזי המנודיספרס 100 ננומטר, אך דיווח רק מקרוב על גודלם של חרוזי 400 ננומטר. לכן, הגדרות המכשיר עבור פרוטוקול זה היו מדויקות יותר עבור חלקיקים קטנים יותר, קרוב יותר 100 ננומטר בגודל.באמצעות הגדרות אלה, דיווח על ריכוז חלקיקים בהתאם עם גורם דילול המוכיח כי המכשיר יכול לזהות במדויק את ריכוז החלקיקים בדילולים שונים עם שונות קטנה בין replicants טכניים. דילול אופטימלי עבור 4.41 פעמים 10 עד 10 חלקיקים 10 לכל 10 מיליליטר רקמת עכבר נגזר מדגם EV נגזר נקבע להיות בין 1, 000 ו 3, 000. בניתוח זה, הגדלת הרווח הגדילה את רגישות המצלמה, ומאפשרת עלייה בהדמיה של מספר גבוה יותר של חלקיקים קטנים יותר.הגדלת כוח הלייזר הכחול מ-70 ל-210 מילי-וואט תוך שמירה על כוחות הלייזר הירוקים והאדומים הקבועים, העבירה את גודל החלקיקים הממוצע המדווח מ-122 ל-105 ננומטר והגדילה את ריכוז החלקיקים הכולל שדווח מ-1.1 כפול 10 לשמינית ל-1.7 כפול 10 לשמינית. הגדלת כוחו של הלייזר האדום הגדילה את גודל החלקיקים הממוצע שדווח מ-175 ל-246 ננומטר והפחיתה את ריכוז החלקיקים הכולל שדווח. הגדלת כוח הלייזר הירוק הביאה לירידה בגודל החלקיקים הממוצע שדווח ולעלייה בריכוז החלקיקים הכולל שדווח.מציאת הדילול הנכון כדי למקם דגימה בטווח הזיהוי האופטימלי יכולה לקחת כמה ניסיונות עבור כל דגימה. ניקוי cuvette דורש גם טיפול זהיר נוסף. אנו ממליצים ליישם יותר משיטת אורתוגונל אחת עבור מידות גודל חלקיקי EV וריכוז.ניתן לבצע פיזור אור דינמי, חישת פעימה התנגדותית, מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור וחישת הדמיית רפלורנס אינטרפרומטרית של חלקיק יחיד כדי לאפיין רכבים חשמליים.

Research

JoVE Journal

Biology

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

חשיבותה של ריכוז חלבון נכון עבור קינטיקס וקביעת זיקה בניתוח מבנה פונקציה

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

שיטה חדשנית לExosome כימות ומדידה גודל

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

Microplate Assay מהיר והספציפי לקביעת Ascorbate Intra-ותאי בתאים בתרבית

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

טכניקות לניתוח של תאית שלפוחית ​​שימוש cytometry הזרימה

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

זרימה Cytometric ניתוח של שלפוחית חוץ-תאית ממדיה ממוזגים-תא

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

טיהור וניתוח מסחטות של האלקאים ושלפוחיות

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes

הדמיה וניתוח אוטומטיים לכימות של מקרופינומיסומים המסומנים בפלואורסצנטות

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and ...

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

ספיגת ארסיה חוץ-תאית באמצעות ניתוח הדמיית מיקרוסקופ קונפוצלי

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular ...

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

מיקרוסקופיה ישירה לשחזור אופטי סטוכאסטי של שלשלות חוץ-תאיות בשלושה ממדים

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

בידוד וטיהור מדרגיים של שלפוחיות חוץ-תאיות מ-Escherichia coli וחיידקים אחרים

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...