Name: nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles
Uploaded: 2021-03-28T14:00:00
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Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (ES030973-01A1, R01ES025225, R01DK066525, P30DK026687, P30DK063608). Riconosciamo Jeffrey Bodycomb, Ph.D. di HORIBA Instruments Incorporated per il suo aiuto nella calibrazione dello strumento.

Tutto il lavoro con questi campioni è stato eseguito in conformità con le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali e del Comitato di revisione istituzionale. Una panoramica schematica del metodo NTA è illustrata nella Figura 2.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62447/62447fig02.jpg"> Figura 2: Panoramica del metodo NTA utilizzando l...

<ol>
	<li>Colombo, M., Raposo, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+secretion,+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).</li><li>Hessvik, N. P., Llorente, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+knowledge+on+exosome+biogenesis+and+release.">Current knowledge on exosome biogenesis and release.</a> Cellular and molecular life sciences: CMLS. 75, 193-208 (2018).</li><li>Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. 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D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Desd&#237;n-Mic&#243;, G., Mittelbrunn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+exosomes+in+the+protection+of+cellular+homeostasis.">Role of exosomes in the protection of cellular homeostasis.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 11, 127-134 (2017).</li><li>Kanemoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+body+formation+enhancement+and+exosome+release+during+endoplasmic+reticulum+stress.">Multivesicular body formation enhancement and exosome release during endoplasmic reticulum stress.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 480, 166-172 (2016).</li><li>Benedikter, B. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lipase-independent+pathway+of+lipid+release+and+immune+modulation+by+adipocytes.">A lipase-independent pathway of lipid release and immune modulation by adipocytes.</a> Science. 363, 989-993 (2019).</li><li>van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles.">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 213-228 (2018).</li><li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7, 780-788 (2011).</li><li>Saveyn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+particle+size+distribution+determination+by+nanoparticle+tracking+analysis+based+on+2-D+Brownian+dynamics+simulation.">Accurate particle size distribution determination by nanoparticle tracking analysis based on 2-D Brownian dynamics simulation.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 352, 593-600 (2010).</li><li>Vander Meeren, P., Kasinos, M., Saveyn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+two-dimensional+Brownian+motion+dynamics+in+applying+nanoparticle+tracking+analysis.">Relevance of two-dimensional Brownian motion dynamics in applying nanoparticle tracking analysis.</a> Methods in Molecular Biology. , 525-534 (2012).</li><li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+evaluation+of+Nanoparticle+Tracking+Analysis+(NTA)+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates.">Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27, 796-810 (2010).</li><li>Bachurski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+measurements+with+nanoparticle+tracking+analysis+-+An+accuracy+and+repeatability+comparison+between+NanoSight+NS300+and+ZetaView.">Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1596016 (2019).</li><li>Varga, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hollow+organosilica+beads+as+reference+particles+for+optical+detection+of+extracellular+vesicles.">Hollow organosilica beads as reference particles for optical detection of extracellular vesicles.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16, 1646-1655 (2018).</li><li>Serrano-Pertierra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Current+analytical+techniques+for+detection+and+quantification.">Extracellular vesicles: Current analytical techniques for detection and quantification.</a> Biomolecules. 10, (2020).</li><li>Maguire, C. M., R&#246;sslein, M., Wick, P., Prina-Mello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+particles+in+solution+-+a+perspective+on+light+scattering+and+comparative+technologies.">Characterisation of particles in solution - a perspective on light scattering and comparative technologies.</a> Science and Technology of Advanced Materials. 19, 732-745 (2018).</li><li>Bohren, C. F., Huffman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , (1983).</li></ol>

Qui, dimostriamo un protocollo per NTA di veicoli elettrici per misurare la distribuzione dimensionale di un'ampia gamma di dimensioni delle particelle contemporaneamente e misurare la concentrazione totale di EV in un campione polidisperso. In questo studio, il tessuto adiposo perigonadale di topo e il plasma umano sono stati utilizzati come fonte di veicoli elettrici. Tuttavia, gli EV isolati da altri tessuti o fluidi biologici come siero, urina, saliva, latte materno, liquido amniotico e surnatante di coltura cellular...

Le vescicole extracellulari (EV) sono piccole (0,03-2 μm) vescicole legate alla membrana secrete da quasi tutti i tipi di cellule1. Sono spesso indicati come "esosomi", "microvescicole" o "corpi apoptotici" a seconda del loro meccanismo di rilascio e della dimensione2. Mentre inizialmente si pensava che gli EV fossero semplicemente un mezzo per eliminare i rifiuti dalla cellula per mantenere l'omeostasi3, ora sappiamo che possono anche partecipare alla comunicazione intercellulare tramite il trasferimento di materiale molecolare - tra cui DNA, RNA (mRNA, microRNA), lipidi e proteine4,5 - e che sono importanti regolatori della normale fisiologia e dei processi patologici1, 5,6,7,8.
Esistono molti metodi diversi per isolare e quantificare i veicoli elettrici, che sono stati descritti altrove9,10,11,12. Il protocollo di isolamento utilizzato e la fonte dei veicoli elettrici possono influire notevolmente sulla resa e sulla purezza dei veicoli elettrici. Anche la centrifugazione differenziale, a lungo considerata l'approccio "gold standard" per l'isolamento degli esosomi, può essere soggetta a una sostanziale variabilità che successivamente influisce sulla popolazione EV ottenuta e sulle analisi a valle13. Pertanto, le varie metodologie diverse per l'isolamento e la quantificazione dei veicoli elettrici rendono difficile confrontare, riprodurre e interpretare i risultati degli esperimenti riportati nella letteratura14. Inoltre, il rilascio di EV può essere regolato da condizioni cellulari o vari fattori esterni. È stato suggerito che gli EV svolgono un ruolo nel mantenimento dell'omeostasi cellulare proteggendo le cellule dallo stress intracellulare15, poiché diversi studi hanno dimostrato che lo stress cellulare stimola la secrezione ev. Ad esempio, è stato riportato un aumento del rilascio di EV dopo l'esposizione cellulare a ipossia, stress del reticolo endoplasmatico, stress ossidativo, stress meccanico, estratto di fumo di sigaretta e inquinamento atmosferico da particolato16,17, 18,19,20,21,22. Il rilascio di EV ha anche dimostrato di essere modificato in vivo; topi sottoposti a una dieta ricca di grassi o a digiuno per sedici ore hanno rilasciato più EV di adipociti23. Per indagare se un trattamento o una condizione specifica altera il rilascio di veicoli elettrici, il numero di veicoli elettrici deve essere determinato con precisione. La valutazione della distribuzione delle dimensioni dei veicoli elettrici può anche indicare l'origine subcellulare predominante dei veicoli elettrici (ad esempio, fusione di endosomi tardivi/corpi multivesicolari con la membrana plasmatica rispetto al germogliamento della membrana plasmatica)24. Pertanto, vi è la necessità di metodi robusti per misurare con precisione la concentrazione totale e la distribuzione dimensionale della preparazione EV in fase di studio.
Un metodo rapido e altamente sensibile per la visualizzazione e la caratterizzazione dei veicoli elettrici in soluzione è l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA). Una spiegazione dettagliata dei principi di questo metodo e il confronto con metodi alternativi per la valutazione delle dimensioni e della concentrazione dei veicoli elettrici sono stati descritti in precedenza25,26,27,28. In breve, durante la misurazione NTA, i veicoli elettrici vengono visualizzati dalla luce diffusa quando vengono irradiati con un raggio laser. La luce diffusa viene focalizzata da un microscopio su una fotocamera che registra il movimento delle particelle. Il software NTA tiene traccia del moto termico casuale di ogni particella, noto come moto browniano, per determinare il coefficiente di diffusione che viene utilizzato per calcolare la dimensione di ciascuna particella utilizzando l'equazione di Stokes-Einstein. NTA è stato applicato per la prima volta alla misurazione di veicoli elettrici in un campione biologico nel 201125. Fino a poco tempo fa, c'erano solo due aziende mainstream che offrivano strumenti NTA commerciali29 fino all'introduzione del ViewSizer 3000 (di seguito denominato strumento di tracciamento delle particelle) che utilizza una combinazione di nuove soluzioni hardware e software per superare i limiti significativi di altre tecniche NTA.
Lo strumento di tracciamento delle particelle caratterizza le nanoparticelle in campioni liquidi analizzando il loro moto browniano e caratterizza particelle più grandi di dimensioni micron analizzando l'assestamento gravitazionale. L'esclusivo sistema ottico di questo strumento, che include l'illuminazione multispettrale con tre sorgenti di luce laser (a 450 nm, 520 nm e 635 nm), consente ai ricercatori di analizzare contemporaneamente una vasta gamma di dimensioni delle particelle (ad esempio, esosomi, microvescicole). Uno schema della configurazione dello strumento è mostrato nella Figura 1.
Qui, dimostriamo come eseguire la distribuzione delle dimensioni delle particelle e le misurazioni della concentrazione di veicoli elettrici isolati di topi e umani utilizzando un nuovo strumento NTA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62447/62447fig01.jpg"> Figura 1: Sistema ottico dello strumento di tracciamento delle particelle. Lo strumento NTA illumina le particelle utilizzando tre laser con le seguenti lunghezze d'onda: 450 nm, 520 nm, 635 nm. La registrazione video della luce diffusa dalle singole particelle viene rilevata e tracciata da una videocamera digitale orientata a 90° dalla cuvetta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62447/62447fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X dPBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0119-1000</td>
			<td>To dilute samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 nm bead standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3100A</td>
			<td>To test ViewSizer 3000 calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 nm bead standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3400A</td>
			<td>To test ViewSizer 3000 calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>To filter PBS diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collection tubes, 2 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19201</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed air duster</td>
			<td>DustOff</td>
			<td>DPSJB-12</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette insert</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette jig</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>To align magnetic stir bar while placing inserts inside cuvette; Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>De-ionized water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0201-1000</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer with monitor, keyboard, mouse, and all necessary cables</td>
			<td>Dell</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70-100%)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>-</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoQuick ULTRA</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>EQULTRA-20A-1</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass scintillation vials with lids</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B780020</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#34;Hook&#34; tool</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-free microfiber cloth</td>
			<td>Texwipe</td>
			<td>TX629</td>
			<td>To clean cuvettes and cover work surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363344</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bar</td>
			<td>Sp Scienceware</td>
			<td>F37119-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suprasil Quartz cuvette with cap</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>AG1000-0544</td>
			<td>Initially provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViewSizer 3000</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Nanoparticle tracking instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles

I ruoli fisiologici e fisiopatologici delle vescicole extracellulari (EV) sono diventati sempre più riconosciuti, rendendo il campo EV un'area di ricerca in rapida evoluzione. Esistono molti metodi diversi per l'isolamento dei veicoli elettrici, ognuno con vantaggi e svantaggi distinti che influenzano la resa a valle e la purezza dei veicoli elettrici. Pertanto, caratterizzare la preparazione EV isolata da una determinata fonte con un metodo scelto è importante per l'interpretazione dei risultati a valle e il confronto dei risultati tra i laboratori. Esistono vari metodi per determinare le dimensioni e la quantità di veicoli elettrici, che possono essere alterati da stati patologici o in risposta a condizioni esterne. L'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) è una delle tecnologie di spicco utilizzate per l'analisi ad alto rendimento di singoli veicoli elettrici. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la quantificazione e la determinazione delle dimensioni dei veicoli elettrici isolati dal tessuto adiposo perigonadale del topo e dal plasma umano utilizzando una tecnologia rivoluzionaria per NTA che rappresenta i principali progressi nel campo. I risultati dimostrano che questo metodo può fornire dati riproducibili e validi sulla concentrazione totale di particelle e sulla distribuzione delle dimensioni per veicoli elettrici isolati da fonti diverse utilizzando metodi diversi, come confermato dalla microscopia elettronica a trasmissione. L'adattamento di questo strumento per NTA affronterà la necessità di standardizzazione nei metodi NTA per aumentare il rigore e la riproducibilità nella ricerca EV.

Prima di questa dimostrazione, la calibrazione dello strumento è stata prima testata per garantire la validità dei dati acquisiti misurando la distribuzione dimensionale degli standard di perline di polistirene. Abbiamo testato la distribuzione dimensionale di perle da 100 nm e 400 nm utilizzando i parametri di registrazione predefiniti e le impostazioni di elaborazione consigliate in questo protocollo (Figura 8).
Per lo standard di perline di polistirene da 100...

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Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Dimostriamo come utilizzare un nuovo strumento di analisi del tracciamento delle nanoparticelle per stimare la distribuzione dimensionale e la concentrazione totale di particelle di vescicole extracellulari isolate dal tessuto adiposo perigonadale di topo e dal plasma umano.

Analisi di tracciamento delle nanoparticelle per la quantificazione e la determinazione delle dimensioni delle vescicole extracellulari

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

I risultati NTA sono molto inclini alla distorsione dell'operatore. Questo protocollo dimostra gli effetti dei parametri NTA alterati sui risultati ottenuti. Un metodo standardizzato contribuirà ad aumentare il rigore e la riproducibilità nell'analisi NTA.L'analisi del campione in una cuvetta consente di acquisire un campione statisticamente casuale in ogni video. Ciò si traduce in dati più riproducibili e nella visualizzazione di particelle su un'ampia gamma di dimensioni. Poiché ottenere un campione nell'intervallo di concentrazione delle particelle raccomandato può essere difficile, assicurarsi di eseguire una diluizione seriale per identificare il fattore di diluizione ideale.A dimostrare la procedura sarà Kungheng Cai, dottorando del laboratorio di Anthony Ferrante. Per preparare la cuvetta per l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle, coprire lo spazio di lavoro con un materiale privo di lanugine per evitare che le fibre entrino nelle cuvette. Indossando i guanti, posizionare una cuvetta contenente una barra di agitazione sulla maschera magnetica a cuvette.Utilizzare uno strumento gancio per posizionare l'inserto nella cuvetta con la tacca dell'inserto visibile nella parte anteriore della cuvetta. Utilizzare una pipetta per aggiungere lentamente da 400 a 500 microlitri di vescicole extracellulari purificate sulla cuvetta attraverso il foro nell'inserto e mescolare il campione pipettando delicatamente senza introdurre bolle d'aria, quindi tappare la cuvetta, picchiettando le bolle se necessario e utilizzare un panno privo di lanugine per pulire la superficie esterna della cuvetta. Per analizzare la concentrazione di particelle del diluente o di un campione, accendere la postazione di lavoro e lo strumento del computer e avviare il programma di analisi del tracciamento delle particelle.Quando richiesto, fare clic su NTA e aprire la scheda di registrazione. Seguire le istruzioni visualizzate per compilare tutte le informazioni di esempio necessarie. Per l'analisi del tracciamento EV, impostare il diluente su PBS.La salinità si auto-popolerà al 9% Per ottenere la concentrazione di particelle di diluente o campione, aprire il coperchio dello strumento e rimuovere il cappuccio protettivo che copre dove verrà posizionata la cuvetta. Caricare la cuvetta nello strumento nel corretto orientamento con la tacca dell'inserto rivolto verso la fotocamera e sostituire il cappuccio e il coperchio dello strumento. Fare clic sulla freccia di streaming per accendere la fotocamera e fare clic sulla freccia chevron per espandere le impostazioni di registrazione.Regolare la messa a fuoco fino a quando le particelle relativamente piccole sono chiaramente visibili. Per impostare l'analisi per una piccola quantificazione EV, impostare la frequenza fotogrammi su 30 fotogrammi al secondo, l'esposizione a 15 millisecondi, il tempo di agitazione a cinque secondi, il tempo di attesa a tre secondi, le potenze laser blu, verde e rosso rispettivamente a 210, 12 e 8 milliwatt, i fotogrammi per video a 300 e il guadagno a 30 decibel. Regolare la messa a fuoco fino a quando le particelle relativamente piccole sono chiaramente visibili.Aumentare lo zoom e / o il guadagno può aiutare con la messa a fuoco delle particelle. Ma se aumenti il guadagno, ricorda di impostarlo su 30 decibel prima della registrazione. Una volta che le particelle sono a fuoco, impostare l'impostazione dello zoom su 0,5X per risparmiare larghezza di banda e per evitare la perdita di fotogrammi e fare clic su Registra per iniziare a registrare il video.Quando viene visualizzato un messaggio che indica che i video sono stati registrati, fare clic su OK per completare la registrazione e selezionare la scheda processo. Se particelle molto grandi erano visibili in qualsiasi video durante la registrazione, passare alla directory dei video registrati e rimuovere qualsiasi video problematico prima dell'elaborazione. Selezionare la casella disattiva override rilevamento audio e impostare il diametro della feature su 30.Fare clic su Processo per avviare l'elaborazione video e visualizzare un grafico di distribuzione in tempo reale. Al termine dell'elaborazione, fare clic su OK e selezionare la scheda Di stampa. Per i veicoli elettrici, visualizzare il grafico principale come silice del cestino del registro.Altre caratteristiche del grafico, come la modifica dell'asse x per impostare l'area per l'integrazione della figura prodotta, possono essere personalizzate. Per creare un report PDF dei risultati, fare clic sul pulsante report. Verranno visualizzati la media, la mediana, la dimensione del modo e la concentrazione regolate per il fattore di diluizione e la larghezza di distribuzione.L'NTA del diluente deve essere eseguito prima di qualsiasi campione in modo che la concentrazione di questo bianco possa essere sottratta dalla concentrazione di particelle del campione EV. Per pulire le cuvette dopo l'analisi, svuotare la cuvetta e riempire completamente le cuvette da 10 a 15 volte con acqua deionizzata e le tre volte con etanolo al 70-100% per rimuovere eventuali campioni residui. Asciugare l'esterno delle cuvette con un panno in microfibra privo di lanugine e asciugare l'interno con uno spolverino ad aria compressa.Per pulire gli inserti e mescolare le barre, mettere i materiali in un flaconcino di vetro a scintillazione contenente dal 70 al 100% di etanolo e agitare vigorosamente il flaconcino. Quindi sciacquare gli inserti e mescolare le barre in acqua deionizzata con agitazione come dimostrato e asciugarle con panni privi di lanugine. Dopo l'essiccazione, mettere immediatamente tutti i componenti puliti in magazzino fino alla successiva analisi.Prima di eseguire un'analisi, la calibrazione dello strumento è stata testata utilizzando perline di polistirene per garantire la validità dei dati acquisiti. Come osservato, lo strumento di tracciamento delle particelle ha riportato con precisione le dimensioni delle perle manodisperse a 100 nanometri, ma ha riportato solo da vicino la dimensione delle perle da 400 nanometri. Pertanto, le impostazioni dello strumento per questo protocollo erano più accurate per le particelle più piccole, più vicine a 100 nanometri di dimensione.Utilizzando queste impostazioni, la concentrazione di particelle riportata scala di conseguenza con il fattore di diluizione dimostrando che lo strumento è in grado di rilevare con precisione la concentrazione di particelle in varie diluizioni con poca variabilità tra replicanti tecnici. La diluizione ottimale per un campione EV derivato da 4,41 volte 10 a 10 per millilitro di tessuto di topo derivato da tessuto di topo è stata determinata tra 1.000 e 3.000. In questa analisi, l'aumento del guadagno ha aumentato la sensibilità della fotocamera, consentendo un aumento della visualizzazione di un numero maggiore di particelle più piccole.L'aumento della potenza del laser blu da 70 a 210 milliwatt mantenendo costanti le potenze laser verdi e rosse ha spostato la dimensione media delle particelle riportata da 122 a 105 nanometri e ha aumentato la concentrazione totale di particelle riportata da 1,1 volte 10 all'ottavo a 1,7 volte 10 all'ottavo. L'aumento della potenza del laser rosso ha aumentato la dimensione media delle particelle riportata da 175 a 246 nanometri e ha diminuito la concentrazione totale di particelle riportata. L'aumento della potenza del laser verde ha comportato una diminuzione della dimensione media delle particelle riportata e un aumento della concentrazione totale di particelle riportata.Trovare la giusta diluizione per posizionare un campione all'interno del campo di rilevamento ottimale può richiedere alcuni tentativi per ciascun campione. La pulizia delle cuvette richiede anche una manipolazione molto attenta. Si consiglia di applicare più di un metodo ortogonale per le misurazioni delle dimensioni delle particelle EV e della concentrazione.Per caratterizzare i veicoli elettrici è inoltre possibile eseguire la diffusione dinamica della luce, il rilevamento di impulsi resistivi, la microscopia elettronica a trasmissione elettronica e il rilevamento della riflettanza interferometrica a singola particella.

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