Name: nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles
Uploaded: 2021-03-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (ES030973-01A1, R01ES025225, R01DK066525, P30DK026687, P30DK063608). Vi bekräftar Jeffrey Bodycomb, ph.d. av HORIBA Instruments Incorporated för hans hjälp med att kalibrera instrumentet.

Allt arbete med dessa prover utfördes i enlighet med institutional animal care and use committee och Institutional Review Board guidelines. En schematisk översikt över NTA-metoden visas i figur 2.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62447/62447fig02.jpg"> Figur 2: Översikt över NTA-metoden med partikelspårningsinstrumentet. Provet bereds och sätts in i ...

<ol>
	<li>Colombo, M., Raposo, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+secretion,+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).</li><li>Hessvik, N. P., Llorente, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+knowledge+on+exosome+biogenesis+and+release.">Current knowledge on exosome biogenesis and release.</a> Cellular and molecular life sciences: CMLS. 75, 193-208 (2018).</li><li>Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+formation+during+reticulocyte+maturation.+Association+of+plasma+membrane+activities+with+released+vesicles+(exosomes).">Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes).</a> The Journal of Biological Chemistry. 262, 9412-9420 (1987).</li><li>Th&#233;ry, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses.">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).</li><li>Y&#225;&#241;ez-M&#243;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).</li><li>Lo Cicero, A., Stahl, A., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+shuffling+intercellular+messages:+for+good+or+for+bad.">Extracellular vesicles shuffling intercellular messages: for good or for bad.</a> Current Opinion in Cell Biology. 35, 69-77 (2015).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200, 373-383 (2013).</li><li>Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+extracellular+organelles+important+in+intercellular+communication.">Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication.</a> Journal of Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+and+technologies+for+exosome+isolation+and+characterization.">Methods and technologies for exosome isolation and characterization.</a> Small Methods. 2, 1800021 (2018).</li><li>Szatanek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+methods+of+choice+for+extracellular+vesicles+(EVs)+characterization.">The methods of choice for extracellular vesicles (EVs) characterization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).</li><li>Erdbr&#252;gger, U., Lannigan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+challenges+of+extracellular+vesicle+detection:+A+comparison+of+different+techniques.">Analytical challenges of extracellular vesicle detection: A comparison of different techniques.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 89, 123-134 (2016).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Extracellular+Vesicles:+General+Methodologies+and+Latest+Trends.">Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends.</a> BioMed Research International. 2018, 1-27 (2018).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li><li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Desd&#237;n-Mic&#243;, G., Mittelbrunn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+exosomes+in+the+protection+of+cellular+homeostasis.">Role of exosomes in the protection of cellular homeostasis.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 11, 127-134 (2017).</li><li>Kanemoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+body+formation+enhancement+and+exosome+release+during+endoplasmic+reticulum+stress.">Multivesicular body formation enhancement and exosome release during endoplasmic reticulum stress.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 480, 166-172 (2016).</li><li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+extract+induced+exosome+release+is+mediated+by+depletion+of+exofacial+thiols+and+can+be+inhibited+by+thiol-antioxidants.">Cigarette smoke extract induced exosome release is mediated by depletion of exofacial thiols and can be inhibited by thiol-antioxidants.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 108, 334-344 (2017).</li><li>Saeed-Zidane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+exosome+mediated+molecular+defense+mechanism+in+bovine+granulosa+cells+exposed+to+oxidative+stress.">Cellular and exosome mediated molecular defense mechanism in bovine granulosa cells exposed to oxidative stress.</a> PloS One. 12, 0187569 (2017).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stress-dependent+autophagy+component+release+via+extracellular+nanovesicles+in+tumor+cells.">Mechanical stress-dependent autophagy component release via extracellular nanovesicles in tumor cells.</a> ACS Nano. 13, 4589-4602 (2019).</li><li>King, H. W., Michael, M. Z., Gleadle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic+enhancement+of+exosome+release+by+breast+cancer+cells.">Hypoxic enhancement of exosome release by breast cancer cells.</a> BMC Cancer. 12, 421 (2012).</li><li>Bonzini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+particulate+matter+exposure+induces+extracellular+vesicle+release+in+overweight+subjects.">Short-term particulate matter exposure induces extracellular vesicle release in overweight subjects.</a> Environment Research. 155, 228-234 (2017).</li><li>Neri, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particulate+matter+induces+prothrombotic+microparticle+shedding+by+human+mononuclear+and+endothelial+cells.">Particulate matter induces prothrombotic microparticle shedding by human mononuclear and endothelial cells.</a> Toxicology In Vitro. 32, 333-338 (2016).</li><li>Flaherty, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lipase-independent+pathway+of+lipid+release+and+immune+modulation+by+adipocytes.">A lipase-independent pathway of lipid release and immune modulation by adipocytes.</a> Science. 363, 989-993 (2019).</li><li>van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles.">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 213-228 (2018).</li><li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7, 780-788 (2011).</li><li>Saveyn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+particle+size+distribution+determination+by+nanoparticle+tracking+analysis+based+on+2-D+Brownian+dynamics+simulation.">Accurate particle size distribution determination by nanoparticle tracking analysis based on 2-D Brownian dynamics simulation.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 352, 593-600 (2010).</li><li>Vander Meeren, P., Kasinos, M., Saveyn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+two-dimensional+Brownian+motion+dynamics+in+applying+nanoparticle+tracking+analysis.">Relevance of two-dimensional Brownian motion dynamics in applying nanoparticle tracking analysis.</a> Methods in Molecular Biology. , 525-534 (2012).</li><li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+evaluation+of+Nanoparticle+Tracking+Analysis+(NTA)+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates.">Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27, 796-810 (2010).</li><li>Bachurski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+measurements+with+nanoparticle+tracking+analysis+-+An+accuracy+and+repeatability+comparison+between+NanoSight+NS300+and+ZetaView.">Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1596016 (2019).</li><li>Varga, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hollow+organosilica+beads+as+reference+particles+for+optical+detection+of+extracellular+vesicles.">Hollow organosilica beads as reference particles for optical detection of extracellular vesicles.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16, 1646-1655 (2018).</li><li>Serrano-Pertierra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Current+analytical+techniques+for+detection+and+quantification.">Extracellular vesicles: Current analytical techniques for detection and quantification.</a> Biomolecules. 10, (2020).</li><li>Maguire, C. M., R&#246;sslein, M., Wick, P., Prina-Mello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+particles+in+solution+-+a+perspective+on+light+scattering+and+comparative+technologies.">Characterisation of particles in solution - a perspective on light scattering and comparative technologies.</a> Science and Technology of Advanced Materials. 19, 732-745 (2018).</li><li>Bohren, C. F., Huffman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , (1983).</li></ol>

Här demonstrerar vi ett protokoll för NTA av EVs för att mäta storleksfördelningen av ett brett spektrum av partikelstorlekar samtidigt och mäta den totala EV-koncentrationen i ett polydisperseprov. I denna studie användes mus perigonadal fettvävnad och human plasma som källa till EVs. EVs som isolerats från andra vävnader eller biologiska vätskor som serum, urin, saliv, bröstmjölk, fostervatten och cellodlingsmetatanter kan dock också användas för NTA. Mätningar av polystyrenpärlor säkerställde att ...

Extracellulära blåsor (EVs) är små (0,03-2 μm) membranbundna blåsor utsöndras av nästan alla celltyper1. De kallas ofta "exosomer", "mikrovesicles" eller "apoptotiska kroppar" beroende på deras mekanism för frisättning och storlek2. Medan man ursprungligen trodde att EVs helt enkelt var ett sätt att eliminera avfall från cellen för att upprätthålla homeostas3, vet vi nu att de också kan delta i intercellulär kommunikation via överföring av molekylärt material - inklusive DNA, RNA (mRNA, mikroRNA), lipider ochproteiner 4,5 - och att de är viktiga regulatorer av normal fysiologi samt patologiska processer1, 5,6,7,8.
Det finns många olika metoder för att isolera och kvantifiera EVs, som har beskrivits någonannanstans 9,10,11,12. Isoleringsprotokollet som används samt källan till EVs kan i hög grad påverka EV-utbytet och renheten. Även differentiell centrifugation, som länge betraktats som "guldstandardmetoden" för exosomisolering, kan bli föremål för betydande variationer som därefter påverkar den ev-population som erhållits och nedströmsanalyser13. Således gör de olika metoderna för EV-isolering och kvantifiering det svårt att jämföra, reproducera och tolka resultat av experiment som rapporteras i litteraturen14. Dessutom kan EV-frisättning regleras av cellulära förhållanden eller olika externa faktorer. Det har föreslagits att EVs spelar en roll för att upprätthålla cellulära homeostas genom att skydda celler mot intracellulär stress15, eftersom flera studier har visat att cellulär stress stimulerar EV utsöndring. Till exempel har ökad EV-frisättning rapporterats efter cellulär exponering för hypoxi, endoplasmisk retikulumstress, oxidativ stress, mekanisk stress, cigarettrökextrakt och partiklarluftföroreningar 16,17,18,19,20,21,22. Ev-utsläpp har också visat sig vara modifierat in vivo; möss som utsätts för en fettrik kost eller fasta i sexton timmar släppte ut mer adipocyt EVs23. För att undersöka om en specifik behandling eller ett visst tillstånd förändrar ev-frisättningen måste antalet elfordon bestämmas noggrant. Bedömning av fördelningen av ev-storlek kan också ange det dominerande subcellulära ursprunget för EVs (t.ex. fusion av sena endosomer/multivesicular kroppar med plasmamembranet jämfört med spirande plasmamembranet)24. Det finns således ett behov av robusta metoder för att noggrant mäta den totala koncentrationen och storleksfördelningen av ev prep som studeras.
En snabb och mycket känslig metod för visualisering och karakterisering av EVs i lösning är nanopartikelspårningsanalys (NTA). En detaljerad förklaring av principerna för denna metod och jämförelse med alternativa metoder för bedömning av EV-storlek och koncentration har beskrivitstidigare 25,26,27,28. Kortfattat, under NTA-mätning, visualiseras EVs av ljuset som sprids när de bestrålas med en laserstråle. Det spridda ljuset fokuseras av ett mikroskop på en kamera som registrerar partikelrörelsen. NTA-programvaran spårar den slumpmässiga termiska rörelsen hos varje partikel, känd som brownsk rörelse, för att bestämma diffusionskoefficienten som används för att beräkna storleken på varje partikel med hjälp av Stokes-Einstein-ekvationen. NTA tillämpades först på mätning av elfordon i ett biologiskt prov 201125. Fram till nyligen fanns det bara två vanliga företag som erbjöd kommersiella NTA-instrument29 fram till införandet av ViewSizer 3000 (nedan kallat partikelspårningsinstrumentet) som använder en kombination av nya hårdvaru- och programvarulösningar för att övervinna betydande begränsningar av andra NTA-tekniker.
Partikelspårningsinstrumentet karakteriserar nanopartiklar i flytande prover genom att analysera deras brownska rörelse och karakteriserar större mikronstora partiklar genom att analysera gravitations sedimentering. Detta instruments unika optiska system, som inkluderar multispektrala belysning med tre laserljuskällor (vid 450 nm, 520 nm och 635 nm), gör det möjligt för forskare att analysera ett brett spektrum av partikelstorlekar (t.ex. exosomer, mikrovesicles) samtidigt. Ett schema över instrumentinställningen visas i figur 1.
Här visar vi hur man utför partikelstorleksfördelning och koncentrationsmätningar av isolerade mus- och mänskliga EVs med hjälp av ett nytt NTA-instrument.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62447/62447fig01.jpg"> Figur 1:Optiskt system för partikelspårningsinstrument. NTA-instrumentet lyser upp partiklar med tre lasrar med följande våglängder: 450 nm, 520 nm, 635 nm. Videoinspelning av det spridda ljuset från enskilda partiklar detekteras och spåras av en digital videokamera orienterad 90° från cuvette. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62447/62447fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X dPBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0119-1000</td>
			<td>To dilute samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 nm bead standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3100A</td>
			<td>To test ViewSizer 3000 calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 nm bead standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3400A</td>
			<td>To test ViewSizer 3000 calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>To filter PBS diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collection tubes, 2 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19201</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed air duster</td>
			<td>DustOff</td>
			<td>DPSJB-12</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette insert</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette jig</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>To align magnetic stir bar while placing inserts inside cuvette; Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>De-ionized water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0201-1000</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer with monitor, keyboard, mouse, and all necessary cables</td>
			<td>Dell</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70-100%)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>-</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoQuick ULTRA</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>EQULTRA-20A-1</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass scintillation vials with lids</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B780020</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#34;Hook&#34; tool</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-free microfiber cloth</td>
			<td>Texwipe</td>
			<td>TX629</td>
			<td>To clean cuvettes and cover work surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363344</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bar</td>
			<td>Sp Scienceware</td>
			<td>F37119-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suprasil Quartz cuvette with cap</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>AG1000-0544</td>
			<td>Initially provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViewSizer 3000</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Nanoparticle tracking instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles

De fysiologiska och patofysiologiska rollerna hos extracellulära blåsor (EVs) har blivit alltmer erkända, vilket gör EV-fältet till ett snabbt föränderligt forskningsområde. Det finns många olika metoder för EV-isolering, var och en med distinkta fördelar och nackdelar som påverkar EVs nedströms avkastning och renhet. Att karakterisera EV-prep isolerad från en viss källa med en vald metod är därför viktigt för tolkning av resultat i efterföljande led och jämförelse av resultat mellan laboratorier. Det finns olika metoder för att bestämma storlek och mängd av EVs, som kan ändras av sjukdomstillstånd eller som svar på yttre förhållanden. Nanopartikelspårningsanalys (NTA) är en av de framstående teknikerna som används för analys av enskilda EVs med hög genomströmning. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för kvantifiering och storleksbestämning av EVs isolerade från mus perigonadal fettvävnad och human plasma med hjälp av en genombrottsteknik för NTA som representerar stora framsteg inom området. Resultaten visar att denna metod kan ge reproducerbara och giltiga totala partikelkoncentrations- och storleksfördelningsdata för EVs som isolerats från olika källor med olika metoder, vilket bekräftas av transmissionselektronmikroskopi. Anpassningen av detta instrument för NTA kommer att ta itu med behovet av standardisering i NTA-metoder för att öka stringensen och reproducerbarheten i EV-forskningen.

Före denna demonstration testades instrumentets kalibrering först för att säkerställa giltigheten av de förvärvade uppgifterna genom att mäta storleksfördelningen av polystyrenpärlor. Vi testade storleksfördelningen av 100 nm och 400 nm pärlor med standardinspelningsparametrarna och de bearbetningsinställningar som rekommenderas i detta protokoll (figur 8).
För 100 nm polystyrenpärla mättes en koncentration på 4,205 x10 7 partiklar/ml. ...

Watch this Scientific Journal Video about Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles at JoVE.com

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Vi visar hur man använder ett nytt nanopartiklar spårning analys instrument för att uppskatta storleksfördelningen och den totala partikelkoncentrationen av extracellulära blåsor isolerade från mus perigonadal fettvävnad och human plasma.

Nanopartikelspårningsanalys för kvantifiering och storleksbestämning av extracellulära blåsor

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

NTA-resultat är mycket benägna att operatörens partiskhet. Det här protokollet visar effekterna av ändrade NTA-parametrar på erhållna resultat. En standardiserad metod hjälper till att öka noggrannheten och reproducerbarheten i NTA-analysen.Genom att analysera provet i en cuvette kan ett statistiskt slumpmässigt prov fångas i varje video. Detta resulterar i mer reproducerbara data och visualisering av partiklar över ett brett spektrum av storlekar. Eftersom det kan vara svårt att få ett prov i det rekommenderade partikelkoncentrationsområdet, se till att utföra en seriell utspädning för att identifiera den idealiska utspädningsfaktorn.Kungheng Cai, doktorand från Anthony Ferrantes laboratorium, visar att ingreppet kommer att visa att det blir Kungheng Cai. För att förbereda cuvette för nanopartikelspårningsanalys, täck arbetsytan med ett luddfritt material för att förhindra att fibrer kommer in i cuvettesna. Bär handskar, placera en cuvette som innehåller en omrörningsstång på den magnetiska cuvette jiggen.Använd ett krokverktyg för att placera insatsen i cuvetten med skåran på insatsen synlig på framsidan av cuvette. Använd en pipett för att långsamt lägga till 400 till 500 mikroliter renade extracellulära vesiklar på cuvetten genom hålet i insatsen och blanda provet genom att försiktigt pipettera utan att införa luftbubblor, sedan kapa cuvetten, knacka ut bubblor vid behov och använda en luddfri trasa för att torka av cuvettes utsida. Om du vill analysera spädnings- eller ett provspartikelkoncentration slår du på datorns arbetsstation och instrument och startar analysprogrammet för partikelspårning.När du uppmanas att göra det klickar du på NTA och öppnar inspelningsfliken. Följ anvisningarna på skärmen för att fylla i all nödvändig exempelinformation. För EV-spårningsanalys ställer du in spädnings utflödet på PBS.Salthalten fylls i automatiskt till 9 %För att erhålla spädnings- eller provpartikelkoncentrationen öppnar du instrumentlocket och tar bort skyddslocket där cuvetten placeras. Ladda cuvette i instrumentet i rätt riktning med skåran på insatsen vänd mot kameran och sätt tillbaka locket och instrumentlocket. Klicka på strömningspilen för att slå på kameran och klicka på sparrpilen för att utöka postinställningarna.Justera fokus tills de relativt små partiklarna är tydligt synliga. För att ställa in analysen för en liten EV-kvantifiering ställer du in bildhastigheten på 30 bilder per sekund, exponeringen för 15 millisekunder, omrörningstiden till fem sekunder, väntetiden till tre sekunder, den blå, gröna och röda laserkraften till 210, 12 respektive 8 milliwatt, bildrutorna per video till 300 och vinsten till 30 decibel. Justera fokus tills de relativt små partiklarna är tydligt synliga.Att öka zoomen och/eller vinsten kan hjälpa till med partikelin fokusering. Men om du ökar vinsten, kom ihåg att ställa in den på 30 decibel före inspelningen. När partiklarna är i fokus ställer du in zoominställningen på 0,5X för att spara bandbredd och för att förhindra förlustramar och klicka på spela in för att börja spela in videon.När en fråga visas om att videorna har spelats in klickar du på OK för att slutföra inspelningen och väljer processfliken. Om mycket stora partiklar var synliga i någon video under inspelningen, navigera till katalogen med inspelade videor och ta bort eventuell problematisk video före bearbetning. Markera kryssrutan åsidosättning av inaktivera ljuddetektering och ställ in funktionsdiametern på 30.Klicka på process för att initiera videobearbetning och visa ett livedistributionsdiagram. När bearbetningen är klar klickar du på OK och väljer fliken Rita. För elfordon visar du huvuddiagrammet som loggfackselica.Andra funktioner i diagrammet, till exempel att ändra x-axeln för att ställa in området för integrering av den producerade figuren, kan anpassas. Om du vill skapa en PDF-rapport över resultaten klickar du på rapportknappen. Medelvärdet, medianvärdet, lägesstorleken och koncentrationen som justerats för utspädningsfaktorn och fördelningsbredden visas.NTA av spädningsprovet bör utföras före varje prov så att koncentrationen av detta blindprov kan subtraheras från ev-provpartikelkoncentrationen. För att rengöra cuvettes efter analys, töm cuvette och fyll helt cuvettesna 10 till 15 gånger med avjoniserat vatten och de tre gångerna med 70 till 100% etanol för att ta bort eventuellt restprov. Torka utsidan av cuvettesna med en luddfri mikrofiberduk och torka insidan med en tryckluftsdyster.För att rengöra skären och omrörningsstängerna, placera materialen i en glasscintillationsflaska som innehåller 70 till 100% etanol och skaka injektionsflaskan kraftigt. Skölj sedan inläggen och rör om stängerna i avjoniserat vatten med skakningar som påvisats och torka dem med luddfria dukar. Efter torkning, placera omedelbart alla rena komponenter i förvaring tills nästa analys.Innan en analys utfördes testades instrumentkalibreringen med polystyrenpärlor för att säkerställa giltigheten av de förvärvade uppgifterna. Som observerats rapporterade partikelspårningsinstrumentet exakt storleken på 100 nanometer manodisperse pärlor, men rapporterade bara nära storleken på 400 nanometer pärlor. Därför var instrumentinställningarna för detta protokoll mer exakta för mindre partiklar, närmare 100 nanometer i storlek.Med hjälp av dessa inställningar skalar rapporterade partikelkoncentrationsskalor i enlighet därmed med utspädningsfaktorn som visar att instrumentet exakt kan upptäcka partikelkoncentrationen vid olika utspädningar med liten variation mellan tekniska replikanter. Den optimala utspädningen för ett 4,41 gånger 10 till 10: e partiklar per milliliter musvävnad-härlett EV-prov bestämdes vara mellan 1, 000 och 3, 000. I denna analys ökade ökningen kamerans känslighet, vilket möjliggör en ökning av visualiseringen av ett högre antal mindre partiklar.Genom att öka den blå lasereffekten från 70 till 210 milliwatt samtidigt som den gröna och röda laserkraften konstant behölls flyttades den rapporterade genomsnittliga partikelstorleken från 122 till 105 nanometer och den rapporterade totala partikelkoncentrationen ökade från 1,1 gånger 10 till åttonde till 1,7 gånger 10 till den åttonde. Genom att öka kraften hos den röda lasern ökade den rapporterade genomsnittliga partikelstorleken från 175 till 246 nanometer och minskade den rapporterade totala partikelkoncentrationen. En ökning av den gröna lasereffekten resulterade i en minskning av den rapporterade genomsnittliga partikelstorleken och en ökning av den rapporterade totala partikelkoncentrationen.Att hitta rätt utspädning för att placera ett prov inom det optimala detektionsområdet kan ta några försök för varje prov. Cuvette-rengöringen kräver också extra noggrann hantering. Vi rekommenderar att du tillämpar mer än en orthogonal metod för EV partikelstorlek och koncentrationsmätningar.Dynamisk ljusspridning, resistiv pulsavkänning, transmissionselektronmikroskopi och interferometrisk avbildningsavkänning med en partikel kan också utföras för att karakterisera EVs.

Research

JoVE Journal

Biology

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

Betydelsen av korrekt proteinkoncentration för kinetik och affinitet Bestämning i struktur och funktion Analys

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

En innovativ metod för Exosome Kvantifiering och storlek Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

En snabb och specifik mikroplattor analys för bestämning av Intra-och extracellulära Askorbat i odlade celler

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Tekniker för analys av extracellulärt Blåsor Använda flödescytometri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow flödescytometrisk analys av extracellulära blåsor från Cell-villkorade Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Rening och analys av Caenorhabditis elegans Extracellulära blåsor

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes

Automatiserad avbildning och analys för kvantifiering av fluorescerande märkta makropinosomer

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and ...

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Extracellulär vesicle uptake assay via confocal mikroskop imaging analys

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular ...

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

Direkt stokastisk optisk rekonstruktion mikroskopi av extracellulära blåsor i tre dimensioner

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Skalbar isolering och rening av extracellulära vesiklar från Escherichia coli och andra bakterier

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...