Name: nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles
Uploaded: 2021-03-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (ES030973-01A1, R01ES025225, R01DK066525, P30DK026687, P30DK063608). Vi anerkjenner Jeffrey Bodycomb, ph.d. i HORIBA Instruments Incorporated for hans hjelp til å kalibrere instrumentet.

Alt arbeid med disse prøvene ble utført i samsvar med institusjonell dyrepleie- og brukskomité og institusjonelle gjennomgangsstyreretningslinjer. En skjematisk oversikt over NTA-metoden er vist i figur 2.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62447/62447fig02.jpg"> Figur 2: Oversikt over NTA-metoden ved hjelp av partikkelsporingsinstrumentet. Prøven fremsti...

<ol>
	<li>Colombo, M., Raposo, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+secretion,+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).</li><li>Hessvik, N. P., Llorente, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+knowledge+on+exosome+biogenesis+and+release.">Current knowledge on exosome biogenesis and release.</a> Cellular and molecular life sciences: CMLS. 75, 193-208 (2018).</li><li>Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+formation+during+reticulocyte+maturation.+Association+of+plasma+membrane+activities+with+released+vesicles+(exosomes).">Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes).</a> The Journal of Biological Chemistry. 262, 9412-9420 (1987).</li><li>Th&#233;ry, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses.">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).</li><li>Y&#225;&#241;ez-M&#243;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).</li><li>Lo Cicero, A., Stahl, A., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+shuffling+intercellular+messages:+for+good+or+for+bad.">Extracellular vesicles shuffling intercellular messages: for good or for bad.</a> Current Opinion in Cell Biology. 35, 69-77 (2015).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200, 373-383 (2013).</li><li>Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+extracellular+organelles+important+in+intercellular+communication.">Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication.</a> Journal of Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+and+technologies+for+exosome+isolation+and+characterization.">Methods and technologies for exosome isolation and characterization.</a> Small Methods. 2, 1800021 (2018).</li><li>Szatanek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+methods+of+choice+for+extracellular+vesicles+(EVs)+characterization.">The methods of choice for extracellular vesicles (EVs) characterization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).</li><li>Erdbr&#252;gger, U., Lannigan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+challenges+of+extracellular+vesicle+detection:+A+comparison+of+different+techniques.">Analytical challenges of extracellular vesicle detection: A comparison of different techniques.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 89, 123-134 (2016).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Extracellular+Vesicles:+General+Methodologies+and+Latest+Trends.">Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends.</a> BioMed Research International. 2018, 1-27 (2018).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li><li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Desd&#237;n-Mic&#243;, G., Mittelbrunn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+exosomes+in+the+protection+of+cellular+homeostasis.">Role of exosomes in the protection of cellular homeostasis.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 11, 127-134 (2017).</li><li>Kanemoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+body+formation+enhancement+and+exosome+release+during+endoplasmic+reticulum+stress.">Multivesicular body formation enhancement and exosome release during endoplasmic reticulum stress.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 480, 166-172 (2016).</li><li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+extract+induced+exosome+release+is+mediated+by+depletion+of+exofacial+thiols+and+can+be+inhibited+by+thiol-antioxidants.">Cigarette smoke extract induced exosome release is mediated by depletion of exofacial thiols and can be inhibited by thiol-antioxidants.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 108, 334-344 (2017).</li><li>Saeed-Zidane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+exosome+mediated+molecular+defense+mechanism+in+bovine+granulosa+cells+exposed+to+oxidative+stress.">Cellular and exosome mediated molecular defense mechanism in bovine granulosa cells exposed to oxidative stress.</a> PloS One. 12, 0187569 (2017).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stress-dependent+autophagy+component+release+via+extracellular+nanovesicles+in+tumor+cells.">Mechanical stress-dependent autophagy component release via extracellular nanovesicles in tumor cells.</a> ACS Nano. 13, 4589-4602 (2019).</li><li>King, H. W., Michael, M. Z., Gleadle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic+enhancement+of+exosome+release+by+breast+cancer+cells.">Hypoxic enhancement of exosome release by breast cancer cells.</a> BMC Cancer. 12, 421 (2012).</li><li>Bonzini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+particulate+matter+exposure+induces+extracellular+vesicle+release+in+overweight+subjects.">Short-term particulate matter exposure induces extracellular vesicle release in overweight subjects.</a> Environment Research. 155, 228-234 (2017).</li><li>Neri, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particulate+matter+induces+prothrombotic+microparticle+shedding+by+human+mononuclear+and+endothelial+cells.">Particulate matter induces prothrombotic microparticle shedding by human mononuclear and endothelial cells.</a> Toxicology In Vitro. 32, 333-338 (2016).</li><li>Flaherty, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lipase-independent+pathway+of+lipid+release+and+immune+modulation+by+adipocytes.">A lipase-independent pathway of lipid release and immune modulation by adipocytes.</a> Science. 363, 989-993 (2019).</li><li>van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles.">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 213-228 (2018).</li><li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7, 780-788 (2011).</li><li>Saveyn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+particle+size+distribution+determination+by+nanoparticle+tracking+analysis+based+on+2-D+Brownian+dynamics+simulation.">Accurate particle size distribution determination by nanoparticle tracking analysis based on 2-D Brownian dynamics simulation.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 352, 593-600 (2010).</li><li>Vander Meeren, P., Kasinos, M., Saveyn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+two-dimensional+Brownian+motion+dynamics+in+applying+nanoparticle+tracking+analysis.">Relevance of two-dimensional Brownian motion dynamics in applying nanoparticle tracking analysis.</a> Methods in Molecular Biology. , 525-534 (2012).</li><li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+evaluation+of+Nanoparticle+Tracking+Analysis+(NTA)+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates.">Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27, 796-810 (2010).</li><li>Bachurski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+measurements+with+nanoparticle+tracking+analysis+-+An+accuracy+and+repeatability+comparison+between+NanoSight+NS300+and+ZetaView.">Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1596016 (2019).</li><li>Varga, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hollow+organosilica+beads+as+reference+particles+for+optical+detection+of+extracellular+vesicles.">Hollow organosilica beads as reference particles for optical detection of extracellular vesicles.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16, 1646-1655 (2018).</li><li>Serrano-Pertierra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Current+analytical+techniques+for+detection+and+quantification.">Extracellular vesicles: Current analytical techniques for detection and quantification.</a> Biomolecules. 10, (2020).</li><li>Maguire, C. M., R&#246;sslein, M., Wick, P., Prina-Mello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+particles+in+solution+-+a+perspective+on+light+scattering+and+comparative+technologies.">Characterisation of particles in solution - a perspective on light scattering and comparative technologies.</a> Science and Technology of Advanced Materials. 19, 732-745 (2018).</li><li>Bohren, C. F., Huffman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , (1983).</li></ol>

Her demonstrerer vi en protokoll for NTA av elbiler for å måle størrelsesfordelingen av et bredt spekter av partikkelstørrelser samtidig og måle total EV-konsentrasjon i en polydisperseprøve. I denne studien ble musperigonadal fettvev og humant plasma brukt som kilde til elbiler. Imidlertid kan elbiler isolert fra andre vev eller biologiske væsker som serum, urin, spytt, morsmelk, fostervann og cellekultur supernatant også brukes til NTA. Målinger av polystyrenperlestandarder sørget for at instrumentet ble rikt...

Ekstracellulære vesikler (ELBILER) er små (0,03-2 μm) membranbundne vesikler utskilt av nesten alle celletyper1. De blir ofte referert til som "eksosomer", "mikrovesicles" eller "apoptotiske kropper" avhengig av deres frigjøringsmekanisme og størrelse2. Mens det først ble antatt at elbiler bare var et middel til å eliminere avfall fra cellen for å opprettholde homeostase3, vet vi nå at de også kan delta i intercellulær kommunikasjon via overføring av molekylært materiale - inkludert DNA, RNA (mRNA, microRNA), lipider og proteiner4,5 - og at de er viktige regulatorer for normal fysiologi samt patologiske prosesser1, 5,6,7,8.
Det finnes mange forskjellige metoder for å isolere og kvantifisere elbiler, som er beskrevet andre steder9,10,11,12. Isolasjonsprotokollen som brukes, så vel som kilden til elbiler, kan i stor grad påvirke EV-utbytte og renhet. Selv differensial sentrifugering, lenge ansett som "gullstandard" tilnærming for eksosomisolasjon, kan bli gjenstand for betydelig variasjon som senere påvirker EV-befolkningen oppnådd og nedstrøms analyser13. Dermed gjør de ulike metodene for EV-isolasjon og kvantifisering det vanskelig å sammenligne, reprodusere og tolke resultater av eksperimenter rapportert i litteraturen14. Videre kan EV-utgivelse reguleres av cellulære forhold eller ulike eksterne faktorer. Det har blitt antydet at elbiler spiller en rolle i å opprettholde cellulær homeostase ved å beskytte celler mot intracellulær stress15, som flere studier har vist at cellulær stress stimulerer EV-sekresjon. For eksempel har økt EV-frigjøring blitt rapportert etter cellulær eksponering for hypoksi, endoplasmisk retikulumspenning, oksidativt stress, mekanisk stress, sigarettrøykekstrakt og partikkelmaterialeluftforurensning 16,17,18,19,20,21,22. EV-utgivelsen har også vist seg å være modifisert in vivo; mus utsatt for et høyt fett diett eller faste i seksten timer utgitt mer adipocyte ELBILER23. For å undersøke om en bestemt behandling eller tilstand endrer EV-utslipp, må antall elbiler bestemmes nøyaktig. Vurdering av EV-størrelsesfordelingen kan også indikere den dominerende subcellulære opprinnelsen til elbiler (f.eks. sammensmelting av sen endosomer/multivesikulære legemer med plasmamembran vs. spirende plasmamembran)24. Dermed er det behov for robuste metoder for å nøyaktig måle den totale konsentrasjonen og størrelsesfordelingen til EV-prep som studeres.
En rask og svært følsom metode for visualisering og karakterisering av elbiler i løsning er nanopartikkelsporingsanalyse (NTA). En detaljert forklaring av prinsippene for denne metoden og sammenligning med alternative metoder for vurdering av EV-størrelse og konsentrasjon er beskrevet tidligere25,26,27,28. Kort sagt, under NTA-måling visualiseres elbiler av lyset spredt når de bestråles med en laserstråle. Det spredte lyset er fokusert av et mikroskop på et kamera som registrerer partikkelbevegelsen. NTA-programvaren sporer den tilfeldige termiske bevegelsen til hver partikkel, kjent som Brownian bevegelse, for å bestemme diffusjonskoeffisienten som brukes til å beregne størrelsen på hver partikkel ved hjelp av Stokes-Einstein-ligningen. NTA ble først brukt på måling av elbiler i et biologisk utvalg i 201125. Inntil nylig var det bare to mainstream-selskaper som tilbyr kommersielle NTA-instrumenter29 frem til innføringen av ViewSizer 3000 (heretter referert til som partikkelsporingsinstrumentet) som bruker en kombinasjon av nye maskinvare- og programvareløsninger for å overvinne betydelige begrensninger i andre NTA-teknikker.
Partikkelsporingsinstrumentet karakteriserer nanopartikler i væskeprøver ved å analysere deres brownske bevegelse og karakteriserer større mikronstore partikler ved å analysere gravitasjonsoppgjør. Dette instrumentets unike optiske system, som inkluderer multispektral belysning med tre laserlyskilder (ved 450 nm, 520 nm og 635 nm), gjør det mulig for forskere å analysere et bredt spekter av partikkelstørrelser (f.eksoser, mikrovesicles) samtidig. Et skjema av instrumentoppsettet vises i figur 1.
Her demonstrerer vi hvordan man utfører partikkelstørrelsesfordeling og konsentrasjonsmålinger av isolert mus og menneskelige elbiler ved hjelp av et nytt NTA-instrument.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62447/62447fig01.jpg"> Figur 1: Optisk system for partikkelsporingsinstrument. NTA-instrumentet lyser opp partikler med tre lasere med følgende bølgelengder: 450 nm, 520 nm, 635 nm. Videoopptak av det spredte lyset fra individuelle partikler oppdages og spores av et digitalt videokamera orientert 90° fra cuvette. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62447/62447fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X dPBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0119-1000</td>
			<td>To dilute samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 nm bead standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3100A</td>
			<td>To test ViewSizer 3000 calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 nm bead standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3400A</td>
			<td>To test ViewSizer 3000 calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>To filter PBS diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collection tubes, 2 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19201</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed air duster</td>
			<td>DustOff</td>
			<td>DPSJB-12</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette insert</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette jig</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>To align magnetic stir bar while placing inserts inside cuvette; Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>De-ionized water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0201-1000</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer with monitor, keyboard, mouse, and all necessary cables</td>
			<td>Dell</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70-100%)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>-</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoQuick ULTRA</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>EQULTRA-20A-1</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass scintillation vials with lids</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B780020</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#34;Hook&#34; tool</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-free microfiber cloth</td>
			<td>Texwipe</td>
			<td>TX629</td>
			<td>To clean cuvettes and cover work surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363344</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bar</td>
			<td>Sp Scienceware</td>
			<td>F37119-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suprasil Quartz cuvette with cap</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>AG1000-0544</td>
			<td>Initially provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViewSizer 3000</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Nanoparticle tracking instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles

De fysiologiske og patofysiologiske rollene til ekstracellulære vesikler (ELBILER) har blitt stadig mer anerkjent, noe som gjør EV-feltet til et raskt utviklende forskningsområde. Det er mange forskjellige metoder for EV-isolasjon, hver med klare fordeler og ulemper som påvirker nedstrømsutbyttet og renheten til elbiler. Å karakterisere EV-prep isolert fra en gitt kilde ved en valgt metode er derfor viktig for tolkning av nedstrømsresultater og sammenligning av resultater på tvers av laboratorier. Det finnes ulike metoder for å bestemme størrelsen og mengden elbiler, som kan endres av sykdomstilstander eller som svar på ytre forhold. Nanopartikkelsporingsanalyse (NTA) er en av de fremtredende teknologiene som brukes til høygjennomstrømningsanalyse av individuelle elbiler. Her presenterer vi en detaljert protokoll for kvantifisering og størrelsesbestemmelse av elbiler isolert fra musperigonadal fettvev og humant plasma ved hjelp av en banebrytende teknologi for NTA som representerer store fremskritt innen feltet. Resultatene viser at denne metoden kan levere reproduserbare og gyldige totale partikkelkonsentrasjons- og størrelsesfordelingsdata for elbiler isolert fra forskjellige kilder ved hjelp av forskjellige metoder, som bekreftet ved transmisjonselektronmikroskopi. Tilpasningen av dette instrumentet for NTA vil adressere behovet for standardisering i NTA-metoder for å øke strenghet og reproduserbarhet i EV-forskning.

Før denne demonstrasjonen ble kalibreringen av instrumentet først testet for å sikre gyldigheten av de oppkjøpte dataene ved å måle størrelsesfordelingen av polystyrenperlestandarder. Vi testet størrelsesfordelingen på 100 nm og 400 nm perler ved hjelp av standard opptaksparametere og behandlingsinnstillingene som anbefales i denne protokollen (Figur 8).
For 100 nm polystyrenperlestandard ble det målt en konsentrasjon på 4,205 x 107 partikler...

Watch this Scientific Journal Video about Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles at JoVE.com

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Vi demonstrerer hvordan man bruker et nytt nanopartikkelsporingsanalyseinstrument for å estimere størrelsesfordelingen og den totale partikkelkonsentrasjonen av ekstracellulære vesikler isolert fra musperigonadal fettvev og humant plasma.

Nanopartikkelsporingsanalyse for kvantifisering og størrelsesbestemmelse av ekstracellulære vesicles

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

NTA-resultater er svært utsatt for operatørbias. Denne protokollen viser effekten av endrede NTA-parametere på oppnådde resultater. En standardisert metode vil bidra til å øke strenghet og reproduserbarhet i NTA-analyse.Ved å analysere prøven i en cuvette kan en statistisk tilfeldig prøve tas opp i hver video. Dette resulterer i mer reproduserbare data og visualisering av partikler over et bredt spekter av størrelser. Som å få en prøve i det anbefalte partikkelkonsentrasjonsområdet kan være vanskelig, må du sørge for å utføre en seriell fortynning for å identifisere den ideelle fortynningsfaktoren.Å demonstrere prosedyren vil være Kungheng Cai, en stipendiat fra Anthony Ferrantes laboratorium. For å forberede cuvette for nanopartikkelsporingsanalyse, dekk arbeidsområdet med et lofritt materiale for å forhindre at fibre kommer inn i cuvettes. Bruk hansker, plasser en cuvette som inneholder en rørestang på den magnetiske cuvette jig.Bruk et krokverktøy til å plassere innsatsen i cuvette med hakket på innsatsen synlig foran på cuvette. Bruk en pipette til sakte å tilsette 400 til 500 mikroliter rensede ekstracellulære vesicles på cuvette gjennom hullet i innsatsen og bland prøven ved å forsiktig pipettere uten å introdusere luftbobler, deretter hette cuvette, tappe ut bobler etter behov og bruk en lofri klut for å tørke den ytre overflaten av cuvette. For å analysere partikkelkonsentrasjonen av fortynningsmiddelet eller en prøve, slå på datamaskinens arbeidsstasjon og instrument og start partikkelsporingsanalyseprogrammet.Når du blir bedt om det, klikker du NTA og åpner innspillingsfanen. Følg instruksjonene på skjermen for å fylle ut all nødvendig eksempelinformasjon. For EV-sporingsanalyse setter du fortynningsmiddelet til PBS.Saltholdigheten vil automatisk fylles til 9%For å oppnå fortynnings- eller prøvepartikkelkonsentrasjonen, åpne instrumentlokket og fjern beskyttelseshetten der cuvette skal plasseres. Legg cuvette i instrumentet i riktig retning med hakket på innsatsen vendt mot kameraet og sett på lokket og instrumentlokket. Klikk streamingpilen for å slå på kameraet, og klikk vinkeltegnpilen for å utvide innspillingsinnstillingene.Juster fokuset til de relativt små partiklene er godt synlige. For å stille inn analysen for en liten EV-kvantifisering, sett bildefrekvensen til 30 bilder per sekund, eksponeringen til 15 millisekunder, røretiden til fem sekunder, ventetiden til tre sekunder, den blå, grønne og røde laseren til henholdsvis 210, 12 og 8 milliwatt, rammene per video til 300 og gevinsten til 30 desibel. Juster fokuset til de relativt små partiklene er godt synlige.Økning av zoom og/eller forsterkning kan hjelpe med partikkelfokusering. Men hvis du øker gevinsten, husk å sette den til 30 desibel før opptak. Når partiklene er i fokus, setter du zoominnstillingen til 0,5X for å spare båndbredde og for å forhindre tap av bilder og klikke på record for å begynne å spille inn videoen.Når det vises en melding om at videoene er spilt inn, klikker du OK for å fullføre innspillingen og velge prosessfanen. Hvis svært store partikler var synlige i en video mens du spilte inn, navigerer du til katalogen over innspilte videoer og fjerner eventuell problematisk video før behandling. Merk av for deaktiver overstyring av lydgjenkjenning og sett funksjonsdiameteren til 30.Klikk prosess for å starte videobehandling og vise et direkte distribusjonsdiagram. Når behandlingen er fullført, klikker du OK og velger tegnefanen. For elbiler viser du hoveddiagrammet som loggbinsiliika.Andre funksjoner i grafen, for eksempel å endre x-aksen for å angi området for integrering av den produserte figuren, kan tilpasses. Hvis du vil opprette en PDF-rapport over resultatene, klikker du rapportknappen. Middelverdien, medianen, modusstørrelsen og konsentrasjonen som er justert for fortynningsfaktoren og fordelingsbredden, vises.NTA for fortynningsmiddelet bør utføres før en prøve, slik at konsentrasjonen av dette tomrom kan trekkes fra EV-prøvepartikkelkonsentrasjonen. For å rengjøre cuvettes etter analyse, tøm cuvette og fyll helt cuvettes 10 til 15 ganger med deionisert vann og de tre ganger med 70 til 100% etanol for å fjerne eventuelle gjenværende prøver. Tørk utsiden av cuvettes med en lofri mikrofiberklut og tørk innsiden med en trykkluftdyster.For å rengjøre innsatsene og rørestengene, plasser materialene i et hetteglass med glassskraintillasjon som inneholder 70 til 100% etanol og rist hetteglasset kraftig. Skyll deretter innsatsene og rør stengene i deionisert vann med risting som demonstrert og tørk dem med lofrie kluter. Etter tørking, plasser umiddelbart alle de rene komponentene i lagring til neste analyse.Før du utfører en analyse, ble instrumentkalibreringen testet ved hjelp av polystyrenperler for å sikre gyldigheten av de oppkjøpte dataene. Som observert rapporterte partikkelsporingsinstrumentet nøyaktig størrelsen på de 100 nanometermanodisperseperlene, men rapporterte bare nøye størrelsen på de 400 nanometerperlene. Derfor var instrumentinnstillingene for denne protokollen mer nøyaktige for mindre partikler, nærmere 100 nanometer i størrelse.Ved hjelp av disse innstillingene skaleres rapporterte partikkelkonsentrasjon tilsvarende med fortynningsfaktoren som viser at instrumentet nøyaktig kan oppdage partikkelkonsentrasjonen ved ulike fortynninger med liten variasjon mellom tekniske replikanter. Den optimale fortynning for en 4,41 ganger 10 til tiende partikler per milliliter mus vev-avledet EV prøve ble fastslått å være mellom 1,000 og 3, 000. I denne analysen økte økningen kameraets følsomhet, noe som gjorde det mulig å visualisere et høyere antall mindre partikler.Å øke den blå laserkraften fra 70 til 210 milliwatt mens du holder de grønne og røde laserkreftene konstant skiftet den rapporterte gjennomsnittlige partikkelstørrelsen fra 122 til 105 nanometer og økte den rapporterte totale partikkelkonsentrasjonen fra 1,1 ganger 10 til åttende til 1,7 ganger 10 til åttende. Økning av kraften til den røde laseren økte den rapporterte gjennomsnittlige partikkelstørrelsen fra 175 til 246 nanometer og reduserte den rapporterte totale partikkelkonsentrasjonen. Økning av den grønne lasereffekten resulterte i en reduksjon i den rapporterte gjennomsnittlige partikkelstørrelsen og en økning i rapportert total partikkelkonsentrasjon.Det kan ta noen få forsøk for hver prøve å finne riktig fortynning for å plassere en prøve innenfor det optimale deteksjonsområdet. Cuvette-rengjøringen krever også ekstra forsiktig håndtering. Vi anbefaler å bruke mer enn én ortogonal metode for EV-partikkelstørrelse og konsentrasjonsmålinger.Dynamisk lysspredning, resistiv pulsmåling, transmisjonselektronmikroskopi og interferometrisk avbildningssensor for enkeltpartikkeler kan også utføres for å karakterisere elbiler.

Research

JoVE Journal

Biology

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

En innovativ metode for Exosome Kvantifisering og størrelse måling

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

En rask og spesifikk Mikro analyse for bestemmelse av Intra-og Ekstracellulær Askorbat i dyrkede celler

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Teknikker for analyse av Ekstracellulær Blemmer ved hjelp av flowcytometri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow Cytometric analyse av ekstracellulære blemmer fra celle-conditioned Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Rensing og analyse av Caenorhabditis elegans Ekstracellulære vesikler

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes

Automatisert avbildning og analyse for kvantifisering av fluorescerende merkede makropinosomer

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and ...

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Ekstracellulær vesicle opptak analyse via confocal mikroskop imaging analyse

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular ...

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

Direkte stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi av ekstracellulære vesicles i tre dimensjoner

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Skalerbar isolasjon og rensing av ekstracellulære vesikler fra Escherichia coli og andre bakterier

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...