Name: nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles
Uploaded: 2021-03-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles at JoVE.com

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (ES030973-01A1, R01ES025225, R01DK066525, P30DK026687, P30DK063608) tarafından desteklenmiştir. Jeffrey Bodycomb'u, HORIBA Instruments Incorporated'ın doktorasını, cihazı kalibre etmedeki yardımı için kabul ediyoruz.

Bu numunelerle yapılan tüm çalışmalar Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi ve Kurumsal İnceleme Kurulu yönergelerine uygun olarak gerçek gerçekleştirildi. Şekil 2'de NTA yöntemine şematik bir genel bakış resmedilmiştir.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62447/62447fig02.jpg"> Şekil 2: Parçacık izleme aletini kullanarak NTA yöntemine genel ...

<ol>
	<li>Colombo, M., Raposo, G., Th&#233;ry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+secretion,+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).</li><li>Hessvik, N. P., Llorente, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+knowledge+on+exosome+biogenesis+and+release.">Current knowledge on exosome biogenesis and release.</a> Cellular and molecular life sciences: CMLS. 75, 193-208 (2018).</li><li>Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+formation+during+reticulocyte+maturation.+Association+of+plasma+membrane+activities+with+released+vesicles+(exosomes).">Vesicle formation during reticulocyte maturation. Association of plasma membrane activities with released vesicles (exosomes).</a> The Journal of Biological Chemistry. 262, 9412-9420 (1987).</li><li>Th&#233;ry, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses.">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nature Reviews Immunology. 9, 581-593 (2009).</li><li>Y&#225;&#241;ez-M&#243;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066 (2015).</li><li>Lo Cicero, A., Stahl, A., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+shuffling+intercellular+messages:+for+good+or+for+bad.">Extracellular vesicles shuffling intercellular messages: for good or for bad.</a> Current Opinion in Cell Biology. 35, 69-77 (2015).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200, 373-383 (2013).</li><li>Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+extracellular+organelles+important+in+intercellular+communication.">Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication.</a> Journal of Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+and+technologies+for+exosome+isolation+and+characterization.">Methods and technologies for exosome isolation and characterization.</a> Small Methods. 2, 1800021 (2018).</li><li>Szatanek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+methods+of+choice+for+extracellular+vesicles+(EVs)+characterization.">The methods of choice for extracellular vesicles (EVs) characterization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).</li><li>Erdbr&#252;gger, U., Lannigan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+challenges+of+extracellular+vesicle+detection:+A+comparison+of+different+techniques.">Analytical challenges of extracellular vesicle detection: A comparison of different techniques.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 89, 123-134 (2016).</li><li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Extracellular+Vesicles:+General+Methodologies+and+Latest+Trends.">Isolation of Extracellular Vesicles: General Methodologies and Latest Trends.</a> BioMed Research International. 2018, 1-27 (2018).</li><li>Cvjetkovic, A., L&#246;tvall, J., L&#228;sser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+rotor+type+and+centrifugation+time+on+the+yield+and+purity+of+extracellular+vesicles.">The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li><li>Taylor, D. D., Shah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+isolating+extracellular+vesicles+impact+down-stream+analyses+of+their+cargoes.">Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes.</a> Methods. 87, 3-10 (2015).</li><li>Desd&#237;n-Mic&#243;, G., Mittelbrunn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+exosomes+in+the+protection+of+cellular+homeostasis.">Role of exosomes in the protection of cellular homeostasis.</a> Cell Adhesion &amp; Migration. 11, 127-134 (2017).</li><li>Kanemoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivesicular+body+formation+enhancement+and+exosome+release+during+endoplasmic+reticulum+stress.">Multivesicular body formation enhancement and exosome release during endoplasmic reticulum stress.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 480, 166-172 (2016).</li><li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke+extract+induced+exosome+release+is+mediated+by+depletion+of+exofacial+thiols+and+can+be+inhibited+by+thiol-antioxidants.">Cigarette smoke extract induced exosome release is mediated by depletion of exofacial thiols and can be inhibited by thiol-antioxidants.</a> Free Radical Biology &amp; Medicine. 108, 334-344 (2017).</li><li>Saeed-Zidane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+exosome+mediated+molecular+defense+mechanism+in+bovine+granulosa+cells+exposed+to+oxidative+stress.">Cellular and exosome mediated molecular defense mechanism in bovine granulosa cells exposed to oxidative stress.</a> PloS One. 12, 0187569 (2017).</li><li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stress-dependent+autophagy+component+release+via+extracellular+nanovesicles+in+tumor+cells.">Mechanical stress-dependent autophagy component release via extracellular nanovesicles in tumor cells.</a> ACS Nano. 13, 4589-4602 (2019).</li><li>King, H. W., Michael, M. Z., Gleadle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxic+enhancement+of+exosome+release+by+breast+cancer+cells.">Hypoxic enhancement of exosome release by breast cancer cells.</a> BMC Cancer. 12, 421 (2012).</li><li>Bonzini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+particulate+matter+exposure+induces+extracellular+vesicle+release+in+overweight+subjects.">Short-term particulate matter exposure induces extracellular vesicle release in overweight subjects.</a> Environment Research. 155, 228-234 (2017).</li><li>Neri, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particulate+matter+induces+prothrombotic+microparticle+shedding+by+human+mononuclear+and+endothelial+cells.">Particulate matter induces prothrombotic microparticle shedding by human mononuclear and endothelial cells.</a> Toxicology In Vitro. 32, 333-338 (2016).</li><li>Flaherty, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lipase-independent+pathway+of+lipid+release+and+immune+modulation+by+adipocytes.">A lipase-independent pathway of lipid release and immune modulation by adipocytes.</a> Science. 363, 989-993 (2019).</li><li>van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles.">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 19, 213-228 (2018).</li><li>Dragovic, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis.">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 7, 780-788 (2011).</li><li>Saveyn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+particle+size+distribution+determination+by+nanoparticle+tracking+analysis+based+on+2-D+Brownian+dynamics+simulation.">Accurate particle size distribution determination by nanoparticle tracking analysis based on 2-D Brownian dynamics simulation.</a> Journal of Colloid and Interface Science. 352, 593-600 (2010).</li><li>Vander Meeren, P., Kasinos, M., Saveyn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relevance+of+two-dimensional+Brownian+motion+dynamics+in+applying+nanoparticle+tracking+analysis.">Relevance of two-dimensional Brownian motion dynamics in applying nanoparticle tracking analysis.</a> Methods in Molecular Biology. , 525-534 (2012).</li><li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+evaluation+of+Nanoparticle+Tracking+Analysis+(NTA)+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates.">Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27, 796-810 (2010).</li><li>Bachurski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicle+measurements+with+nanoparticle+tracking+analysis+-+An+accuracy+and+repeatability+comparison+between+NanoSight+NS300+and+ZetaView.">Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis - An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1596016 (2019).</li><li>Varga, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hollow+organosilica+beads+as+reference+particles+for+optical+detection+of+extracellular+vesicles.">Hollow organosilica beads as reference particles for optical detection of extracellular vesicles.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16, 1646-1655 (2018).</li><li>Serrano-Pertierra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Current+analytical+techniques+for+detection+and+quantification.">Extracellular vesicles: Current analytical techniques for detection and quantification.</a> Biomolecules. 10, (2020).</li><li>Maguire, C. M., R&#246;sslein, M., Wick, P., Prina-Mello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+particles+in+solution+-+a+perspective+on+light+scattering+and+comparative+technologies.">Characterisation of particles in solution - a perspective on light scattering and comparative technologies.</a> Science and Technology of Advanced Materials. 19, 732-745 (2018).</li><li>Bohren, C. F., Huffman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , (1983).</li></ol>

Burada, çok çeşitli parçacık boyutlarının boyut dağılımını aynı anda ölçmek ve bir polidisperz örneğinde toplam EV konsantrasyonu ölçmek için EV'lerin NTA'sı için bir protokol gösteriyoruz. Bu çalışmada EV'lerin kaynağı olarak fare perigonadal yağ dokusu ve insan plazması kullanılmıştır. Bununla birlikte, diğer dokulardan izole edilen EV'ler veya serum, idrar, tükürük, anne sütü, amniyotik sıvı ve hücre kültürü süpernatantı gibi biyolojik sıvılar da NTA için kullanılabi...

Hücre dışı veziklinler (EV' ler) hemen hemen tüm hücre tipleri tarafından salgılanan küçük (0,03-2 μm) membran bağlı veziküllerdir1. Serbest bırakma mekanizmalarına ve boyut2'yebağlı olarak genellikle "ekzozomlar", "mikrovesiküller" veya "apoptotik cisimler" olarak adlandırılırlar. Başlangıçta EV'lerin homeostaz3'ükorumak için hücredeki atıkları ortadan kaldırmanın bir aracı olduğu düşünülürken, artık DNA, RNA (mRNA, mikroRNA), lipitler ve proteinler4,5 dahil olmak üzere moleküler materyal transferi yoluyla hücreler arası iletişime de katılabileceklerini ve normal fizyolojinin yanı sıra patolojik süreçlerin önemli düzenleyicileri olduklarını biliyoruz1. 5,6,7,8.
Başka bir yerde açıklananEV'leriizole etmek ve ölçmek için birçok farklı yöntem vardır 9,10,11,12. Kullanılan izolasyon protokolü ve EV'lerin kaynağı EV verimini ve saflığını büyük ölçüde etkileyebilir. Uzun zamandır eksozom izolasyonu için "altın standart" yaklaşımı olarak kabul edilen diferansiyel santrifüjleme bile, elde edilen EV popülasyonunu ve aşağı akış analizlerini etkileyen önemli değişkenliğe maruz kalabilir13. Bu nedenle, EV izolasyonu ve nicelleştirme için çeşitli farklı metodolojiler, literatürde bildirilen deneylerin sonuçlarını karşılaştırmayı, çoğaltmayı ve yorumlamayı zorlaştırır14. Ayrıca, EV salınımı hücresel koşullar veya çeşitli dış faktörler tarafından düzenlenebilir. EV'lerin hücreleri hücre içi strese karşı koruyarak hücresel homeostazın korunmasında rol oynadığı öne sürülüyor15Hücresel stresin EV salgısını uyardığını gösteren çeşitli çalışmalar. Örneğin, hipoksi, endoplazmik retikülum stresi, oksidatif stres, mekanik stres, sigara dumanı özü ve partikül madde hava kirliliği 16 , 17 , 18,19, 20,21,22'ye hücresel maruziyet sonrası artan EV salınımı bildirilmiştir. EV sürümünün de vivo olarak değiştirildiği gösterilmiştir; on altı saat boyunca yüksek yağlı bir diyete veya oruç tutmaya maruz kalan fareler daha fazla adipositEV'si serbest bırakıldı 23. Belirli bir tedavinin veya durumun EV salınımını değiştirip değiştirmediğini araştırmak için EV sayısı doğru bir şekilde belirlenmelidir. EV boyut dağılımının değerlendirilmesi, EV'lerin baskın hücre altı kökenini de gösterebilir (örneğin, geç endozomların / multivesiküler cisimlerin plazma zarı ile füzyonu ve plazma zarının tomurcuklanmaları)24. Bu nedenle, çalışılan EV hazırlığının toplam konsantrasyonu ve boyut dağılımını doğru bir şekilde ölçmek için sağlam yöntemlere ihtiyaç vardır.
Çözeltideki EV'lerin görselleştirilmesi ve karakterizasyonu için hızlı ve son derece hassas bir yöntem nanopartikül izleme analizidir (NTA). Bu yöntemin ilkelerinin ayrıntılı bir açıklaması ve EV büyüklüğü ve konsantrasyonunun değerlendirilmesi için alternatif yöntemlerle karşılaştırılması daha önceaçıklanmıştır 25,26,27,28. Kısaca, NTA ölçümü sırasında, EV'ler bir lazer ışını ile ışınlandıklarında saçılan ışık tarafından görselleştirilir. Dağınık ışık, parçacık hareketini kaydeden bir kameraya mikroskopla odaklanır. NTA yazılımı, Stokes-Einstein denklemini kullanarak her parçacığın boyutunu hesaplamak için kullanılan difüzyon katsayısını belirlemek için Brownian hareketi olarak bilinen her parçacığın rastgele termal hareketini izler. NTA ilk olarak 2011 yılında biyolojik bir örneklemde EV ölçümüne uygulanmıştır25. Yakın zamana kadar, diğer NTA tekniklerinin önemli sınırlamalarını aşmak için yeni donanım ve yazılım çözümlerinin bir kombinasyonunu kullanan ViewSizer 3000'in (bundan böyle parçacık izleme cihazı olarak anılacaktır) tanıtımına kadar ticari NTA enstrümanları29 sunan sadece iki ana akım şirket vardı.
Parçacık izleme cihazı, Brownian hareketlerini analiz ederek sıvı numunelerdeki nanopartikülleri karakterize eder ve yerçekimsel çökeltme analiz ederek daha büyük mikron boyutlu parçacıkları karakterize eder. Üç lazer ışık kaynağına (450 nm, 520 nm ve 635 nm'de) sahip multispektral aydınlatma içeren bu cihazın benzersiz optik sistemi, araştırmacıların çok çeşitli parçacık boyutlarını (örneğin, ekzozomlar, mikrovesiküller) aynı anda analiz etmelerini sağlar. Cihaz kurulumunun şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.
Burada, yeni bir NTA cihazı kullanarak izole fare ve insan EV'lerinin parçacık boyutu dağılımı ve konsantrasyon ölçümlerinin nasıl gerçekleştirildiğini gösteriyoruz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62447/62447fig01.jpg"> Şekil 1: Parçacık izleme cihazı optik sistemi. NTA cihazı, aşağıdaki dalga boylarına sahip üç lazer kullanarak parçacıkları aydınlatır: 450 nm, 520 nm, 635 nm. Tek tek parçacıklardan gelen dağınık ışığın video kaydı, cuvette'den 90° odaklı bir dijital video kamera tarafından algılanır ve izlenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62447/62447fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X dPBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0119-1000</td>
			<td>To dilute samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 nm bead standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3100A</td>
			<td>To test ViewSizer 3000 calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 nm bead standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3400A</td>
			<td>To test ViewSizer 3000 calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Amicon</td>
			<td>UFC901024</td>
			<td>To filter PBS diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collection tubes, 2 mL</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19201</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed air duster</td>
			<td>DustOff</td>
			<td>DPSJB-12</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette insert</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cuvette jig</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>To align magnetic stir bar while placing inserts inside cuvette; Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>De-ionized water</td>
			<td>VWR</td>
			<td>02-0201-1000</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer with monitor, keyboard, mouse, and all necessary cables</td>
			<td>Dell</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (70-100%)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>-</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExoQuick ULTRA</td>
			<td>System Biosciences</td>
			<td>EQULTRA-20A-1</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass scintillation vials with lids</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>B780020</td>
			<td>To clean cuvettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#34;Hook&#34; tool</td>
			<td>Excelta</td>
			<td>-</td>
			<td>Provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lint-free microfiber cloth</td>
			<td>Texwipe</td>
			<td>TX629</td>
			<td>To clean cuvettes and cover work surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes, 2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22363344</td>
			<td>For isolation of human plasma extracellular vesicles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir bar</td>
			<td>Sp Scienceware</td>
			<td>F37119-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suprasil Quartz cuvette with cap</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>AG1000-0544</td>
			<td>Initially provided with purchase of ViewSizer 3000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViewSizer 3000</td>
			<td>HORIBA Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>Nanoparticle tracking instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nanoparticle tracking analysis for the quantification and size determination of extracellular vesicles

Hücre dışı veziküllerin (EV) fizyolojik ve patofizyolojik rolleri giderek daha fazla tanınmaya devam ederek EV alanını hızla gelişen bir araştırma alanı haline getirmektedir. EV izolasyonu için, her biri EV'lerin aşağı akış verimini ve saflığını etkileyen farklı avantajlara ve dezavantajlara sahip birçok farklı yöntem vardır. Bu nedenle, belirli bir kaynaktan izole edilen EV hazırlığının seçilen bir yöntemle karakterize etmek, aşağı akış sonuçlarının yorumlanması ve sonuçların laboratuvarlar arasında karşılaştırılması için önemlidir. Hastalık durumlarıyla veya dış koşullara yanıt olarak değiştirilebilen EV'lerin boyutunu ve miktarını belirlemek için çeşitli yöntemler mevcuttur. Nanopartikül izleme analizi (NTA), bireysel EV'lerin yüksek verimli analizi için kullanılan önemli teknolojilerden biridir. Burada, NTA için alandaki büyük ilerlemeleri temsil eden çığır açan bir teknoloji kullanarak fare perigonadal yağ dokusundan ve insan plazmasından izole edilen EV'lerin nicelleştirilmesi ve boyut tespiti için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Sonuçlar, bu yöntemin iletim elektron mikroskopisi ile doğrulanan farklı yöntemler kullanarak farklı kaynaklardan izole edilen EV'ler için tekrarlanabilir ve geçerli toplam parçacık konsantrasyonu ve boyut dağılımı verileri sunabileceğini göstermektedir. Bu enstrümanın NTA için uyarlanması, EV araştırmalarında titizliği ve tekrarlanabilirliği artırmak için NTA yöntemlerinde standardizasyon ihtiyacını giderecektir.

Bu gösteriden önce, polistiren boncuk standartlarının boyut dağılımını ölçerek elde edilen verilerin geçerliliğini sağlamak için cihazın kalibrasyonu ilk kez test edildi. Varsayılan kayıt parametrelerini ve bu protokolde önerilen işleme ayarlarını kullanarak 100 nm ve 400 nm boncukların boyut dağılımını test ettik (Şekil 8).
100 nm polistiren boncuk standardı için 4.205 x 107 partikül/mL konsantrasyon ölçüldü. Ortalam...

Watch this Scientific Journal Video about Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles at JoVE.com

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Fare perigonadal yağ dokusundan ve insan plazmasından izole edilmiş hücre dışı veznelerin boyut dağılımını ve toplam partikül konsantrasyonu tahmin etmek için yeni bir nanopartikül izleme analiz aracının nasıl kullanılacağını gösteriyoruz.

Hücre Dışı Veziklinlerin Nicelleştirilmesi ve Boyut Tayini için Nanopartikül Takip Analizi

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

NTA sonuçları operatör önyargısına çok eğilimlidir. Bu protokol, değiştirilen NTA parametrelerinin elde edilen sonuçlar üzerindeki etkilerini gösterir. Standartlaştırılmış bir yöntem, NTA analizinde titizliği ve tekrarlanabilirliği artırmaya yardımcı olacaktır.Bir cuvette örnek analiz her videoda istatistiksel olarak rastgele bir örnek yakalanmasını sağlar. Bu, daha tekrarlanabilir veriler ve çok çeşitli boyutlardaki parçacıkların görselleştirilmesiyle sonuçlanır. Önerilen partikül konsantrasyon aralığında bir örnek almak zor olabileceğinden, ideal seyreltme faktörünü tanımlamak için seri bir seyreltme gerçekleştirdiğinden emin olun.Prosedürü gösteren kişi Anthony Ferrante'nin laboratuvarından doktora öğrencisi Kungheng Cai olacak. Cuvette'i nanopartikül izleme analizine hazırlamak için, liflerin cuvettes'e girmesini önlemek için çalışma alanını tüy bırakmayan bir malzemeyle örtün. Eldiven giyerek, manyetik cuvette jig üzerine bir karıştırma çubuğu içeren bir cuvette yerleştirin.Kesici ucu cuvette'in önünde görünen kesici ucun çentiğiyle cuvette içine yerleştirmek için bir kanca aracı kullanın. Bir pipet kullanarak, kesici uçtaki delikten cuvette üzerine 400 ila 500 mikrolitre saflaştırılmış vezikül eklemek için bir pipet kullanın ve hava kabarcıkları sokmadan hafifçe pipetleme yaparak numuneyi karıştırın, ardından cuvette'i kaplayın, kabarcıklara gerektiği gibi dokunun ve cuvette'in dış yüzeyini silmek için tüy bırakmayan bir bez kullanın. Seyrelticinin veya bir numunenin parçacık konsantrasyonu analiz etmek için bilgisayar iş istasyonunu ve aleti açın ve parçacık izleme analiz programını başlatın.İstendiğinde, NTA'yı tıklatın ve kayıt sekmesini açın. Gerekli tüm örnek bilgileri doldurmak için ekrandaki yönergeleri izleyin. EV izleme analizi için seyrelticiyi PBS olarak ayarlayın.Tuzluluk% 9'a otomatik olarak doldurulur Seyreltici veya örnek parçacık konsantrasyonu elde etmek için, cihaz kapağını açın ve cuvette'in yerleştirileceği koruyucu kapak kaplamasını çıkarın. Cuvette'i fotoğraf makinesine bakan kesici ucun çentiğiyle doğru yönde cihaza yükleyin ve kapağı ve enstrüman kapağını değiştirin. Kamerayı açmak için akış okını tıklatın ve kayıt ayarlarını genişletmek için köşeli çift ayraç okını tıklatın.Nispeten küçük parçacıklar açıkça görünene kadar odağı ayarlayın. Küçük bir EV niceleme için analizi ayarlamak için kare hızını saniyede 30 kareye, 15 milisaniyeye, karıştırma süresini beş saniyeye, bekleme süresini üç saniyeye, mavi, yeşil ve kırmızı lazer güçlerini sırasıyla 210, 12 ve 8 miliwatt'a, video başına kareleri 300'e ve kazancı 30 desibel'e ayarlayın. Nispeten küçük parçacıklar açıkça görünene kadar odağı ayarlayın.Yakınlaştırmayı ve/veya kazancı artırmak parçacık odaklamada yardımcı olabilir. Ancak kazancı artırırsanız, kaydetmeden önce 30 desibel olarak ayarlamayı unutmayın. Parçacıklar netlemedeyken, bant genişliğinden tasarruf etmek ve kayıp karelerini önlemek için yakınlaştırma ayarını 0,5X olarak ayarlayın ve videoyu kaydetmeye başlamak için kayıt'ı tıklayın.Videoların kaydedildiğini belirten bir istem göründüğünde, kaydı tamamlamak ve işlem sekmesini seçmek için Tamam'ı tıklatın. Kayıt yaparken herhangi bir videoda çok büyük parçacıklar görünüyorsa, kaydedilen videoların dizinine gidin ve işlemeden önce sorunlu videoları kaldırın. Ses algılamayı devre dışı bırak geçersiz kılma kutusunu işaretleyin ve özellik çapını 30 olarak ayarlayın.Video işlemeyi başlatmak ve canlı bir dağıtım grafiği görüntülemek için işlem'i tıklatın. İşlem tamamlandığında Tamam'ı tıklatın ve çizim sekmesini seçin. EV'ler için ana grafiği günlük kutusu silikası olarak görüntüleyin.Grafiğin, üretilen figürün entegrasyonu için alanı ayarlamak üzere x eksenini değiştirmek gibi diğer özellikleri özelleştirilebilir. Sonuçların PDF raporunu oluşturmak için rapor düğmesini tıklatın. Seyreltme faktörü ve dağılım genişliği için ayarlanan ortalama, ortanca, mod boyutu ve konsantrasyon görüntülenir.Seyrelticinin NTA'sı herhangi bir numuneden önce yapılmalıdır, böylece bu boşluğun konsantrasyonu EV numune parçacık konsantrasyonundan çıkarılabilir. Analizden sonra cuvetteleri temizlemek için, cuvette'i boşaltın ve cuvetteleri 10 ila 15 kez deiyonize suyla ve üç kez% 70 ila 100 etanol ile doldurarak artık numuneyi çıkarın. Cuvettes'in dışını tüy bırakmayan bir mikrofiber bezle kurulayın ve içini basınçlı hava tozlayıcı ile kurulayın.Kesici uçları temizlemek ve çubukları karıştırmak için malzemeleri% 70 ila 100 etanol içeren bir cam scintillation şişesine yerleştirin ve şişeyi kuvvetlice çalkalayın. Daha sonra kesici uçları durulayın ve çubukları gösterildiği gibi sallayarak deiyonize suda karıştırın ve tüy bırakmayan bezler kullanarak kurutun. Kuruduktan sonra, bir sonraki analize kadar tüm temiz bileşenleri derhal depoya yerleştirin.Bir analiz yapmadan önce, elde edilen verilerin geçerliliğini sağlamak için polistiren boncuklar kullanılarak cihaz kalibrasyonu test edildi. Gözlemlendiği gibi, parçacık izleme cihazı 100 nanometre manodisperse boncukunun boyutunu doğru bir şekilde bildirdi, ancak sadece 400 nanometre boncukunun boyutunu yakından bildirdi. Bu nedenle, bu protokolün cihaz ayarları daha küçük parçacıklar için daha doğru, 100 nanometreye yakın boyuttaydı.Bu ayarları kullanarak, cihazın teknik kopyalar arasında çok az değişkenlik ile çeşitli seyreltmelerde parçacık konsantrasyonunu doğru bir şekilde tespit edebildiğine dair seyreltme faktörü ile rapor edilen parçacık konsantrasyonu ölçeklenir. Mililitre fare dokusundan türetilmiş EV örneği başına 4,41 çarpı 10 ila 10.partiküller için optimum seyreltmenin 1.000 ila 3.000 arasında olduğu belirlendi. Bu analizde, kazancı artırmak kameranın hassasiyetini artırarak daha fazla sayıda küçük parçacığın görselleştirilmesinde bir artışa izin verir.Mavi lazer gücünü 70'ten 210 miliwatt'a yükseltirken yeşil ve kırmızı lazer güçlerini sabit tutmak, bildirilen ortalama parçacık boyutunu 122'den 105 nanometreye kaydırdı ve bildirilen toplam parçacık konsantrasyonu 1,1 çarpı 10'dan sekizinciye 1,7 kat sekizinciye yükseltti. Kırmızı lazerin gücünü artırmak, bildirilen ortalama partikül boyutunu 175'ten 246 nanometreye yükseltti ve bildirilen toplam parçacık konsantrasyonu azalttı. Yeşil lazer gücünün artırılması, bildirilen ortalama partikül boyutunda bir azalmaya ve bildirilen toplam partikül konsantrasyonunda bir artışa neden oldu.Bir numuneyi en uygun algılama aralığına yerleştirmek için doğru seyreltmeyi bulmak her örnek için birkaç deneme yapabilir. Cuvette temizliği de ekstra dikkatli kullanım gerektirir. EV partikül boyutu ve konsantrasyon ölçümleri için birden fazla ortogonal yöntem uygulanmasını öneririz.EV'leri karakterize etmek için dinamik ışık saçılımı, dirençli darbe algılama, iletim elektron mikroskopisi ve tek parçacıklı interferometrik reflektör görüntüleme algılaması da yapılabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

Kinetik ve Yapı-fonksiyon Analiz Affinity belirlenmesi Doğru Protein Konsantrasyonu Önemi

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Exosome Kantifikasyon ve Boyut Ölçüm Yenilikçi Yöntem

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

Kültür Hücrelerinin Intra-ve Ekstrasellüler Askorbat Belirlenmesi için hızlı ve spesifik bir Mikroplate Deneyi

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Akım Sitometri Kullanımı Ekstrasellüler Veziküller Analizi Teknikleri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Hücre şartına ortamdan hücre dışı veziküller sitometrik analizinde akışı

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Arınma ve Caenorhabditis elegans Ekstrasellüler Veziküllerin Analizi

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Automated Imaging and Analysis for the Quantification of Fluorescently Labeled Macropinosomes

Floresan Etiketli Makropinozomların Nicelleştirilmesi için Otomatik Görüntüleme ve Analiz

Macropinocytosis is a non-specific fluid-phase uptake pathway that allows cells to internalize large extracellular cargo, such as proteins, pathogens, and ...

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Extracellular Vesicle Uptake Assay via Confocal Microscope Imaging Analysis

Konfokal Mikroskop Görüntüleme Analizi ile Hücre Dışı Veziklin Alımı Analizi

There is a need for practical assays to visualize and quantify the cells' extracellular vesicle (EV) uptake. EV uptake plays a role in intercellular ...

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

Hücre Dışı Veziküllerin Üç Boyutlu Doğrudan Stokastik Optik Rekonstrüksiyon Mikroskopisi

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Scalable Isolation and Purification of Extracellular Vesicles from Escherichia coli and Other Bacteria

Ölçeklenebilir İzolasyon ve Escherichia coli ve Diğer Bakterilerden Hücre Dışı Veziküllerin Saflaştırılması

Diverse bacterial species secrete ~20-300 nm extracellular vesicles (EVs), comprised of lipids, proteins, nucleic acids, glycans, and other molecules ...