Name: nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles
Uploaded: 2021-03-28T14:00:00
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इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (ES030973-01A1, R01ES025225, R01DK066525, P30DK026687, P30DK063608) द्वारा समर्थित किया गया था। हम जेफरी Bodycomb, HORIBA उपकरणों के पीएचडी स्वीकार करते है उसकी मदद के लिए शामिल उपकरण अंशांकन ।

इन नमूनों के साथ सभी कार्य संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति और संस्थागत समीक्षा बोर्ड के दिशा-निर्देशों के अनुपालन में किए गए थे । एनटीए विधि का एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन चित्र 2में दर्शाय?...

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	<li>Colombo, M., Raposo, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+secretion,+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).</li><li>Hessvik, N. P., Llorente, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+knowledge+on+exosome+biogenesis+and+release.">Current knowledge on exosome biogenesis and release.</a> Cellular and molecular life sciences: CMLS. 75, 193-208 (2018).</li><li>Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+formation+during+reticulocyte+maturation.+Association+of+plasma+membrane+activities+with+released+vesicles+(exosomes).">Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes).</a> The Journal of Biological Chemistry. 262, 9412-9420 (1987).</li><li>Th&#233;ry, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses.">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).</li><li>Y&#225;&#241;ez-M&#243;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).</li><li>Lo Cicero, A., Stahl, A., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+shuffling+intercellular+messages:+for+good+or+for+bad.">Extracellular vesicles shuffling intercellular messages: for good or for bad.</a> Current Opinion in Cell Biology. 35, 69-77 (2015).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200, 373-383 (2013).</li><li>Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. 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Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 89, 123-134 (2016).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Extracellular+Vesicles:+General+Methodologies+and+Latest+Trends.">Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends.</a> BioMed Research International. 2018, 1-27 (2018).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li><li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Desd&#237;n-Mic&#243;, G., Mittelbrunn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+exosomes+in+the+protection+of+cellular+homeostasis.">Role of exosomes in the protection of cellular homeostasis.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 11, 127-134 (2017).</li><li>Kanemoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+body+formation+enhancement+and+exosome+release+during+endoplasmic+reticulum+stress.">Multivesicular body formation enhancement and exosome release during endoplasmic reticulum stress.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 480, 166-172 (2016).</li><li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+extract+induced+exosome+release+is+mediated+by+depletion+of+exofacial+thiols+and+can+be+inhibited+by+thiol-antioxidants.">Cigarette smoke extract induced exosome release is mediated by depletion of exofacial thiols and can be inhibited by thiol-antioxidants.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 108, 334-344 (2017).</li><li>Saeed-Zidane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+exosome+mediated+molecular+defense+mechanism+in+bovine+granulosa+cells+exposed+to+oxidative+stress.">Cellular and exosome mediated molecular defense mechanism in bovine granulosa cells exposed to oxidative stress.</a> PloS One. 12, 0187569 (2017).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stress-dependent+autophagy+component+release+via+extracellular+nanovesicles+in+tumor+cells.">Mechanical stress-dependent autophagy component release via extracellular nanovesicles in tumor cells.</a> ACS Nano. 13, 4589-4602 (2019).</li><li>King, H. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7, 780-788 (2011).</li><li>Saveyn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+particle+size+distribution+determination+by+nanoparticle+tracking+analysis+based+on+2-D+Brownian+dynamics+simulation.">Accurate particle size distribution determination by nanoparticle tracking analysis based on 2-D Brownian dynamics simulation.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 352, 593-600 (2010).</li><li>Vander Meeren, P., Kasinos, M., Saveyn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+two-dimensional+Brownian+motion+dynamics+in+applying+nanoparticle+tracking+analysis.">Relevance of two-dimensional Brownian motion dynamics in applying nanoparticle tracking analysis.</a> Methods in Molecular Biology. , 525-534 (2012).</li><li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+evaluation+of+Nanoparticle+Tracking+Analysis+(NTA)+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates.">Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27, 796-810 (2010).</li><li>Bachurski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+measurements+with+nanoparticle+tracking+analysis+-+An+accuracy+and+repeatability+comparison+between+NanoSight+NS300+and+ZetaView.">Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1596016 (2019).</li><li>Varga, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hollow+organosilica+beads+as+reference+particles+for+optical+detection+of+extracellular+vesicles.">Hollow organosilica beads as reference particles for optical detection of extracellular vesicles.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16, 1646-1655 (2018).</li><li>Serrano-Pertierra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Current+analytical+techniques+for+detection+and+quantification.">Extracellular vesicles: Current analytical techniques for detection and quantification.</a> Biomolecules. 10, (2020).</li><li>Maguire, C. M., R&#246;sslein, M., Wick, P., Prina-Mello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+particles+in+solution+-+a+perspective+on+light+scattering+and+comparative+technologies.">Characterisation of particles in solution - a perspective on light scattering and comparative technologies.</a> Science and Technology of Advanced Materials. 19, 732-745 (2018).</li><li>Bohren, C. F., Huffman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , (1983).</li></ol>

यहां, हम एक साथ कण आकार की एक विस्तृत श्रृंखला के आकार वितरण को मापने और एक पॉलीडिसपर्स नमूने में कुल ईवी एकाग्रता को मापने के लिए ईवीएस के एनटीए के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं। इस अध्ययन में, मा?...

एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स (ईवीएस) छोटे (0.03-2 माइक्रोन) झिल्ली से बंधे वेसिकल्स हैं जो लगभग सभी सेल प्रकार1द्वारा स्रावित होते हैं। उन्हें अक्सर रिलीज और आकार 2 के उनके तंत्र के आधार पर "एक्सोसोम्स," "माइक्रोवेसिकल्स" या "एपोप्टिक बॉडी" के रूप में जानाजाताहै। हालांकि शुरू में यह सोचा गया था कि ईवीएस बस होम्योपैथी3को बनाए रखने के लिए सेल से कचरे को नष्ट करने का एक साधन था, अब हम जानते हैं कि वे डीएनए, आरएनए (एमआरएनए, माइक्रोआरएनए), लिपिड, और प्रोटीन4,5 सहित आणविक सामग्री के हस्तांतरण के माध्यम से अंतरकोशिकीय संचार में भी भाग ले सकते हैं - और वे सामान्य शरीर विज्ञान के साथ-साथ पैथोलॉजिकल प्रक्रियाओं के महत्वपूर्ण नियामक हैं1, 5,6,7,8.
ईवीएस को अलग-थलग करने और मात्रा निर्धारित करने के लिए कई अलग-अलग तरीके हैं, जिन्हें कहीं और9,10,11,12वर्णित किया गया है। अलगाव प्रोटोकॉल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से EVs के स्रोत का इस्तेमाल किया बहुत EV उपज और शुद्धता को प्रभावित कर सकते हैं । यहां तक कि अंतर अपकेंद्रित्र, लंबे समय से एक्सोसोम अलगाव के लिए "सोने के मानक" दृष्टिकोण माना जाता है, पर्याप्त परिवर्तनशीलता के अधीन किया जा सकता है बाद में प्राप्त EV आबादी को प्रभावित करने और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण13। इस प्रकार, ईवी अलगाव और मात्राकरण के विभिन्न विभिन्न तरीकों से साहित्य में सूचित प्रयोगों के परिणामों की तुलना करना, पुन: पेश करना और व्याख्या करना मुश्किल होजाताहै। इसके अलावा, ईवी रिलीज को सेलुलर स्थितियों या विभिन्न बाहरी कारकों द्वारा विनियमित किया जा सकता है। यह सुझाव दिया गया है कि ईवीएस इंट्रासेलुलर तनाव15के खिलाफ कोशिकाओं की रक्षा करके सेलुलर होमोस्टेसिस को बनाए रखने में भूमिका निभाते हैं, क्योंकि कई अध्ययनों से पता चला है कि सेलुलर तनाव ईवी स्राव को उत्तेजित करता है। उदाहरण के लिए, हाइपोक्सिया, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम तनाव, ऑक्सीडेटिव तनाव, यांत्रिक तनाव, सिगरेट के धुएं के निकालने और कण पदार्थ वायुप्रदूषण16, 17,18,19,20,21, 22के सेलुलर एक्सपोजर के बाद बढ़ी हुई ईवी रिलीज की सूचना दी गई है। ईवी रिलीज को भी वीवो में संशोधित किया गया है; चूहों एक उच्च वसा आहार या सोलह घंटे के लिए उपवास के अधीन अधिक adipocyte EVs23जारी . यह जांचने के लिए कि क्या कोई विशिष्ट उपचार या स्थिति ईवी रिलीज को बदल देती है, ईवीएस की संख्या सही रूप से निर्धारित की जानी चाहिए। ईवी आकार वितरण का आकलन भी ईवीएस के प्रमुख उपकोशिकीय मूल का संकेत हो सकता है (उदाहरण के लिए, प्लाज्मा झिल्ली बनाम प्लाज्मा झिल्ली के नवोदित के साथ देर से एंडोसोम/मल्टीवेस्कुलर निकायों का संलयन)24। इस प्रकार, कुल एकाग्रता और ईवी प्रेप के आकार वितरण का अध्ययन करने के लिए सटीक रूप से मापने के लिए मजबूत तरीकों की आवश्यकता है।
समाधान में ईवीएस के विज़ुअलाइज़ेशन और लक्षण वर्णन के लिए एक तेजी से और अत्यधिक संवेदनशील तरीका नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) है। इस विधि के सिद्धांतों और ईवी आकार और एकाग्रता के आकलन के लिए वैकल्पिक तरीकों से तुलना की विस्तृत व्याख्या पहले25 , 26,27,28बताई गई है . संक्षेप में, एनटीए माप के दौरान, ईवीएस को लेजर बीम के साथ विकिरणित होने पर बिखरे हुए प्रकाश द्वारा कल्पना की जाती है। बिखरे हुए प्रकाश एक कैमरे पर एक माइक्रोस्कोप द्वारा केंद्रित है जो कण आंदोलन को रिकॉर्ड करता है। एनटीए सॉफ्टवेयर प्रत्येक कण की यादृच्छिक थर्मल गति को ट्रैक करता है, जिसे ब्राउनियन मोशन के नाम से जाना जाता है, प्रसार गुणांक का निर्धारण करने के लिए जो स्टोक्स-आइंस्टीन समीकरण का उपयोग करके प्रत्येक कण के आकार की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है। एनटीए को सबसे पहले 201125में जैविक नमूने में ईवीएस के मापन के लिए लागू किया गया था । हाल ही में जब तक, व्यूसाइजर 3000(इसके बाद कण ट्रैकिंग उपकरण के रूप में संदर्भित) की शुरूआत तक वाणिज्यिक एनटीए उपकरणों की पेशकश करने वाली केवल दो मुख्यधारा की कंपनियां थीं, जो अन्य एनटीए तकनीकों की महत्वपूर्ण सीमाओं को दूर करने के लिए उपन्यास हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर समाधानों के संयोजन का उपयोग करती हैं।
कण ट्रैकिंग उपकरण उनके ब्राउनियन गति का विश्लेषण करके तरल नमूनों में नैनोकणों की विशेषता है और गुरुत्वाकर्षण बसने का विश्लेषण करके बड़े माइक्रोन आकार के कणों की विशेषता है । इस उपकरण की अनूठी ऑप्टिकल प्रणाली, जिसमें तीन लेजर प्रकाश स्रोतों (450 एनएम, 520 एनएम और 635 एनएम) के साथ बहुस्पेक्ट्रल रोशनी शामिल है, शोधकर्ताओं को एक साथ कण आकार (जैसे, एक्सोसोम्स, माइक्रोवेसिकल्स) की एक विस्तृत श्रृंखला का विश्लेषण करने की अनुमति देता है। चित्र 1 में इंस्ट्रूमेंट सेटअप का एक योजनाबद्ध दिखायागया है ।
यहां, हम एक उपन्यास एनटीए उपकरण का उपयोग करके अलग माउस और मानव ईवीएस के कण आकार वितरण और एकाग्रता माप का प्रदर्शन कैसे करते हैं।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62447/62447fig01.jpg"> चित्रा 1:कण ट्रैकिंग उपकरण ऑप्टिकल प्रणाली। एनटीए उपकरण निम्नलिखित तरंगदैर्ध्य के साथ तीन लेजर का उपयोग करके कणों को रोशन करता है: 450 एनएम, 520 एनएम, 635 एनएम। अलग-अलग कणों से बिखरे हुए प्रकाश की वीडियो रिकॉर्डिंग का पता लगाया जाता है और क्यूवेट से 90 डिग्री उन्मुख डिजिटल वीडियो कैमरा द्वारा ट्रैक किया जाता है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62447/62447fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X dPBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0119-1000</td>
			<td>To dilute samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 nm bead standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3100A</td>
			<td>To test ViewSizer 3000 calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 nm bead standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3400A</td>
			<td>To test ViewSizer 3000 calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>To filter PBS diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collection tubes, 2 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19201</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed air duster</td>
			<td>DustOff</td>
			<td>DPSJB-12</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette insert</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette jig</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>To align magnetic stir bar while placing inserts inside cuvette; Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>De-ionized water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0201-1000</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer with monitor, keyboard, mouse, and all necessary cables</td>
			<td>Dell</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70-100%)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>-</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoQuick ULTRA</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>EQULTRA-20A-1</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass scintillation vials with lids</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B780020</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#34;Hook&#34; tool</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-free microfiber cloth</td>
			<td>Texwipe</td>
			<td>TX629</td>
			<td>To clean cuvettes and cover work surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363344</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bar</td>
			<td>Sp Scienceware</td>
			<td>F37119-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suprasil Quartz cuvette with cap</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>AG1000-0544</td>
			<td>Initially provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViewSizer 3000</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Nanoparticle tracking instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles

एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स (ईवीएस) की शारीरिक और रोगविज्ञानी भूमिकाएं तेजी से पहचानी जा चुकी हैं, जिससे ईवी क्षेत्र अनुसंधान का एक त्वरित रूप से विकसित होता है। ईवी अलगाव के लिए कई अलग-अलग तरीके हैं, प्रत्येक में अलग-अलग फायदे और नुकसान हैं जो ईवी की डाउनस्ट्रीम उपज और शुद्धता को प्रभावित करते हैं। इस प्रकार, एक चुने हुए विधि द्वारा दिए गए स्रोत से अलग ईवी तैयारी की विशेषता डाउनस्ट्रीम परिणामों की व्याख्या और प्रयोगशालाओं में परिणामों की तुलना के लिए महत्वपूर्ण है। ईवीएस के आकार और मात्रा का निर्धारण करने के लिए विभिन्न तरीके मौजूद हैं, जिन्हें रोग राज्यों द्वारा या बाहरी परिस्थितियों के जवाब में बदला जा सकता है। नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) व्यक्तिगत ईवीएस के उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली प्रमुख प्रौद्योगिकियों में से एक है। यहां, हम इस क्षेत्र में प्रमुख प्रगति का प्रतिनिधित्व करने वाली एनटीए के लिए एक सफलता प्रौद्योगिकी का उपयोग करके माउस पेरिगोनाडल एडिपोस ऊतक और मानव प्लाज्मा से अलग ईवीएस के परिमाणीकरण और आकार निर्धारण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। परिणाम दर्शाते हैं कि यह विधि विभिन्न तरीकों का उपयोग करके विभिन्न स्रोतों से अलग ईवीएस के लिए प्रजनन योग्य और वैध कुल कण एकाग्रता और आकार वितरण डेटा प्रदान कर सकती है, जैसा कि ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा पुष्टि की गई है। एनटीए के लिए इस उपकरण के अनुकूलन से ईवी अनुसंधान में कठोरता और प्रजनन क्षमता बढ़ाने के लिए एनटीए विधियों में मानकीकरण की आवश्यकता का समाधान होगा ।

इस प्रदर्शन से पहले, पॉलीस्टीरिन मनका मानकों के आकार वितरण को मापने के द्वारा अधिग्रहीत डेटा की वैधता सुनिश्चित करने के लिए उपकरण के अंशांकन का परीक्षण किया गया था। हमने डिफ़ॉल्ट रिकॉर्डिंग मापदंडों...

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Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

हम माउस पेरिगोनाडल एडीपोज ऊतक और मानव प्लाज्मा से अलग किए गए आकार वितरण और बाह्यसील वेसिकल के कुल कण एकाग्रता का अनुमान लगाने के लिए एक उपन्यास नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण उपकरण का उपयोग कैसे करते हैं।

एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स के क्वांटिफिकेशन और आकार निर्धारण के लिए नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

एनटीए परिणाम ऑपरेटर पूर्वाग्रह के लिए बहुत प्रवण हैं। यह प्रोटोकॉल प्राप्त परिणामों पर परिवर्तित एनटीए मापदंडों के प्रभावों को दर्शाता है। एक मानकीकृत विधि एनटीए विश्लेषण में कठोरता और प्रजनन क्षमता बढ़ाने में मदद करेगी।एक क्यूवेट में नमूने का विश्लेषण करने से प्रत्येक वीडियो में सांख्यिकीय यादृच्छिक नमूने को कैप्चर करने की अनुमति मिलती है। इसके परिणामस्वरूप अधिक प्रजनन योग्य डेटा और आकारों की एक विस्तृत श्रृंखला पर कणों का दृश्य होता है। अनुशंसित कण एकाग्रता रेंज में एक नमूना प्राप्त करना मुश्किल हो सकता है, आदर्श कमजोर पड़ने वाले कारक की पहचान करने के लिए धारावाहिक कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करना सुनिश्चित करें।प्रक्रिया का प्रदर्शन कुंगेंग कै, एंथनी फेरेंट की प्रयोगशाला से पीएचडी के छात्र होंगे । नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण के लिए क्यूवेट तैयार करने के लिए, फाइबर को क्यूवेट में प्रवेश करने से रोकने के लिए एक लिंट-फ्री सामग्री के साथ कार्यक्षेत्र को कवर करें। दस्ताने पहने हुए, चुंबकीय क्यूवेट जिग पर हलचल पट्टी युक्त एक क्यूवेट रखें।क्यूवेट के सामने दिखाई डालने के पायदान के साथ डालने को क्यूवेट में रखने के लिए एक हुक टूल का उपयोग करें। डालने में छेद के माध्यम से क्यूवेट पर शुद्ध एक्स्ट्रासेलुलर वेसिकल्स के 400 से 500 माइक्रोलीटर जोड़ने के लिए धीरे-धीरे एक पिपेट का उपयोग करें और हवा के बुलबुले को पेश किए बिना धीरे-धीरे पाइपिंग करके नमूना मिलाएं, फिर क्यूवेट को कैप करें, बुलबुले को आवश्यक रूप से टैप करें और क्यूवेट की बाहरी सतह को मिटाने के लिए लिंट-फ्री कपड़े का उपयोग करें। मंद या एक नमूने के कण एकाग्रता का विश्लेषण करने के लिए, कंप्यूटर वर्कस्टेशन और उपकरण चालू करें और कण ट्रैकिंग विश्लेषण कार्यक्रम शुरू करें।जब प्रेरित किया जाता है, तो एनटीए पर क्लिक करें और रिकॉर्डिंग टैब खोलें। सभी आवश्यक नमूना जानकारी भरने के लिए ऑनस्क्रीन निर्देशों का पालन करें। ईवी ट्रैकिंग विश्लेषण के लिए, पीबीएस के लिए मंद सेट करें।लवणता मंद या नमूना कण एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 9% तक ऑटो-आबाद होगी, उपकरण ढक्कन खोलेगी और सुरक्षात्मक टोपी को हटा देगी जहां क्यूवेट रखा जाएगा। कैमरे का सामना करना पड़ डालने के पायदान के साथ सही अभिविन्यास में उपकरण में cuvette लोड और टोपी और साधन ढक्कन की जगह। कैमरे को चालू करने के लिए स्ट्रीमिंग तीर पर क्लिक करें और रिकॉर्ड सेटिंग्स का विस्तार करने के लिए शेवरॉन एरो पर क्लिक करें।अपेक्षाकृत छोटे कणों को स्पष्ट रूप से दिखाई देने तक ध्यान समायोजित करें। एक छोटे से EV परिमाणीकरण के लिए विश्लेषण निर्धारित करने के लिए, प्रति सेकंड 30 फ्रेम करने के लिए फ्रेम दर सेट, 15 मिलीसेकंड के लिए जोखिम, पांच सेकंड के लिए हलचल समय, तीन सेकंड के लिए प्रतीक्षा समय, नीले, हरे, और लाल लेजर शक्तियों के लिए क्रमशः २१०, 12, और 8 मिलीवाट, ३०० के लिए वीडियो प्रति फ्रेम, और 30 डेसीबल के लिए लाभ । अपेक्षाकृत छोटे कणों को स्पष्ट रूप से दिखाई देने तक ध्यान समायोजित करें।ज़ूम बढ़ाने और/या लाभ कण ध्यान केंद्रित करने के साथ मदद कर सकते हैं । लेकिन अगर आप लाभ में वृद्धि, रिकॉर्डिंग से पहले 30 डेसीबल करने के लिए सेट करने के लिए याद है । एक बार जब कण फोकस में हो जाते हैं, तो बैंडविड्थ को बचाने के लिए ज़ूम सेटिंग को 0.5X पर सेट करें और वीडियो रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए नुकसान के फ्रेम और क्लिक रिकॉर्ड को रोकें।जब कोई संकेत दिखाई देता है कि वीडियो रिकॉर्ड किए गए हैं, तो रिकॉर्डिंग को पूरा करने और प्रक्रिया टैब का चयन करने के लिए ओके पर क्लिक करें। यदि रिकॉर्डिंग करते समय किसी भी वीडियो में बहुत बड़े कण दिखाई दे रहे थे, तो रिकॉर्ड किए गए वीडियो की निर्देशिका पर नेविगेट करें और प्रसंस्करण से पहले किसी भी समस्याग्रस्त वीडियो को हटा दें। डिसेबल ऑडियो डिटेक्शन ओवरराइड बॉक्स की जांच करें और फीचर व्यास को 30 सेट करें ।वीडियो प्रोसेसिंग शुरू करने और लाइव डिस्ट्रीब्यूशन ग्राफ देखने के लिए प्रक्रिया पर क्लिक करें। जब प्रोसेसिंग पूरी हो जाए तो ओके पर क्लिक करें और प्लॉट टैब का चयन करें। ईवीएस के लिए, लॉग बिन सिलिका के रूप में मुख्य चार्ट प्रदर्शित करें।ग्राफ की अन्य विशेषताएं, जैसे उत्पादित आकृति के एकीकरण के लिए क्षेत्र निर्धारित करने के लिए एक्स-एक्सिस को बदलना, अनुकूलित किया जा सकता है। परिणामों की पीडीएफ रिपोर्ट बनाने के लिए, रिपोर्ट बटन पर क्लिक करें। कमजोर पड़ने वाले कारक और वितरण चौड़ाई के लिए समायोजित औसत, औसत, मोड आकार और एकाग्रता प्रदर्शित की जाएगी।किसी भी नमूने से पहले मंदता का एनटीए किया जाना चाहिए ताकि इस खाली की एकाग्रता को ईवी नमूना कण एकाग्रता से घटाया जा सके। विश्लेषण के बाद क्यूवेट को साफ करने के लिए, क्यूवेट को खाली करें और किसी भी अवशिष्ट नमूने को हटाने के लिए 70 से 100% इथेनॉल के साथ तीन बार 10 से 15 बार क्यूवेट को पूरी तरह से भरें। एक लिंट-फ्री माइक्रोफाइबर कपड़े के साथ क्यूवेट के बाहर सूखें और एक संकुचित हवा डस्टर के साथ अंदर सूखें।आवेषण को साफ करने और सलाखों को हिलाने के लिए, सामग्री को 70 से 100% इथेनॉल युक्त ग्लास प्रस्फुटन शीशी में रखें और शीशी को सख्ती से हिलाएं। फिर आवेषण कुल्ला और प्रदर्शन के रूप में मिलाते हुए और उन्हें लिंट मुक्त कपड़े का उपयोग कर सूखी के साथ deionized पानी में सलाखों हलचल। सूखने के बाद, अगले विश्लेषण तक सभी साफ घटकों को तुरंत भंडारण में रखें।विश्लेषण करने से पहले, अधिग्रहीत डेटा की वैधता सुनिश्चित करने के लिए पॉलीस्टीरिन मोतियों का उपयोग करके उपकरण अंशांकन का परीक्षण किया गया था। जैसा कि देखा गया, कण ट्रैकिंग उपकरण ने 100 नैनोमीटर मैनोडिस्पर्स मोतियों के आकार की सटीक सूचना दी, लेकिन केवल 400 नैनोमीटर मोतियों के आकार की बारीकी से रिपोर्ट की। इसलिए, इस प्रोटोकॉल के लिए उपकरण सेटिंग्स छोटे कणों के लिए अधिक सटीक थे, आकार में 100 नैनोमीटर के करीब।इन सेटिंग्स का उपयोग करना, कमजोर पड़ने वाले कारक के साथ तदनुसार कण एकाग्रता तराजू की सूचना देता है कि उपकरण तकनीकी प्रतिकृतियों के बीच थोड़ी परिवर्तनशीलता के साथ विभिन्न कमजोर पड़ने पर कण एकाग्रता का सही पता लगा सकता है। मिलीलीटर माउस ऊतक-व्युत्पन्न ईवी नमूने प्रति 10 वें कणों के लिए 4.41 गुना 10 के लिए इष्टतम कमजोर पड़ने 1, 000 और 3, 000 के बीच होना निर्धारित किया गया था। इस विश्लेषण में, लाभ बढ़ाने से कैमरे की संवेदनशीलता बढ़ गई, जिससे छोटे कणों की अधिक संख्या के दृश्य में वृद्धि हुई।नीले लेजर शक्ति को ७० से बढ़ाकर २१० मिलीवाट जबकि हरे और लाल लेजर शक्तियों को लगातार रखते हुए रिपोर्ट औसत कण आकार को १२२ से १०५ नैनोमीटर में स्थानांतरित कर दिया और रिपोर्ट किए गए कुल कण एकाग्रता को १.१ गुना 10 से आठवें से १.७ गुना 10 से बढ़ाकर आठवें स्थान पर रखा । लाल लेजर की शक्ति बढ़ाने की रिपोर्ट औसत कण आकार १७५ से २४६ नैनोमीटर की सूचना दी और रिपोर्ट कुल कण एकाग्रता में कमी आई । हरे लेजर शक्ति में वृद्धि की रिपोर्ट औसत कण आकार में कमी और रिपोर्ट कुल कण एकाग्रता में वृद्धि हुई ।इष्टतम पहचान रेंज के भीतर एक नमूना रखने के लिए सही कमजोर पड़ने ढूंढना प्रत्येक नमूने के लिए कुछ कोशिशें ले सकते हैं। क्यूवेट सफाई के लिए अतिरिक्त सावधानी से निपटने की भी आवश्यकता होती है। हम ईवी कण आकार और एकाग्रता माप के लिए एक से अधिक ऑर्थोगोनल विधि लागू करने की सलाह देते हैं।ईवीएस की विशेषता के लिए डायनेमिक लाइट स्कैटरिंग, प्रतिरोधी पल्स सेंसिंग, ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, और सिंगल-पार्टिकल इंटरफेरोमेट्रिक रिफ्लेक्सेंस इमेजिंग सेंसिंग भी किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Biology

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

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Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

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Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes

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Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Confocal माइक्रोस्कोप इमेजिंग विश्लेषण के माध्यम से बाह्य कोशिकीय पुटिका अपटेक परख

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Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

तीन आयामों में एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स की डायरेक्ट स्टोचस्टिक ऑप्टिकल रिकंस्ट्रक्शन माइक्रोस्कोपी

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

एस्चेरिचिया कोलाई और अन्य बैक्टीरिया से बाह्य पुटिकाओं का स्केलेबल अलगाव और शुद्धिकरण

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...