Name: nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles
Uploaded: 2021-03-28T14:00:00
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Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (ES030973-01A1, R01ES025225, R01DK066525, P30DK026687, P30DK063608). Reconhecemos Jeffrey Bodycomb, Ph.D. da HORIBA Instruments Incorporated por sua ajuda para calibrar o instrumento.

Todos os trabalhos com essas amostras foram realizados em conformidade com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais e do Conselho de Revisão Institucional. Uma visão geral esquemática do método NTA é retratada na Figura 2.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62447/62447fig02.jpg"> Figura 2: Visão geral do método NTA utilizando o instru...

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic+enhancement+of+exosome+release+by+breast+cancer+cells.">Hypoxic enhancement of exosome release by breast cancer cells.</a> BMC Cancer. 12, 421 (2012).</li><li>Bonzini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+particulate+matter+exposure+induces+extracellular+vesicle+release+in+overweight+subjects.">Short-term particulate matter exposure induces extracellular vesicle release in overweight subjects.</a> Environment Research. 155, 228-234 (2017).</li><li>Neri, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particulate+matter+induces+prothrombotic+microparticle+shedding+by+human+mononuclear+and+endothelial+cells.">Particulate matter induces prothrombotic microparticle shedding by human mononuclear and endothelial cells.</a> Toxicology In Vitro. 32, 333-338 (2016).</li><li>Flaherty, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lipase-independent+pathway+of+lipid+release+and+immune+modulation+by+adipocytes.">A lipase-independent pathway of lipid release and immune modulation by adipocytes.</a> Science. 363, 989-993 (2019).</li><li>van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles.">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 213-228 (2018).</li><li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7, 780-788 (2011).</li><li>Saveyn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+particle+size+distribution+determination+by+nanoparticle+tracking+analysis+based+on+2-D+Brownian+dynamics+simulation.">Accurate particle size distribution determination by nanoparticle tracking analysis based on 2-D Brownian dynamics simulation.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 352, 593-600 (2010).</li><li>Vander Meeren, P., Kasinos, M., Saveyn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+two-dimensional+Brownian+motion+dynamics+in+applying+nanoparticle+tracking+analysis.">Relevance of two-dimensional Brownian motion dynamics in applying nanoparticle tracking analysis.</a> Methods in Molecular Biology. , 525-534 (2012).</li><li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+evaluation+of+Nanoparticle+Tracking+Analysis+(NTA)+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates.">Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27, 796-810 (2010).</li><li>Bachurski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+measurements+with+nanoparticle+tracking+analysis+-+An+accuracy+and+repeatability+comparison+between+NanoSight+NS300+and+ZetaView.">Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1596016 (2019).</li><li>Varga, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hollow+organosilica+beads+as+reference+particles+for+optical+detection+of+extracellular+vesicles.">Hollow organosilica beads as reference particles for optical detection of extracellular vesicles.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16, 1646-1655 (2018).</li><li>Serrano-Pertierra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Current+analytical+techniques+for+detection+and+quantification.">Extracellular vesicles: Current analytical techniques for detection and quantification.</a> Biomolecules. 10, (2020).</li><li>Maguire, C. M., R&#246;sslein, M., Wick, P., Prina-Mello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+particles+in+solution+-+a+perspective+on+light+scattering+and+comparative+technologies.">Characterisation of particles in solution - a perspective on light scattering and comparative technologies.</a> Science and Technology of Advanced Materials. 19, 732-745 (2018).</li><li>Bohren, C. F., Huffman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , (1983).</li></ol>

Aqui, demonstramos um protocolo para nta de EVs medir a distribuição de tamanho de uma ampla gama de tamanhos de partículas simultaneamente e medir a concentração total de EV em uma amostra de polidisperse. Neste estudo, o tecido adiposo do rato perigonadal e o plasma humano foram usados como fonte de EVs. No entanto, EVs isolados de outros tecidos ou fluidos biológicos, como soro, urina, saliva, leite materno, fluido amniótico e supernanato de cultura celular também podem ser usados para NTA. As medições das n...

As vesículas extracelulares (EVs) são pequenas (0,03-2 μm) de vesículas ligadas à membrana secretadas por quase todos os tipos de células1. Eles são frequentemente referidos como "exossomos", "microvesículos" ou "corpos apoptóticos" dependendo de seu mecanismo de liberação e tamanho2. Embora inicialmente se pensasse que os EVs eram simplesmente um meio de eliminar resíduos da célula para manter a homeostase3, agora sabemos que eles também podem participar da comunicação intercelular via transferência de material molecular - incluindo DNA, RNA (mRNA, microRNA), lipídios e proteínas4,5 - e que eles são importantes reguladores da fisiologia normal, bem como processos patológicos1, 5,6,7,8.
Existem muitos métodos diferentes para isolar e quantificar EVs, que foram descritos em outros lugares9,10,11,12. O protocolo de isolamento usado, bem como a fonte de EVs, podem impactar muito o rendimento e a pureza do EV. Mesmo a centrifugação diferencial, considerada por muito tempo a abordagem "padrão-ouro" para o isolamento exóssomo, pode estar sujeita a variabilidade substancial, impactando posteriormente a população de EV obtida e análises a jusante13. Assim, as diferentes metodologias de isolamento e quantificação do EV dificultam a comparação, reprodução e interpretação dos resultados dos experimentos relatados na literatura14. Além disso, a liberação de EV pode ser regulada por condições celulares ou vários fatores externos. Tem sido sugerido que os EVs desempenham um papel na manutenção da homeostase celular protegendo as células contra o estresse intracelular15,como vários estudos têm mostrado que o estresse celular estimula a secreção de EV. Por exemplo, o aumento da liberação de EV foi relatado após exposição celular à hipóxia, estresse órticulo endoplasmático, estresse oxidativo, estresse mecânico, extrato de fumaça de cigarro e poluição atmosférica de material particulado16,17,18,19,20,21,22. A versão eV também foi mostrada como modificada in vivo; camundongos submetidos a uma dieta rica em gordura ou jejum por dezesseis horas liberaram mais EVs adipócitos23. Para investigar se um tratamento ou condição específico altera a liberação do EV, o número de EVs deve ser determinado com precisão. A avaliação da distribuição do tamanho do EV também pode indicar a origem subcelular predominante dos EVs (por exemplo, fusão de endosomes/corpos multivesiculares tardios com a membrana plasmática versus brotação da membrana plasmática)24. Assim, há necessidade de métodos robustos para medir com precisão a concentração total e a distribuição de tamanho da preparação de EV que está sendo estudada.
Um método rápido e altamente sensível para a visualização e caracterização de EVs na solução é a análise de rastreamento de nanopartículas (NTA). Uma explicação detalhada dos princípios deste método e a comparação com métodos alternativos de avaliação do tamanho e concentração de EV foram descritas anteriormente25,26,27,28. Resumidamente, durante a medição da NTA, os EVs são visualizados pela luz espalhada quando são irradiados com um raio laser. A luz dispersa é focada por um microscópio em uma câmera que registra o movimento das partículas. O software NTA rastreia o movimento térmico aleatório de cada partícula, conhecido como movimento browniano, para determinar o coeficiente de difusão que é usado para calcular o tamanho de cada partícula usando a equação de Stokes-Einstein. A NTA foi aplicada pela primeira vez à medição de EVs em uma amostra biológica em 201125. Até recentemente, havia apenas duas empresas tradicionais oferecendo instrumentos NTA comerciais29 até a introdução do ViewSizer 3000 (doravante chamado de instrumento de rastreamento de partículas) que usa uma combinação de novas soluções de hardware e software para superar limitações significativas de outras técnicas NTA.
O instrumento de rastreamento de partículas caracteriza nanopartículas em amostras líquidas analisando seu movimento browniano e caracteriza partículas maiores do tamanho de micron, analisando a fixação gravitacional. O sistema óptico único deste instrumento, que inclui iluminação multiespectral com três fontes de luz laser (a 450 nm, 520 nm e 635 nm), permite que os pesquisadores analisem uma ampla gama de tamanhos de partículas (por exemplo, exosósmos, microvesculas) simultaneamente. Um esquema da configuração do instrumento é mostrado na Figura 1.
Aqui, demonstramos como realizar a distribuição de tamanho de partículas e medições de concentração de mouses isolados e EVs humanos usando um novo instrumento NTA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62447/62447fig01.jpg"> Figura 1: Sistema óptico do instrumento de rastreamento de partículas. O instrumento NTA ilumina partículas usando três lasers com os seguintes comprimentos de onda: 450 nm, 520 nm, 635 nm. A gravação de vídeo da luz dispersa de partículas individuais é detectada e rastreada por uma câmera de vídeo digital orientada a 90° do cuvette. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62447/62447fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X dPBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0119-1000</td>
			<td>To dilute samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 nm bead standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3100A</td>
			<td>To test ViewSizer 3000 calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 nm bead standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3400A</td>
			<td>To test ViewSizer 3000 calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>To filter PBS diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collection tubes, 2 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19201</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed air duster</td>
			<td>DustOff</td>
			<td>DPSJB-12</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette insert</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette jig</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>To align magnetic stir bar while placing inserts inside cuvette; Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>De-ionized water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0201-1000</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer with monitor, keyboard, mouse, and all necessary cables</td>
			<td>Dell</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70-100%)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>-</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoQuick ULTRA</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>EQULTRA-20A-1</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass scintillation vials with lids</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B780020</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#34;Hook&#34; tool</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-free microfiber cloth</td>
			<td>Texwipe</td>
			<td>TX629</td>
			<td>To clean cuvettes and cover work surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363344</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bar</td>
			<td>Sp Scienceware</td>
			<td>F37119-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suprasil Quartz cuvette with cap</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>AG1000-0544</td>
			<td>Initially provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViewSizer 3000</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Nanoparticle tracking instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles

Os papéis fisiológicos e fisiofisiológicos de vesículas extracelulares (EVs) tornaram-se cada vez mais reconhecidos, tornando o campo EV uma área de pesquisa em rápida evolução. Existem muitos métodos diferentes para o isolamento do EV, cada um com vantagens e desvantagens distintas que afetam o rendimento a jusante e a pureza dos EVs. Assim, caracterizar a preparação de EV isolada de uma determinada fonte por um método escolhido é importante para a interpretação dos resultados a jusante e comparação dos resultados entre laboratórios. Existem vários métodos para determinar o tamanho e a quantidade de EVs, que podem ser alterados por estados da doença ou em resposta a condições externas. A análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) é uma das tecnologias proeminentes utilizadas para análise de alto rendimento de EVs individuais. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para quantificação e determinação de tamanho de EVs isolados do tecido adiposo do rato e plasma humano usando uma tecnologia inovadora para a NTA representando grandes avanços no campo. Os resultados demonstram que este método pode fornecer dados de concentração de partículas e tamanho totais reprodutíveis e válidos para EVs isolados de diferentes fontes usando diferentes métodos, conforme confirmado pela microscopia eletrônica de transmissão. A adaptação deste instrumento para a NTA abordará a necessidade de padronização nos métodos NTA para aumentar o rigor e a reprodutibilidade na pesquisa de EV.

Antes desta demonstração, a calibração do instrumento foi testada pela primeira vez para garantir a validade dos dados adquiridos, medindo a distribuição de tamanho das normas de contas de poliestireno. Testamos a distribuição de tamanho de contas de 100 nm e 400 nm usando os parâmetros de gravação padrão e as configurações de processamento recomendadas neste protocolo(Figura 8).
Para o padrão de contas de poliestireno de 100 nm, foi medida uma conc...

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Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Demonstramos como usar um novo instrumento de análise de rastreamento de nanopartículas para estimar a distribuição de tamanho e concentração total de partículas de vesículas extracelulares isoladas do tecido adiposo de camundongos e plasma humano.

Análise de rastreamento de nanopartículas para a quantificação e determinação de tamanho de vesículos extracelulares

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Os resultados da NTA são muito propensos ao viés do operador. Este protocolo demonstra os efeitos dos parâmetros alterados da NTA sobre os resultados obtidos. Um método padronizado ajudará a aumentar o rigor e a reprodutibilidade na análise da NTA.Analisar a amostra em um cuvette permite que uma amostra estatisticamente aleatória seja capturada em cada vídeo. Isso resulta em dados mais reprodutíveis e na visualização de partículas sobre uma ampla gama de tamanhos. Como obter uma amostra na faixa de concentração de partículas recomendada pode ser difícil, certifique-se de realizar uma diluição serial para identificar o fator de diluição ideal.Demonstrando o procedimento estará Kungheng Cai, um estudante de doutorado do laboratório de Anthony Ferrante. Para preparar a cuvette para análise de rastreamento de nanopartículas, cubra o espaço de trabalho com um material livre de fiapos para evitar que as fibras entrem nas cuvetas. Usando luvas, coloque uma cuvette contendo uma barra de agitação no gabarito magnético cuvette.Use uma ferramenta de gancho para colocar a inserção na cuvette com o entalhe da inserção visível na frente da cuvette. Use uma pipeta para adicionar lentamente 400 a 500 microliters de vesículas extracelulares purificadas no cuvette através do orifício na inserção e misture a amostra gentilmente tubos sem introduzir bolhas de ar, em seguida, tampar o cuvette, batendo bolhas conforme necessário e usar um pano sem fiapos para limpar a superfície externa da cuvette. Para analisar a concentração de partículas do diluído ou de uma amostra, ligue a estação de trabalho e o instrumento do computador e inicie o programa de análise de rastreamento de partículas.Quando solicitado, clique em NTA e abra a guia de gravação. Siga as instruções na tela para preencher todas as informações necessárias para a amostra. Para análise de rastreamento de EV, defina o diluído para PBS.A salinidade irá autopovoar para 9% Para obter a concentração de partículas diluída ou amostra, abra a tampa do instrumento e remova a tampa protetora que cobre onde o cuvette será colocado. Carregue o cuvette no instrumento na orientação correta com o entalhe da inserção voltada para a câmera e substitua a tampa e a tampa do instrumento. Clique na seta de streaming para ligar a câmera e clique na seta chevron para expandir as configurações de gravação.Ajuste o foco até que as partículas relativamente pequenas sejam claramente visíveis. Para definir a análise para uma pequena quantificação de EV, defina a taxa de quadros para 30 quadros por segundo, a exposição a 15 milissegundos, o tempo de agitação para cinco segundos, o tempo de espera para três segundos, os poderes de laser azul, verde e vermelho para 210, 12 e 8 miliwatts, respectivamente, os quadros por vídeo para 300, e o ganho para 30 decibéis. Ajuste o foco até que as partículas relativamente pequenas sejam claramente visíveis.Aumentar o zoom e/ou o ganho pode ajudar no foco de partículas. Mas se você aumentar o ganho, lembre-se de defini-lo para 30 decibéis antes de gravar. Uma vez que as partículas estejam em foco, defina a configuração de zoom para 0,5X para salvar a largura de banda e para evitar quadros de perda e clique em gravar para começar a gravar o vídeo.Quando um prompt aparecer informando que os vídeos foram gravados, clique em OK para concluir a gravação e selecione a guia do processo. Se partículas muito grandes eram visíveis em qualquer vídeo durante a gravação, navegue até o diretório de vídeos gravados e remova qualquer vídeo problemático antes do processamento. Verifique a caixa de detecção de áudio desativada e defina o diâmetro do recurso para 30.Clique no processo para iniciar o processamento de vídeo e visualize um gráfico de distribuição ao vivo. Quando o processamento estiver concluído, clique em OK e selecione a guia plot. Para EVs, exiba o gráfico principal como silica de caixa de registro.Outras características do gráfico, como a alteração do eixo x para definir a área de integração da figura produzida, podem ser personalizadas. Para criar um relatório PDF dos resultados, clique no botão relatório. A média, mediana, o tamanho do modo e a concentração ajustadas para o fator de diluição e largura de distribuição serão exibidos.A NTA do diluente deve ser realizada antes de qualquer amostra para que a concentração deste em branco possa ser subtraída da concentração de partículas da amostra de EV. Para limpar as cuvetas após a análise, esvazie a cuvette e encha completamente as cuvetas de 10 a 15 vezes com água desionizada e as três vezes com 70 a 100% de etanol para remover qualquer amostra residual. Seque o lado de fora das cuvetas com um pano de microfibra sem fiapos e seque o interior com um espanador de ar comprimido.Para limpar as pastilhas e mexer as barras, coloque os materiais em um frasco de cintilação de vidro contendo 70 a 100% de etanol e agite o frasco vigorosamente. Em seguida, enxágue as pastilhas e mexa em barras em água desionizada com agitação como demonstrado e seque-as usando panos sem fiapos. Após a secagem, coloque imediatamente todos os componentes limpos no armazenamento até a próxima análise.Antes de realizar uma análise, a calibração do instrumento foi testada utilizando contas de poliestireno para garantir a validade dos dados adquiridos. Como observado, o instrumento de rastreamento de partículas relatou com precisão o tamanho das contas de manodisperse de 100 nanômetros, mas apenas relatou de perto o tamanho das contas de 400 nanômetros. Portanto, as configurações de instrumentos para este protocolo foram mais precisas para partículas menores, perto de 100 nanômetros de tamanho.Utilizando essas configurações, as escalas de concentração de partículas relatadas de acordo com o fator de diluição demonstram que o instrumento pode detectar com precisão a concentração de partículas em várias diluições com pouca variabilidade entre replicantes técnicos. A diluição ideal para uma amostra de EV derivada de tecido de camundongos 4,41 vezes 10 para a décima por mililitro de tecido derivado do tecido foi determinada entre 1.000 e 3.000. Nesta análise, o aumento do ganho aumentou a sensibilidade da câmera, permitindo um aumento na visualização de um maior número de partículas menores.O aumento da potência do laser azul de 70 para 210 miliwatts, mantendo os poderes laser verde e vermelho constantemente, mudou o tamanho médio de partículas relatado de 122 para 105 nanômetros e aumentou a concentração total de partículas relatada de 1,1 vezes 10 para o oitavo para 1,7 vezes 10 para o oitavo. O aumento da potência do laser vermelho aumentou o tamanho médio de partículas relatado de 175 para 246 nanômetros e diminuiu a concentração total de partículas relatada. O aumento da potência do laser verde resultou em uma diminuição no tamanho médio de partículas relatada e um aumento na concentração total de partículas relatada.Encontrar a diluição certa para colocar uma amostra dentro do intervalo ideal de detecção pode levar algumas tentativas para cada amostra. A limpeza de cuvette também requer um manuseio extra cuidadoso. Recomendamos a aplicação de mais de um método ortogonal para medidas de tamanho de partículas e concentração de EV.Dispersão dinâmica de luz, sensoriamento de pulso resistivo, microscopia eletrônica de transmissão e sensor de imagem de refletia interferométrica de partículas únicas também podem ser realizadas para caracterizar EVs.

Research

JoVE Journal

Biology

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

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Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

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Purificação e Análise de Catadores Elegans Extracelulares

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Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes

Imagem e Análise Automatizada para a Quantificação de Macropinoss fluorescentes rotulados

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and ...

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

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Ensaio de absorção de vesícula extracelular via análise de imagens de microscópio confocal

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Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

Microscopia de Reconstrução Óptica Estocástica Direta de Vesículos Extracelulares em Três Dimensões

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Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Isolamento escalável e purificação de vesículas extracelulares de Escherichia coli e outras bactérias

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...