Name: nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles
Uploaded: 2021-03-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (ES030973-01A1, R01ES025225, R01DK066525, P30DK026687, P30DK063608). Мы благодарим Джеффри Бодикомба, доктора философии HORIBA Instruments Incorporated, за его помощь в калибровке прибора.

Вся работа с этими образцами проводилась в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по уходу за животными и их использованию и Совета по институциональному обзору. Схематический обзор метода NTA показан на рисунке 2.
<p class="jove_content" fo:keep-together.with...

<ol>
	<li>Colombo, M., Raposo, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+secretion,+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).</li><li>Hessvik, N. P., Llorente, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+knowledge+on+exosome+biogenesis+and+release.">Current knowledge on exosome biogenesis and release.</a> Cellular and molecular life sciences: CMLS. 75, 193-208 (2018).</li><li>Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+formation+during+reticulocyte+maturation.+Association+of+plasma+membrane+activities+with+released+vesicles+(exosomes).">Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes).</a> The Journal of Biological Chemistry. 262, 9412-9420 (1987).</li><li>Th&#233;ry, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses.">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).</li><li>Y&#225;&#241;ez-M&#243;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).</li><li>Lo Cicero, A., Stahl, A., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+shuffling+intercellular+messages:+for+good+or+for+bad.">Extracellular vesicles shuffling intercellular messages: for good or for bad.</a> Current Opinion in Cell Biology. 35, 69-77 (2015).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200, 373-383 (2013).</li><li>Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+extracellular+organelles+important+in+intercellular+communication.">Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication.</a> Journal of Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+and+technologies+for+exosome+isolation+and+characterization.">Methods and technologies for exosome isolation and characterization.</a> Small Methods. 2, 1800021 (2018).</li><li>Szatanek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+methods+of+choice+for+extracellular+vesicles+(EVs)+characterization.">The methods of choice for extracellular vesicles (EVs) characterization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).</li><li>Erdbr&#252;gger, U., Lannigan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+challenges+of+extracellular+vesicle+detection:+A+comparison+of+different+techniques.">Analytical challenges of extracellular vesicle detection: A comparison of different techniques.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 89, 123-134 (2016).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Extracellular+Vesicles:+General+Methodologies+and+Latest+Trends.">Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends.</a> BioMed Research International. 2018, 1-27 (2018).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li><li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Desd&#237;n-Mic&#243;, G., Mittelbrunn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+exosomes+in+the+protection+of+cellular+homeostasis.">Role of exosomes in the protection of cellular homeostasis.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 11, 127-134 (2017).</li><li>Kanemoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+body+formation+enhancement+and+exosome+release+during+endoplasmic+reticulum+stress.">Multivesicular body formation enhancement and exosome release during endoplasmic reticulum stress.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 480, 166-172 (2016).</li><li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+extract+induced+exosome+release+is+mediated+by+depletion+of+exofacial+thiols+and+can+be+inhibited+by+thiol-antioxidants.">Cigarette smoke extract induced exosome release is mediated by depletion of exofacial thiols and can be inhibited by thiol-antioxidants.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 108, 334-344 (2017).</li><li>Saeed-Zidane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+exosome+mediated+molecular+defense+mechanism+in+bovine+granulosa+cells+exposed+to+oxidative+stress.">Cellular and exosome mediated molecular defense mechanism in bovine granulosa cells exposed to oxidative stress.</a> PloS One. 12, 0187569 (2017).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stress-dependent+autophagy+component+release+via+extracellular+nanovesicles+in+tumor+cells.">Mechanical stress-dependent autophagy component release via extracellular nanovesicles in tumor cells.</a> ACS Nano. 13, 4589-4602 (2019).</li><li>King, H. W., Michael, M. Z., Gleadle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic+enhancement+of+exosome+release+by+breast+cancer+cells.">Hypoxic enhancement of exosome release by breast cancer cells.</a> BMC Cancer. 12, 421 (2012).</li><li>Bonzini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+particulate+matter+exposure+induces+extracellular+vesicle+release+in+overweight+subjects.">Short-term particulate matter exposure induces extracellular vesicle release in overweight subjects.</a> Environment Research. 155, 228-234 (2017).</li><li>Neri, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particulate+matter+induces+prothrombotic+microparticle+shedding+by+human+mononuclear+and+endothelial+cells.">Particulate matter induces prothrombotic microparticle shedding by human mononuclear and endothelial cells.</a> Toxicology In Vitro. 32, 333-338 (2016).</li><li>Flaherty, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lipase-independent+pathway+of+lipid+release+and+immune+modulation+by+adipocytes.">A lipase-independent pathway of lipid release and immune modulation by adipocytes.</a> Science. 363, 989-993 (2019).</li><li>van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles.">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 213-228 (2018).</li><li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7, 780-788 (2011).</li><li>Saveyn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+particle+size+distribution+determination+by+nanoparticle+tracking+analysis+based+on+2-D+Brownian+dynamics+simulation.">Accurate particle size distribution determination by nanoparticle tracking analysis based on 2-D Brownian dynamics simulation.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 352, 593-600 (2010).</li><li>Vander Meeren, P., Kasinos, M., Saveyn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+two-dimensional+Brownian+motion+dynamics+in+applying+nanoparticle+tracking+analysis.">Relevance of two-dimensional Brownian motion dynamics in applying nanoparticle tracking analysis.</a> Methods in Molecular Biology. , 525-534 (2012).</li><li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+evaluation+of+Nanoparticle+Tracking+Analysis+(NTA)+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates.">Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27, 796-810 (2010).</li><li>Bachurski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+measurements+with+nanoparticle+tracking+analysis+-+An+accuracy+and+repeatability+comparison+between+NanoSight+NS300+and+ZetaView.">Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1596016 (2019).</li><li>Varga, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hollow+organosilica+beads+as+reference+particles+for+optical+detection+of+extracellular+vesicles.">Hollow organosilica beads as reference particles for optical detection of extracellular vesicles.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16, 1646-1655 (2018).</li><li>Serrano-Pertierra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Current+analytical+techniques+for+detection+and+quantification.">Extracellular vesicles: Current analytical techniques for detection and quantification.</a> Biomolecules. 10, (2020).</li><li>Maguire, C. M., R&#246;sslein, M., Wick, P., Prina-Mello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+particles+in+solution+-+a+perspective+on+light+scattering+and+comparative+technologies.">Characterisation of particles in solution - a perspective on light scattering and comparative technologies.</a> Science and Technology of Advanced Materials. 19, 732-745 (2018).</li><li>Bohren, C. F., Huffman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , (1983).</li></ol>

Здесь мы демонстрируем протокол для NTA электромобилей для измерения распределения по размерам широкого диапазона размеров частиц одновременно и измерения общей концентрации EV в полидисперсном образце. В этом исследовании перигонадная жировая ткань мыши и плазма человека были исполь...

Внеклеточные везикулы (EV) представляют собой небольшие (0,03-2 мкм) связанные с мембраной везикулы, секретируемые почти всеми типами клеток1. Их часто называют «экзосомами», «микровезикулами» или «апоптотическими телами» в зависимости от их механизма высвобождения и размера2. Хотя первоначально считалось, что электромобили были просто средством устранения отходов из клетки для поддержания гомеостаза3,теперь мы знаем, что они также могут участвовать в межклеточной коммуникации посредством переноса молекулярного материала, включая ДНК, РНК (мРНК, микроРНК), липиды и белки4,5, и что они являются важными регуляторами нормальной физиологии, а также патологических процессов1, 5,6,7,8.
Существует множество различных методов выделения и количественной оценки электромобилей, которые были описаны в других разделах9,10,11,12. Используемый протокол изоляции, а также источник электромобилей могут сильно повлиять на выход и чистоту электромобилей. Даже дифференциальное центрифугирование, долгое время считавшийся подходом «золотого стандарта» для выделения экзосом, может подвергаться существенной изменчивости, впоследствии влияющей на популяцию электромобилей, полученную и последующий анализ13. Таким образом, различные методологии изоляции и количественной оценки электромобилей затрудняют сравнение, воспроизведение и интерпретацию результатов экспериментов, о которых сообщается в литературе14. Кроме того, высвобождение EV может регулироваться клеточными условиями или различными внешними факторами. Было высказано предположение, что EV играют роль в поддержании клеточного гомеостаза, защищая клетки от внутриклеточного стресса15,поскольку несколько исследований показали, что клеточный стресс стимулирует секрецию EV. Например, сообщалось об увеличении высвобождения EV после клеточного воздействия гипоксии, эндоплазматического стресса риткулума, окислительного стресса, механического стресса, экстракта сигаретного дыма и загрязнения воздуха твердыми частицами16,17,18,19,20,21,22. Также было показано, что релиз EV модифицируется in vivo; мыши, подвергаемые диете с высоким содержанием жиров или голодания в течение шестнадцати часов, высвобождали больше адипоцитарных EV23. Чтобы выяснить, изменяет ли конкретное лечение или состояние высвобождение EV, количество EV должно быть точно определено. Оценка распределения EV по размерам может также указывать на преобладающее субклеточное происхождение EV (например, слияние поздних эндосом/мультивезикулярных тел с плазматической мембраной против почкоделения плазматической мембраны)24. Таким образом, существует потребность в надежных методах для точного измерения общей концентрации и распределения по размерам изучаемого ev prep.
Быстрым и высокочувствительным методом визуализации и характеристики электромобилей в растворе является анализ отслеживания наночастиц (NTA). Подробное объяснение принципов применения данного метода и сравнение с альтернативными методами оценки размера и концентрации ЭВ были описаныранее 25,26,27,28. Вкратце, во время измерения NTA электромобили визуализируются светом, рассеянным при их облучении лазерным лучом. Рассеянный свет фокусируется микроскопом на камере, которая записывает движение частиц. Программное обеспечение NTA отслеживает случайное тепловое движение каждой частицы, известное как броуновское движение, чтобы определить коэффициент диффузии, который используется для расчета размера каждой частицы с использованием уравнения Стокса-Эйнштейна. NTA был впервые применен для измерения EV в биологическом образце в 2011году25. До недавнего времени существовало только две основные компании, предлагающие коммерческие инструменты NTA29 до появления ViewSizer 3000 (далее именуемого инструментом отслеживания частиц), который использует комбинацию новых аппаратных и программных решений для преодоления значительных ограничений других методов NTA.
Инструмент отслеживания частиц характеризует наночастицы в жидких образцах путем анализа их броуновского движения и характеризует более крупные частицы микронный размером, анализируя гравитационное оседание. Уникальная оптическая система этого прибора, которая включает в себя мультиспектральное освещение с тремя лазерными источниками света (при 450 нм, 520 нм и 635 нм), позволяет исследователям анализировать широкий диапазон размеров частиц (например, экзосомы, микровезикулы) одновременно. Схема установки прибора показана на рисунке 1.
Здесь мы демонстрируем, как выполнять измерения размера частиц и концентрации изолированных электромобилей мышей и человека с помощью нового инструмента NTA.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62447/62447fig01.jpg"> Рисунок 1:Оптическая система прибора слежения за частицами. Прибор NTA освещает частицы с помощью трех лазеров со следующими длинами волн: 450 нм, 520 нм, 635 нм. Видеозапись рассеянного света от отдельных частиц обнаруживается и отслеживается цифровой видеокамерой, ориентированной на 90° от кюветы. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62447/62447fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X dPBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0119-1000</td>
			<td>To dilute samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 nm bead standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3100A</td>
			<td>To test ViewSizer 3000 calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 nm bead standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3400A</td>
			<td>To test ViewSizer 3000 calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>To filter PBS diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collection tubes, 2 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19201</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed air duster</td>
			<td>DustOff</td>
			<td>DPSJB-12</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette insert</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette jig</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>To align magnetic stir bar while placing inserts inside cuvette; Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>De-ionized water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0201-1000</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer with monitor, keyboard, mouse, and all necessary cables</td>
			<td>Dell</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70-100%)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>-</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoQuick ULTRA</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>EQULTRA-20A-1</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass scintillation vials with lids</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B780020</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#34;Hook&#34; tool</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-free microfiber cloth</td>
			<td>Texwipe</td>
			<td>TX629</td>
			<td>To clean cuvettes and cover work surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363344</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bar</td>
			<td>Sp Scienceware</td>
			<td>F37119-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suprasil Quartz cuvette with cap</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>AG1000-0544</td>
			<td>Initially provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViewSizer 3000</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Nanoparticle tracking instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles

Физиологические и патофизиологические роли внеклеточных везикул (EV) становятся все более признанными, что делает область EV быстро развивающейся областью исследований. Существует множество различных методов изоляции электромобилей, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки, которые влияют на выход и чистоту электромобилей. Таким образом, характеристика подготовки EV, изолированной от заданного источника выбранным методом, важна для интерпретации последующих результатов и сравнения результатов в разных лабораториях. Существуют различные методы определения размера и количества EV, которые могут быть изменены болезненными состояниями или в ответ на внешние условия. Анализ отслеживания наночастиц (NTA) является одной из выдающихся технологий, используемых для высокопроизводительного анализа отдельных электромобилей. Здесь мы представляем подробный протокол количественной оценки и определения размера EV, выделенных из перигонадной жировой ткани мыши и плазмы человека, с использованием прорывной технологии для NTA, представляющей основные достижения в этой области. Результаты показывают, что этот метод может предоставлять воспроизводимые и достоверные данные об общей концентрации частиц и распределении по размеру для электромобилей, выделенных из разных источников с использованием различных методов, что подтверждается просвечиваюрной электронной микроскопией. Адаптация этого инструмента для NTA позволит рассмотреть необходимость стандартизации методов NTA для повышения строгости и воспроизводимости в исследованиях EV.

Перед этой демонстрацией калибровка прибора была сначала протестирована для обеспечения достоверности полученных данных путем измерения распределения по размерам стандартов полистирольных шариков. Мы протестировали распределение размеров бусин 100 нм и 400 нм с использованием параме...

Watch this Scientific Journal Video about Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles at JoVE.com

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Мы демонстрируем, как использовать новый инструмент для анализа отслеживания наночастиц для оценки распределения по размеру и общей концентрации частиц внеклеточных везикул, выделенных из перигонадной жировой ткани мыши и плазмы человека.

Анализ отслеживания наночастиц для количественной оценки и определения размера внеклеточных везикул

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Результаты NTA очень подвержены смещению оператора. Данный протокол демонстрирует влияние измененных параметров НТА на полученные результаты. Стандартизированный метод поможет повысить строгость и воспроизводимость анализа NTA.Анализ выборки в кювете позволяет получить статистически случайную выборку в каждом видео. Это приводит к более воспроизводимым данным и визуализации частиц в широком диапазоне размеров. Поскольку получение образца в рекомендуемом диапазоне концентраций частиц может быть затруднено, обязательно выполните последовательное разбавление, чтобы определить идеальный коэффициент разбавления.Продемонстрировать процедуру будет Кунхенг Кай, аспирант из лаборатории Энтони Ферранте. Чтобы подготовить кювету для анализа отслеживания наночастиц, накройте рабочее пространство безворсовым материалом, чтобы предотвратить попадание волокон в кюветы. Надев перчатки, поместите кювету, содержащую перемешиватель, на магнитный джиг кюветы.Используйте инструмент для крючка, чтобы поместить вставку в кювету с выемкой вставки, видимой в передней части кюветы. Используйте пипетку, чтобы медленно добавить от 400 до 500 микролитров очищенных внеклеточных везикул на кювету через отверстие во вставке и перемешать образец, осторожно пипетируя без введения пузырьков воздуха, затем закройте кювету, вырезая пузырьки по мере необходимости и используйте безворсовую ткань, чтобы протереть внешнюю поверхность кюветы. Чтобы проанализировать концентрацию частиц разлучительного или образца, включите компьютерную рабочую станцию и прибор и запустите программу анализа отслеживания частиц.При появлении запроса щелкните NTA и откройте вкладку записи. Следуйте инструкциям на экране, чтобы заполнить всю необходимую информацию. Для анализа отслеживания электромобилей установите разбавитель в PBS.Соленость будет автоматически заполняться до 9% Чтобы получить концентрацию разлучатель или частиц образца, откройте крышку прибора и снимите защитное покрытие крышки, где будет помещена кювета. Загрузите кювету в прибор в правильной ориентации с выемкой вставки, обращенной к камере, и замените колпачок и крышку прибора. Щелкните стрелку потоковой передачи, чтобы включить камеру, и щелкните стрелку шеврона, чтобы развернуть настройки записи.Отрегулируйте фокус до тех пор, пока относительно небольшие частицы не будут хорошо видны. Чтобы установить анализ для небольшой количественной оценки EV, установите частоту кадров на 30 кадров в секунду, экспозицию на 15 миллисекунд, время перемешивания на пять секунд, время ожидания на три секунды, мощность синего, зеленого и красного лазера на 210, 12 и 8 милливатт соответственно, кадры на видео на 300 и коэффициент усиления до 30 децибел. Отрегулируйте фокус до тех пор, пока относительно небольшие частицы не будут хорошо видны.Увеличение масштаба и/или усиления может помочь с фокусировкой частиц. Но если вы увеличиваете коэффициент усиления, не забудьте установить его на 30 децибел перед записью. Как только частицы будут в фокусе, установите настройку масштабирования на 0,5X, чтобы сэкономить пропускную способность и предотвратить потерю кадров, и нажмите кнопку запись, чтобы начать запись видео.Когда появится запрос о том, что видео были записаны, нажмите кнопку ОК, чтобы завершить запись, и выберите вкладку процесса. Если во время записи в любом видео были видны очень крупные частицы, перейдите в каталог записанных видео и удалите все проблемные видео перед обработкой. Установите флажок переопределить обнаружение звука и установите диаметр функции на 30.Щелкните Процесс, чтобы начать обработку видео и просмотреть график распространения в реальном времени. После завершения обработки нажмите кнопку ОК и выберите вкладку графика. Для электромобилей отобразите основную диаграмму в виде логарифма кремнезема.Другие функции графика, такие как изменение оси X для установки области для интеграции полученной фигуры, могут быть настроены. Чтобы создать ОТЧЕТ о результатах в формате PDF, нажмите кнопку отчета. Будут отображены среднее значение, медиана, размер режима и концентрация, скорректированные с учетом коэффициента разрежения и ширины распределения.NTA разбойника следует выполнять перед любым образцом, чтобы концентрация этой заготовки могла быть вычтена из концентрации частиц образца EV. Чтобы очистить кюветы после анализа, опорожните кювету и полностью заполните кюветы 10-15 раз деионизированной водой и три раза 70-100% этанолом, чтобы удалить любой остаточный образец. Высушите внешнюю часть кювет безворсовой салфеткой из микрофибры и высушите внутреннюю часть с помощью пылесборника со сжатым воздухом.Чтобы очистить вставки и перемешать батончики, поместите материалы в стеклянный сцинтилляционный флакон, содержащий от 70 до 100% этанола, и энергично встряхните флакон. Затем промойте вкладыши и перемешайте батончики в деионизированной воде с встряхиванием, как показано на продемонстрированной основе, и высушите их с помощью безворсовых тканей. После высыхания сразу же поместите все чистые компоненты в хранилище до следующего анализа.Перед выполнением анализа калибровка прибора была проверена с использованием полистирольных шариков для обеспечения достоверности полученных данных. Как было замечено, инструмент отслеживания частиц точно сообщал о размере 100-нанометровых бусин манодисперсов, но только близко сообщал о размере 400-нанометровых бусин. Поэтому настройки прибора для этого протокола были более точными для более мелких частиц, размером ближе к 100 нанометрам.Используя эти настройки, сообщали шкалы концентрации частиц соответственно коэффициенту разрежения, демонстрируя, что прибор может точно обнаруживать концентрацию частиц при различных разбавлениях с небольшой изменчивостью между техническими репликантами. Оптимальное разбавление для образца EV, полученного из ткани мыши, в 4,41 раза от 10 до 10-10-ти частиц на миллилитр мыши, было определено как от 1 000 до 3000. При этом анализе увеличение коэффициента усиления увеличивалось чувствительность камеры, позволяя увеличить визуализацию большего количества более мелких частиц.Увеличение мощности синего лазера с 70 до 210 милливатт при сохранении постоянной мощности зеленого и красного лазера сместило зарегистрированный средний размер частиц со 122 до 105 нанометров и увеличило общую концентрацию частиц с 1,1 раза 10 до восьмой до 1,7 раза 10 до восьмой. Увеличение мощности красного лазера увеличило зарегистрированный средний размер частиц со 175 до 246 нанометров и уменьшило общую концентрацию частиц. Увеличение мощности зеленого лазера привело к уменьшению зарегистрированного среднего размера частиц и увеличению общей концентрации частиц.Поиск правильного разбавления для размещения образца в пределах оптимального диапазона обнаружения может занять несколько попыток для каждого образца. Чистка кюветы также требует особого бережного обращения. Мы рекомендуем применять более одного ортогонального метода для измерения размера и концентрации частиц EV.Динамическое рассеяние света, резистивное импульсное зондирование, просвечивающая электронная микроскопия и интерферометрическое измерение отражательной характеристики одной частицы также могут быть выполнены для характеристики электромобилей.

Research

JoVE Journal

Biology

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

Важность правильной концентрации белка для кинетики и Affinity Определение в структурно-функционального анализа

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Инновационный метод для экзосома количественной и измерения размера

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

Быстрое и Удельный Микропланшетный Анализ для определения внутри-и внеклеточной аскорбат в культивируемых клетках

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Методы анализа внеклеточной везикул с использованием проточной цитометрии

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Гранулярных анализ внеклеточного Vesicles из клеток кондиционером СМИ потока

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Очищение и анализ Caenorhabditis elegans Внеклеточные Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes

Автоматизированная визуализация и анализ для количественной оценки флуоресцентно меченых макропиносом

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and ...

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Анализ поглощения внеклеточных везикул с помощью конфокального микроскопического анализа изображений

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular ...

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

Прямая стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия внеклеточных везикул в трех измерениях

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Масштабируемое выделение и очистка внеклеточных везикул от кишечной палочки и других бактерий

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...