Name: nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles
Uploaded: 2021-03-28T14:00:00
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이 작품은 국립 보건원 (ES030973-01A1, R01ES025225, R01DK066525, P30DK026687, P30DK063608)에 의해 지원되었습니다. 우리는 제프리 바디콤, 호리바 인스트루먼트 박사, 악기 를 보정하는 그의 도움을 위해 통합 인정합니다.

이러한 샘플의 모든 작업은 기관 동물 관리 및 사용 위원회 및 기관 검토 위원회 지침에 따라 수행되었습니다. NTA 메서드에 대한 회로도 개요는 도 2에묘사됩니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62447/62447fig02.jpg"> 그림 2: 입자 추적 기기를 사용하는 NTA 메서드개요입니다. 샘플은 ...

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	<li>Colombo, M., Raposo, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+secretion,+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).</li><li>Hessvik, N. P., Llorente, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+knowledge+on+exosome+biogenesis+and+release.">Current knowledge on exosome biogenesis and release.</a> Cellular and molecular life sciences: CMLS. 75, 193-208 (2018).</li><li>Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. 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Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes).</a> The Journal of Biological Chemistry. 262, 9412-9420 (1987).</li><li>Th&#233;ry, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses.">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).</li><li>Y&#225;&#241;ez-M&#243;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).</li><li>Lo Cicero, A., Stahl, A., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+shuffling+intercellular+messages:+for+good+or+for+bad.">Extracellular vesicles shuffling intercellular messages: for good or for bad.</a> Current Opinion in Cell Biology. 35, 69-77 (2015).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200, 373-383 (2013).</li><li>Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. 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Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 89, 123-134 (2016).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Extracellular+Vesicles:+General+Methodologies+and+Latest+Trends.">Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends.</a> BioMed Research International. 2018, 1-27 (2018).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li><li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Desd&#237;n-Mic&#243;, G., Mittelbrunn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+exosomes+in+the+protection+of+cellular+homeostasis.">Role of exosomes in the protection of cellular homeostasis.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 11, 127-134 (2017).</li><li>Kanemoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+body+formation+enhancement+and+exosome+release+during+endoplasmic+reticulum+stress.">Multivesicular body formation enhancement and exosome release during endoplasmic reticulum stress.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 480, 166-172 (2016).</li><li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+extract+induced+exosome+release+is+mediated+by+depletion+of+exofacial+thiols+and+can+be+inhibited+by+thiol-antioxidants.">Cigarette smoke extract induced exosome release is mediated by depletion of exofacial thiols and can be inhibited by thiol-antioxidants.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 108, 334-344 (2017).</li><li>Saeed-Zidane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+exosome+mediated+molecular+defense+mechanism+in+bovine+granulosa+cells+exposed+to+oxidative+stress.">Cellular and exosome mediated molecular defense mechanism in bovine granulosa cells exposed to oxidative stress.</a> PloS One. 12, 0187569 (2017).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stress-dependent+autophagy+component+release+via+extracellular+nanovesicles+in+tumor+cells.">Mechanical stress-dependent autophagy component release via extracellular nanovesicles in tumor cells.</a> ACS Nano. 13, 4589-4602 (2019).</li><li>King, H. W., Michael, M. Z., Gleadle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic+enhancement+of+exosome+release+by+breast+cancer+cells.">Hypoxic enhancement of exosome release by breast cancer cells.</a> BMC Cancer. 12, 421 (2012).</li><li>Bonzini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+particulate+matter+exposure+induces+extracellular+vesicle+release+in+overweight+subjects.">Short-term particulate matter exposure induces extracellular vesicle release in overweight subjects.</a> Environment Research. 155, 228-234 (2017).</li><li>Neri, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particulate+matter+induces+prothrombotic+microparticle+shedding+by+human+mononuclear+and+endothelial+cells.">Particulate matter induces prothrombotic microparticle shedding by human mononuclear and endothelial cells.</a> Toxicology In Vitro. 32, 333-338 (2016).</li><li>Flaherty, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lipase-independent+pathway+of+lipid+release+and+immune+modulation+by+adipocytes.">A lipase-independent pathway of lipid release and immune modulation by adipocytes.</a> Science. 363, 989-993 (2019).</li><li>van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles.">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 213-228 (2018).</li><li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7, 780-788 (2011).</li><li>Saveyn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+particle+size+distribution+determination+by+nanoparticle+tracking+analysis+based+on+2-D+Brownian+dynamics+simulation.">Accurate particle size distribution determination by nanoparticle tracking analysis based on 2-D Brownian dynamics simulation.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 352, 593-600 (2010).</li><li>Vander Meeren, P., Kasinos, M., Saveyn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+two-dimensional+Brownian+motion+dynamics+in+applying+nanoparticle+tracking+analysis.">Relevance of two-dimensional Brownian motion dynamics in applying nanoparticle tracking analysis.</a> Methods in Molecular Biology. , 525-534 (2012).</li><li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+evaluation+of+Nanoparticle+Tracking+Analysis+(NTA)+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates.">Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27, 796-810 (2010).</li><li>Bachurski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+measurements+with+nanoparticle+tracking+analysis+-+An+accuracy+and+repeatability+comparison+between+NanoSight+NS300+and+ZetaView.">Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1596016 (2019).</li><li>Varga, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hollow+organosilica+beads+as+reference+particles+for+optical+detection+of+extracellular+vesicles.">Hollow organosilica beads as reference particles for optical detection of extracellular vesicles.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16, 1646-1655 (2018).</li><li>Serrano-Pertierra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Current+analytical+techniques+for+detection+and+quantification.">Extracellular vesicles: Current analytical techniques for detection and quantification.</a> Biomolecules. 10, (2020).</li><li>Maguire, C. M., R&#246;sslein, M., Wick, P., Prina-Mello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+particles+in+solution+-+a+perspective+on+light+scattering+and+comparative+technologies.">Characterisation of particles in solution - a perspective on light scattering and comparative technologies.</a> Science and Technology of Advanced Materials. 19, 732-745 (2018).</li><li>Bohren, C. F., Huffman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , (1983).</li></ol>

여기서, 우리는 다양한 입자 크기의 크기 분포를 동시에 측정하고 다분산 샘플에서 총 EV 농도를 측정하는 NTA의 NTA 프로토콜을 시연한다. 이 연구에서는 마우스 페리고나달 지방 조직과 인간 혈장이 EV의 공급원으로 사용되었습니다. 그러나, 혈청, 소변, 타액, 모유, 양수 및 세포 배양 과 같은 다른 조직 또는 생물학적 유체로부터 분리된 전기자동차도 NTA에 사용될 수 있다. 폴리스티렌 비드 표준의...

세포외 소포(Ev)는 거의 모든 세포 유형 1에 의해 분비되는 작은 (0.03-2 μm) 막 결합소포이다. 그들은 종종 방출 및 크기2의그들의 기계장치에 따라 "엑소좀", "microvesicles" 또는 "apoptotic 바디"로 불립니다. 처음에는 전기자동차가 항상성을 유지하기 위해 세포에서 폐기물을 제거하는 수단이라고생각되었지만,우리는 이제 DNA, RNA(mRNA, microRNA), 지질 및 단백질4,5를 포함한 분자 물질의 전송을 통해 세포간 통신에 참여할 수 있다는 것을 알고 있으며, 정상 생리학뿐만 아니라 정상적인 생리학의 중요한 조절제라는 것을알고 있습니다. 5,6,7,8.
다른곳에서 설명 된 다른 9,10,11,12에설명 된 전기 를 분리하고 정량화하는 많은 다른 방법이 있습니다. EV의 소스뿐만 아니라 사용되는 격리 프로토콜은 EV 수율과 순도에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 엑소좀 격리를 위한 "금본위제" 접근법으로 오랫동안 고려되었던 차동 원심분리조차도, 이후 얻어진 EV 인구에 영향을 미치는 실질적인 변동성의 대상이 될 수 있으며, 다운스트림분석(13). 따라서, EV 절연 및 정량화를 위한 다양한 방법론을 통해문헌(14)에보고된 실험결과를 비교, 재현 및 해석하기가 어렵다. 또한, EV 방출은 세포 조건 또는 다양한 외부 요인에 의해 조절될 수 있다. 그것은 EV 세포 스트레스에 대 한 세포를 보호 하 여 세포 항상성을 유지 에 역할을 제안 되었습니다15,여러 연구는 세포 스트레스 EV 분 비를 자극 하는 것으로 나타났습니다. 예를 들어, 증가된 EV 방출은 저산소증, 폐막성 망막 응력, 산화 스트레스, 기계적 스트레스, 담배 연기 추출물 및 미립자 대기 오염16,17,18, 19,20,21,22에세포 노출 후 보고되었다. EV 릴리스는 또한 생체 내에서 수정 된 것으로 나타났습니다. 16시간 동안 고지방 식단또는 금식을 실시한 마우스는 더 많은 지방외 식EV(23)를방출한다. 특정 치료 또는 조건이 EV 릴리스를 변경하는지 여부를 조사하려면 EV 수를 정확하게 결정해야 합니다. EV 크기 분포의 평가는 또한 EV의 주요 세포 전원점(예를 들어, 플라즈마 멤브레인 대 플라즈마 멤브레인의 신진을 가진 후기 내분/다중 혈관 체의 융합)를 나타낼 수있다. 따라서, 연구중인 EV 준비의 총 농도 및 크기 분포를 정확하게 측정하는 견고한 방법이 필요하다.
용액에서 EV의 시각화 및 특성화를 위한 신속하고 매우 민감한 방법은 나노입자 추적 분석(NTA)입니다. 이 방법의 원리에 대한 상세한 설명및 EV 크기 및 농도의 평가를 위한 대체 방법과 비교한 것은 이전에25,26,27,28에기술되었다. 간단히 말해서 NTA 측정 중에 전기 는 레이저 빔으로 조사 될 때 산란 된 빛에 의해 시각화됩니다. 흩어진 빛은 입자 움직임을 기록하는 카메라에 현미경에 의해 집중됩니다. NTA 소프트웨어는 각 입자의 임의열 모션을 추적, 브라우니아 모션으로 알려진, 스토크스 - 아인슈타인 방정식을 사용하여 각 입자의 크기를 계산하는 데 사용되는 확산 계수를 결정합니다. NTA는 2011년25년생물학적 샘플에서 전기자동차의 측정에 처음 적용되었다. 최근까지, 다른 NTA 기술의 상당한 한계를 극복하기 위해 새로운 하드웨어 및 소프트웨어 솔루션의 조합을 사용하는 ViewSizer 3000 (이하 입자 추적 기기라고함)의 도입까지 상용 NTA 악기29를 제공하는 두 개의 주류 회사가 있었다.
입자 추적 기기는 브라우니아 운동을 분석하여 액체 샘플의 나노 입자를 특성화하고 중력 침전을 분석하여 더 큰 미크론 크기의 입자를 특성화합니다. 3개의 레이저 광원(450nm, 520nm, 635nm)을 포함하는 이 계측기의 독특한 광학 시스템은 연구원이 다양한 입자 크기(예: 엑소좀, 마이크로베스캔들)를 동시에 분석할 수 있도록 합니다. 계측기 설정의 회로도가 도 1에표시됩니다.
여기서는 새로운 NTA 계측기를 사용하여 격리된 마우스 및 인간 전기의 입자 크기 분포 및 농도 측정을 수행하는 방법을 시연합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62447/62447fig01.jpg"> 그림 1: 입자 추적 기기 광학 시스템. NTA 계측기는 450nm, 520nm, 635nm의 세 레이저를 사용하여 입자를 조명합니다. 개별 입자에서 흩어져 있는 빛의 비디오 녹화는 큐벳에서 90° 방향의 디지털 비디오 카메라에 의해 감지되고 추적됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62447/62447fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X dPBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0119-1000</td>
			<td>To dilute samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 nm bead standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3100A</td>
			<td>To test ViewSizer 3000 calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 nm bead standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3400A</td>
			<td>To test ViewSizer 3000 calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>To filter PBS diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collection tubes, 2 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19201</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed air duster</td>
			<td>DustOff</td>
			<td>DPSJB-12</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette insert</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette jig</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>To align magnetic stir bar while placing inserts inside cuvette; Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>De-ionized water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0201-1000</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer with monitor, keyboard, mouse, and all necessary cables</td>
			<td>Dell</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70-100%)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>-</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoQuick ULTRA</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>EQULTRA-20A-1</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass scintillation vials with lids</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B780020</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#34;Hook&#34; tool</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-free microfiber cloth</td>
			<td>Texwipe</td>
			<td>TX629</td>
			<td>To clean cuvettes and cover work surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363344</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bar</td>
			<td>Sp Scienceware</td>
			<td>F37119-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suprasil Quartz cuvette with cap</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>AG1000-0544</td>
			<td>Initially provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViewSizer 3000</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Nanoparticle tracking instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles

세포 외 소포 (EV)의 생리학적 및 병리학적 역할은 점점 더 인식되고 있으며, EV 분야는 빠르게 진화하는 연구 영역으로 만듭니다. EV 격리를 위한 다양한 방법이 있으며, 각각 은하류 수율과 EV순도에 영향을 미치는 고유한 장점과 단점이 있습니다. 따라서 선택한 방법에 의해 지정된 소스로부터 분리된 EV 준비의 특성화는 다운스트림 결과를 해석하고 실험실 전체의 결과를 비교하는 데 중요합니다. 질병 상태에 의해 또는 외부 조건에 응하여 변경될 수 있는 전기 의 크기와 양을 결정하기 위한 각종 방법이 존재합니다. 나노 입자 추적 분석 (NTA)은 개별 EV의 높은 처리량 분석에 사용되는 저명한 기술 중 하나입니다. 여기서, 우리는 현장에서 주요 발전을 나타내는 NTA에 대한 획기적인 기술을 사용하여 마우스 페리고나달 지방 조직 및 인간 플라즈마로부터 분리 된 전기 의 정량화 및 크기 측정을위한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 결과는 이 방법이 전송 전자 현미경검사법에 의해 확인된 바와 같이 다른 방법을 사용하여 다른 소스로부터 분리된 전기에 대한 재현 가능하고 유효한 총 입자 농도 및 크기 분포 데이터를 제공할 수 있음을 보여준다. NTA에 대한이 악기의 적응은 EV 연구에서 엄격과 재현성을 높이기 위해 NTA 방법의 표준화의 필요성을 해결합니다.

이 데모 전에, 계측기의 교정은 폴리스티렌 비드 표준의 크기 분포를 측정하여 획득 된 데이터의 유효성을 보장하기 위해 먼저 테스트되었습니다. 기본 기록 매개 변수및 이 프로토콜에 권장되는 처리 설정을 사용하여 100nm 및 400 nm 구슬의 크기 분포를 테스트했습니다(그림8).
100 nm 폴리스티렌 비드 표준의 경우 4.205 x 107 입자 /mL의 농도를 측정하...

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Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

우리는 마우스 perigonadal 지방 조직 및 인간 혈장에서 분리된 세포외 소포의 크기 분포 및 총 입자 농도를 추정하기 위하여 새로운 나노 입자 추적 분석 계기를 사용하는 방법을 보여줍니다.

세포외 소포의 정량화 및 크기 측정을 위한 나노 입자 추적 분석

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

NTA 결과는 작업자 편향에 매우 취약합니다. 이 프로토콜은 변경된 NTA 매개 변수가 얻은 결과에 미치는 영향을 보여줍니다. 표준화된 방법은 NTA 분석에서 엄격성과 재현성을 높이는 데 도움이 됩니다.큐벳에서 샘플을 분석하면 각 비디오에서 통계적으로 임의의 샘플을 캡처할 수 있습니다. 이로 인해 다양한 크기에 걸쳐 더 재현 가능한 데이터와 파티클의 시각화가 생성됩니다. 권장 입자 농도 범위에서 샘플을 얻는 것이 어려울 수 있기 때문에 이상적인 희석 계수를 식별하기 위해 직렬 희석을 수행해야합니다.절차를 시연하는 것은 앤서니 페란테의 실험실에서 박사 과정 학생인 쿤응 카이(Kungheng Cai)가 될 것입니다. 나노 입자 추적 분석을 위한 큐벳을 준비하려면 작업 공간을 보풀이 없는 재료로 덮어 섬유가 큐벳에 유입되는 것을 방지합니다. 장갑을 끼고, 교반 바가 들어 있는 큐벳을 마그네틱 큐벳 지그 위에 놓습니다.후크 도구를 사용하여 큐벳 의 전면에 인서트 노치가 보이는 큐벳에 삽입을 넣습니다. 파이펫을 사용하여 400~500마이크로리터의 정제된 세포외 소포를 삽입구멍을 통해 큐벳에 천천히 추가하고 기포를 도입하지 않고 부드럽게 피펫팅하여 샘플을 혼합한 다음, 큐벳을 캡하고 필요에 따라 거품을 두드리고 보풀이 없는 천을 사용하여 큐벳의 외부 표면을 닦아냅니다. 희석제 또는 샘플의 입자 농도를 분석하려면 컴퓨터 워크스테이션과 계측기를 켜고 입자 추적 분석 프로그램을 시작합니다.메시지가 표시되면 NTA를 클릭하고 레코딩 탭을 엽니다. 화면 의 지침을 따라 필요한 모든 샘플 정보를 작성합니다. EV 추적 분석을 위해 희석제를 PBS로 설정합니다.살리닌성은 희석제 또는 시료 입자 농도를 얻기 위해 9%로 자동 채웁니다, 기기 뚜껑을 열고 큐벳이 배치될 곳에 보호 캡 덮개를 제거합니다. 큐벳을 올바른 방향으로 기기에 카메라를 향한 인서드의 노치로 로드하고 캡과 악기 뚜껑을 교체합니다. 스트리밍 화살표를 클릭하여 카메라를 켜고 쉐브론 화살표를 클릭하여 레코드 설정을 확장합니다.상대적으로 작은 입자가 명확하게 표시될 때까지 초점을 조정합니다. 작은 EV 정량화에 대한 분석을 설정하려면 프레임 속도를 초당 30 프레임으로 설정하고, 노출 시간을 15밀리초로 설정하고, 교반 시간을 5초로, 대기 시간3초, 파란색, 녹색 및 빨간색 레이저 파워를 각각 210, 12 및 8밀리와트로 설정하고, 비디오당 프레임을 300으로 설정하고, 30데시벨이 되는 데 게인합니다. 상대적으로 작은 입자가 명확하게 표시될 때까지 초점을 조정합니다.줌 및/또는 게인을 늘리면 파티클 초점에 도움이 될 수 있습니다. 그러나 이득을 늘리면 녹음 하기 전에 30 데시벨로 설정해야 합니다. 파티클이 포커스가 되면 확대/축소 설정을 0.5배로 설정하여 대역폭을 절약하고 손실 프레임및 클릭 레코드를 방지하여 비디오 녹화를 시작합니다.동영상이 녹화되었음을 알리는 프롬프트가 나타나면 확인을 클릭하여 녹화를 완료하고 프로세스 탭을 선택합니다. 녹화 하는 동안 모든 비디오에 매우 큰 파티클을 표시 하는 경우, 녹화 된 비디오의 디렉토리로 이동 하 고 처리 하기 전에 문제가 비디오를 제거 합니다. 비활성화된 오디오 감지 재정의 상자를 확인하고 피쳐 직경을 30으로 설정합니다.프로세스를 클릭하여 비디오 처리를 시작하고 라이브 배포 그래프를 봅니다. 처리가 완료되면 확인을 클릭하고 플롯 탭을 선택합니다. EV의 경우 주 차트를 로그 빈 실리카로 표시합니다.생성된 그림의 통합 영역을 설정하기 위해 x축을 변경하는 것과 같은 그래프의 다른 피쳐를 사용자 지정할 수 있습니다. 결과에 대한 PDF 보고서를 만들려면 보고서 단추를 클릭합니다. 희석 계수 및 분포 폭에 맞게 조정된 평균, 중앙값, 모드 크기 및 농도가 표시됩니다.희석제의 NTA는 이 블랭크의 농도가 EV 샘플 입자 농도로부터 빼질 수 있도록 임의의 시료 전에 수행해야 한다. 분석 후 큐벳을 청소하려면 큐벳을 비우고 큐벳을 10~15회 디온화된 물로 완전히 채우고 잔류 시료를 제거하기 위해 70~100%의 에탄올로 3회 를 채웁니다. 보풀이 없는 마이크로 화이버 천으로 큐벳의 바깥쪽을 말리고 압축 공기 더스터로 내부를 건조시다.인서트를 청소하고 바를 저어주려면 70~100%에탄올이 들어있는 유리 신경병 유리병에 재료를 넣고 유리병을 힘차게 흔들어 줍니다. 그런 다음 인서트를 헹구고 바에 탈이온화된 물에 몸을 흔들어 보풀이 없는 천으로 말리십시오. 건조 후, 즉시 다음 분석까지 모든 깨끗한 구성 요소를 저장에 배치합니다.분석을 수행하기 전에, 계측기 교정은 획득 된 데이터의 유효성을 보장하기 위해 폴리스티렌 구슬을 사용하여 테스트되었습니다. 관찰된 바와 같이, 입자 추적 기기는 100나노미터 의 마노분산 구슬의 크기를 정확하게 보고했지만, 400나노미터 구슬의 크기만 면밀히 보고하였다. 따라서 이 프로토콜의 계측기 설정은 크기가 100나노미터에 가까운 작은 입자에 대해 더 정확했습니다.이러한 설정을 사용하여, 보고된 입자 농도 는 기술 복제자 간의 가변성이 거의 없는 다양한 희석제에서 입자 농도를 정확하게 검출할 수 있음을 입증하는 희석 계수와 함께 비늘 농도 를 배율화합니다. 밀리리터 마우스 조직 유래 EV 샘플당 10번째 입자에 대한 4.41배 10분의 10에 대한 최적 희석은 1, 000 및 3, 000 사이로 결정되었다. 이 분석에서 게인을 증가시켜 카메라의 감도가 높아져 더 많은 수의 더 작은 입자의 시각화가 증가합니다.녹색 및 빨간색 레이저 전원을 유지하면서 파란색 레이저 전력을 70에서 210 밀리와트로 증가시켜 보고된 평균 입자 크기를 122에서 105나노미터로 이동하고 보고된 총 입자 농도를 1.1배에서 8배 1.7배로 10배 로 증가시켰습니다. 적색 레이저의 전력을 증가시켜 보고된 평균 입자 크기가 175에서 246나노미터로 증가하고 보고된 총 입자 농도가 감소하였다. 녹색 레이저 전력을 증가시켜 보고된 평균 입자 크기가 감소하고 보고된 총 입자 농도가 증가했습니다.최적의 검출 범위 내에 샘플을 배치할 적절한 희석을 찾는 것은 각 샘플에 대해 몇 번의 시도를 할 수 있습니다. 큐벳 청소에는 세심한 취급이 필요합니다. EV 입자 크기 및 농도 측정을 위해 둘 이상의 직교 방법을 적용하는 것이 좋습니다.다이나믹 광 산란, 저항 펄스 감지, 투과 전자 현미경 및 단일 입자 간섭 반사도 이미징 감지도 전기를 특성화하기 위해 수행될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

동력학 및 구조 기능 분석의 선호도 결정에 대한 올바른 단백질 농도의 중요성

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

연구

생물학

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

엑소 정량화 및 크기 측정을위한 혁신적인 방법

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

배양 된 세포의 내부와 세포 외 아스 코르 빈산의 결정에 대한 신속하고 특정 마이크로 분석

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

유동 세포 계측법을 사용하여 세포 외 소포의 분석을위한 기술

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Extracellular 소포 세포 조절 미디어에서의 Cytometric 분석 흐름

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

예쁜꼬마선충의 정화 및 분석 세포외 소포

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes

형광 표기 매크로피노좀의 정량화를 위한 자동화된 이미징 및 분석

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and ...

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

공초점 현미경 화상 진찰 분석을 통해 세포외 소포 Uptake 분석

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular ...

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

3 차원에서 세포 외 소포의 직접 스토카스틱 광학 재건 현미경 검사

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

대장균 및 다른 박테리아로부터의 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...