Name: a simplified method for generating kidney organoids from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-04-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Denne forskning er finansieret af National Institutes of Health R01 DK069403, UC2 DK126122 og P30-DK079307 og ASN Foundation for Kidney Research Ben J. Lipps Research Fellowship Program til AP.

Alle forsøg med hPSC'er blev udført i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer og blev udført i en klasse II biosikkerhedshætte med passende personlige værnemidler. Alle reagenser er cellekultur-grade, medmindre andet er angivet. Alle kulturer inkuberes ved 37 °C, 5 % CO2-luftatmosfære . På alle stadier af analysen kan embryoide legemer eller nyreorganoider indsamles og fastgøres eller forberedes til analyse. De hPSC-linjer, der bruges til at generere disse data, er blevet fuldt karakterise...

<ol>
	<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids.">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communications. 6, 8715 (2015).</li><li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury.">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li><li>Taguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+in+vivo+origin+of+metanephric+nephron+progenitors+enables+generation+of+complex+kidney+structures+from+pluripotent+stem+cells.">Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2013).</li><li>Przepiorski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+bioreactor-based+method+to+generate+kidney+organoids+from+pluripotent+stem+cells.">A simple bioreactor-based method to generate kidney organoids from pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 11 (2), 470-484 (2018).</li><li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids.">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communication. 6, 8715 (2015).</li><li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury.">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Taguchi, A., Nishinakamura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-order+kidney+organogenesis+from+pluripotent+stem+cells.">Higher-order kidney organogenesis from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).</li><li>Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+organoids+with+improved+collecting+duct+maturation+and+injury+modeling.">Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling.</a> Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).</li><li>Howden, S. E., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+using+defined+conditions.">Generating kidney organoids from human pluripotent stem cells using defined conditions.</a> Methods in Molecular Biology. 2155, 183-192 (2020).</li><li>Tanigawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin+is+superior+to+BMP7+for+efficient+maintenance+of+human+iPSC-derived+nephron+progenitors.">Activin is superior to BMP7 for efficient maintenance of human iPSC-derived nephron progenitors.</a> Stem Cell Reports. 13 (2), 322-337 (2019).</li><li>Sander, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+large-scale+production+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Protocol for large-scale production of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100150 (2020).</li><li>Ekblom, P., Thesleff, I., Miettinen, A., Saxen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+defined+medium+supplemented+with+transferrin.">Organogenesis in a defined medium supplemented with transferrin.</a> Cell Differentiation. 10 (5), 281-288 (1981).</li><li>Thesleff, I., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+transferrin+in+branching+morphogenesis,+growth+and+differentiation+of+the+embryonic+kidney.">Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 82, 147-161 (1984).</li><li>Freund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+redirects+differentiation+from+cardiogenic+mesoderm+and+endoderm+to+neuroectoderm+in+differentiating+human+embryonic+stem+cells.">Insulin redirects differentiation from cardiogenic mesoderm and endoderm to neuroectoderm in differentiating human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26 (3), 724-733 (2008).</li><li>Nishikawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimal+serum-free+defined+condition+for+in+vitro+culture+of+kidney+organoids.">An optimal serum-free defined condition for in vitro culture of kidney organoids.</a> Biochemistry and Biophysics Research Communication. 501 (4), 996-1002 (2018).</li><li>Oh, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+New+Zealand+donors.">Derivation of induced pluripotent stem cell lines from New Zealand donors.</a> Journal of the Royal Society of New Zealand. , 1-14 (2020).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney.">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2013).</li><li>Lam, A. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intermediate+mesoderm+that+forms+tubules+expressing+kidney+proximal+tubular+markers.">Rapid and efficient differentiation of human pluripotent stem cells into intermediate mesoderm that forms tubules expressing kidney proximal tubular markers.</a> Journal of American Society of Nephrology. 25 (6), 1211-1225 (2014).</li><li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+embryoid+body+microenvironment+to+direct+embryonic+stem+cell+differentiation.">Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation.</a> Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).</li><li>Imasawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+repatterns+human+podocyte+energy+metabolism+during+differentiation+and+diabetic+nephropathy.">High glucose repatterns human podocyte energy metabolism during differentiation and diabetic nephropathy.</a> FASEB Journal. 31 (1), 294-307 (2017).</li><li>Kim, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+condition+induces+autophagy+in+endothelial+progenitor+cells+contributing+to+angiogenic+impairment.">High glucose condition induces autophagy in endothelial progenitor cells contributing to angiogenic impairment.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (7), 1248-1252 (2014).</li><li>Piwkowska, A., Rogacka, D., Audzeyenka, I., Jankowski, M., Angielski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+concentration+affects+the+oxidant-antioxidant+balance+in+cultured+mouse+podocytes.">High glucose concentration affects the oxidant-antioxidant balance in cultured mouse podocytes.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 112 (6), 1661-1672 (2011).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+and+refinement+of+human+PSC-derived+kidney+organoid+differentiation+with+single-cell+transcriptomics.">Comparative analysis and refinement of human PSC-derived kidney organoid differentiation with single-cell transcriptomics.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 869-881 (2018).</li><li>Lei, X., Deng, Z., Duan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniform+embryoid+body+production+and+enhanced+mesendoderm+differentiation+with+murine+embryonic+stem+cells+in+a+rotary+suspension+bioreactor.">Uniform embryoid body production and enhanced mesendoderm differentiation with murine embryonic stem cells in a rotary suspension bioreactor.</a> Methods in Molecular Biology. , (2016).</li></ol>

Tidligere undersøgelser har vist, at de indledende protokoltrin er kritiske for mellemliggende mesodermdifferentiering 5,19,20, og derfor er det vigtigt at implementere en streng mediumsammensætning på dette stadium. Fjernelse af udefinerede komponenter såsom serum, albumin, proteinfrit hybridommedium II fra protokollens første fase kan bidrage til at forbedre den konsekvente differentieringseffektivitet mellem assays<sup c...

I de senere år er der udviklet en række protokoller til differentiering af humane pluripotente stamceller til nyreorganoider 1,2,3,4,5. Nyreorganoider har været et vigtigt redskab til at hjælpe forskningen i nye regenerative medicinske tilgange, modellere nyrerelaterede sygdomme, udføre toksicitetsundersøgelser og udvikling af terapeutiske lægemidler. På trods af deres brede anvendelighed har nyreorganoider begrænsninger såsom manglende modning, begrænset langsigtet dyrkningskapacitet in vitro og en mangel på flere celletyper, der findes i den menneskelige nyre 6,7,8. Nyligt arbejde har fokuseret på at forbedre niveauet af organoid modning, udvide kulturperioderne og udvide kompleksiteten af nyrecellepopulationer ved at ændre de eksisterende protokoller 9,10,11,12. I denne nuværende iteration af vores etablerede protokol 5,13 har vi modificeret mediumkomponenterne i protokollens første fase til et serumfrit basismedium suppleret med insulin-transferrin-selen-ethanolamin (ITSE), lipider, polyvinylalkohol (E5-ILP) og CHIR99021 (figur 1). Disse ændringer giver et fuldt defineret, serumfrit, proteinfattigt medium med færre komponenter end vores tidligere mediumsammensætning 5,13 og uden yderligere vækstfaktorer. Som følge heraf er det første trinmedium mindre arbejdskrævende at forberede end vores tidligere offentliggjorte version og kan reducere batch-til-batch-variabiliteten5. Tidligere undersøgelser har vist, at både insulin og transferrin er vigtige i serumfri kultur 14,15, men høje niveauer af insulin kan være hæmmende for mesodermdifferentiering16. Vi har opretholdt de lave insulinniveauer som angivet i den oprindelige protokol og yderligere reduceret niveauet af KOSR (indeholdende insulin) i anden fase af analysen. I overensstemmelse med andre protokoller for dannelse af nyreorganoider er lavere niveauer af KOSR gavnlige for at opretholde en balance mellem spredning og differentiering afnyrevævet 17. Derudover har vi sænket glukosekoncentrationen i vores fase II medium13.
Vores metode beskriver en opsætning til suspensionsassay af nyreorganoider, der giver op til ~ 1.000 organoider fra en indledende ~ 60% sammenflydende hPSC 100 mm kulturplade som beskrevet i den oprindelige publikation 5,13. Denne protokol kan let skaleres op til at starte med flere 100 mm eller 150 mm plader for yderligere at øge organoidtallene.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21-985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-adherence rinsing solution</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72054</td>
			<td>10 mM stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;disposable spinner flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-201-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Ultra-Low Attachment 6-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Slow-Speed Stirrers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-495-03</td>
			<td>Multi plate magnetic stirrer for spinner flask culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11054020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14-190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg / Oval Stirring Bars</td>
			<td>2mag</td>
			<td>PI20106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelta General-Purpose Tweezers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-456-103</td>
			<td>Keep sterile in the cell culture hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZBio Single Use Media Bottle, 250mL</td>
			<td>Foxx Life Sciences</td>
			<td>138-3211-FLS</td>
			<td>Used to make PVA 10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes (100 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Sterile Aspirating Pipet 2mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160; Cell Lifters - Cell lifter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Multi Function 3D Rotators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88-861-047</td>
			<td>Orbital shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1413302</td>
			<td>BME. Aliquot on ice and freeze. Another suitable matrix alternative is Matrigel or Cultrex.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td>GCDR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td>L-glutamine supplement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51-500-056</td>
			<td>ITSE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut&#160; Serum Replacement - Multi-Species</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A3181502</td>
			<td>KOSR. Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid Mixture 1, Chemically Defined</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>L0288-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 500mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2GPU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma&#160; Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 250mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2GPU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit</td>
			<td>2mag</td>
			<td>VMF 90250 U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive</td>
			<td>2mag</td>
			<td>VMF 40600</td>
			<td>6MSP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MP Biomedicals&#160; 7X Cleaning Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MP0976670A4</td>
			<td>Tissue culture suitable detergent. Make a 5% solution in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF, and mTeSR Plus medium have also been tested and are suitable alternatives.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50 mL Conical, Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-mpt</td>
			<td>Anti-mycoplasma reagent. Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer&#174; 200 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0776417</td>
			<td>Cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer&#174; 500 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0822591</td>
			<td>Cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol) 87-90% hydrolyzed&#160; (PVA)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P8136-250G</td>
			<td>10% in DPBS stirring at 98 degrees C until disolves, make in 138-3211-FLS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y-27632 (ROCKi)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td>10 mM stock in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Serological Pipets&#160; - 10mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Serological Pipets - 25mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Serological pipette - 5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-12D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeSR-E5</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5916</td>
			<td>Serum-free, low protein base medium for E5-ILP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variomag distriBOX 2 Distributor</td>
			<td>2mag</td>
			<td>VMF 90512</td>
			<td>If you use more than one MIXdrive</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simplified method for generating kidney organoids from human pluripotent stem cells

Nyreorganoider genereret fra hPSC'er har givet en ubegrænset kilde til nyrevæv. Humane nyreorganoider er et uvurderligt redskab til at studere nyresygdom og skade, udvikle cellebaserede terapier og teste nye terapier. Til sådanne anvendelser er der behov for et stort antal ensartede organoider og stærkt reproducerbare assays. Vi har bygget videre på vores tidligere offentliggjorte nyreorganoidprotokol for at forbedre organoidernes generelle sundhed. Denne enkle, robuste 3D-protokol involverer dannelsen af ensartede embryoide kroppe i minimumskomponentmedium indeholdende lipider, insulin-transferrin-selen-ethanolamintilskud og polyvinylalkohol med GSK3-hæmmer (CHIR99021) i 3 dage efterfulgt af dyrkning i knock-out serumerstatning (KOSR)-holdige medium. Derudover giver agiterende assays mulighed for reduktion i sammenklumpning af embryoidlegemerne og opretholdelse af en ensartet størrelse, hvilket er vigtigt for at reducere variabiliteten mellem organoider. Samlet set giver protokollen en hurtig, effektiv og omkostningseffektiv metode til generering af store mængder nyreorganoider.

I denne seneste version af vores protokol indledes nyreorganoiddifferentiering i et defineret, lavt proteinmedium. Assays udføres helt i suspension og er afhængige af hPSC's medfødte evne til differentiering og organisering til initiering af tubulogenese. Et enkelt assay, der stammer fra en 100 mm ~ 60% sammenflydende hPSC-kulturplade, giver rutinemæssigt 500-1.000 nyreorganoider, som vist i vores tidligere publikation5. På grund af et så stort antal genererede organoider er denne protokol v...

Watch this Scientific Journal Video about A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

Her beskriver vi en protokol til generering af nyreorganoider fra humane pluripotente stamceller (hPSC'er). Denne protokol genererer nyreorganoider inden for to uger. De resulterende nyreorganoider kan dyrkes i store spinnerkolber eller magnetiske omrøringsplader med flere brønde til parallelle lægemiddeltestmetoder.

En forenklet metode til generering af nyreorganoider fra humane pluripotente stamceller

Kidney organoids generated from hPSCs have provided an unlimited source of renal tissue. Human kidney organoids are an invaluable tool for studying kidney ...

Denne metode kan udføres i ethvert laboratorium udstyret til cellekulturforsøg. Ved hjælp af denne metode kan vi fremme vores forståelse af nyreudvikling og sygdomsforløb. Dette er en relativt enkel og billig metode sammenlignet med andre til generering af nyreorganoider.Den største udfordring ved denne teknik er at opretholde højkvalitets human pluripotent stamcellekultur. Det er afgørende, at cellerne opretholdes ved mindre end 80% sammenløb og opdeles regelmæssigt. Forskere, der er nye inden for human pluripotent stamcellekultur, bør gøre sig bekendt med stamcellelinjerne, før de fortsætter med differentiering.Begynd nyreorganoidassayet ved at tilsætte to milliliter komplet E5-ILP-medium i hver brønd af en seks-brønds ultra-lav fastgørelsesplade. Kultur humane pluripotente stamceller eller hPSC'er i 100 millimeter vævskulturbehandlede plader, indtil de når 60% sammenløb. HPSC'erne vaskes to gange med ca. otte ml DPBS.Aspirer DPBS, tilsæt derefter to milliliter Dispase dråbevis for at dække cellerne, og inkuber dem i seks minutter ved 37 grader Celsius. Vask cellerne tre gange med ca. 10 ml DPBS. Aspirer DPBS, vip derefter pladen med 45 grader, og skrab cellerne ned med en celleløfter.Vask kolonierne ned fra toppen med seks milliliter komplet E5-ILP-medium ved hjælp af en 10 ml serologisk pipette. Hold derefter pipetten lodret, opbryd store kolonier ved forsigtigt at pipettere op og ned, og pas på ikke at røre ved siderne af kulturpladen. Fordel koloniklyngerne jævnt ved at tilføje en milliliter pr. Brønd i pladen med seks brønde, og læg derefter pladen på en orbital ryster inde i en 37 grader Celsius inkubator.Alternativt, hvis en orbital shaker ikke er tilgængelig, kan cellerne dyrkes statisk. På dag to, efter at have ladet de embryoide kroppe slå sig ned i bunden af pladen, vippes pladen med 45 grader og aspirerer mediet langsomt fra toppen og efterlader en milliliter pr. Brønd. Tilsæt to ml tilberedt komplet medium pr. Brønd, og returner pladen tilbage til rysteren.På dag tre, efter at have aspireret mediet som tidligere påvist, samles alle embryoide kroppe omhyggeligt fra hver brønd ved hjælp af en 10 ml serologisk pipette og overfører dem til et 50 ml konisk rør. For at samle eventuelle resterende embryoide kroppe skal du skylle hver brønd med en milliliter DMEM med lavt glukoseindhold og tilsætte dem til det samme 50 ml koniske rør. Mens du venter på, at de embryoide kroppe sætter sig i bunden af røret, tilsættes to milliliter fase II-medium til hver brønd i den seks-brønds plade.Sigt derefter store embryoide kroppe ud ved at placere en 200 mikrometer cellesil oven på et nyt 50 milliliter konisk rør og pipettere alle embryoide kroppe omhyggeligt over cellesilen. Skyl cellesilen med yderligere fem milliliter DMEM for at opsamle eventuelle embryoide kroppe, der sidder fast i silen. På senere stadier skal du først bruge en 500 mikrometer sil til at sigte meget store embryoide kroppe ud, og derefter passere filtratet gennem en 200 mikrometer sil for at sigte meget små embryoide kroppe uden tubuli.Saml den korrekte størrelse embryoide kroppe, mellem 200 og 500 mikrometer, ved at vende 200 mikrometer silen til et nyt 50 milliliter rør og vaske silen med DPBS. Efter belastning skal du lade embryoide kroppe slå sig ned til bunden af det koniske rør, derefter aspirere supernatanten og vaske med ca. 10 ml DMEM. Derefter suspenderes embryoidlegemerne igen i seks milliliter fase II-medium.Overfør embryoidlegemerne tilbage til den seks-brønds ultra-lave fastgørelsesplade, fordel dem jævnt mellem brøndene. Da de fleste organoider samles øverst på pipetten, skal du forlade ca. en halv milliliter i enden og derefter forsigtigt røre spidsen til medierne i hver brønd, så organoider kan strømme ind i brønden. Embryoidlegemerne overføres til en 125 ml spinnerkolbe med 45 ml fase II-medium.Indstil den magnetiske omrøringshastighed til 120 o / min, og anbring kolben i inkubatoren. For at fodre embryoide legemer eller nyreorganoider skal du lade dem sætte sig kortvarigt til bunden af spinnerkolben, derefter løfte låget fra kolbens ene sidearm og placere den aspirerende pipette indeni med spidsen, der berører den modsatte indvendige væg. Vinkle pipetten langsomt ned, og aspirer ca. halvdelen af mediet.Genopfyld med 20 ml frisk fase II-medium ved at pipettere det gennem den samme åbning. Brug lange sterile tang til forsigtigt at placere en magnetisk omrøringsstang i hver brønd på en seks-brønds plade med embryoide kroppe eller nyreorganoider. Placer pladen på den sekshjulede magnetiske omrøringsplade, og indstil hastigheden til 120 o / min.For at de magnetiske omrøringsstænger skal klikke på plads og begynde at spinde, skal du først indstille effektniveauet til 100. Når alle stænger begynder at spinde, skal du bringe effektniveauet ned til 25. Oprethold nyreorganoiderne ved at ændre halvdelen af mediet som tidligere påvist.Immunofluorescens af paraffinsektioner på dag 14 nyreorganoider viser tilstedeværelse af nefronsegmenter såsom nyretubuli, der udtrykker hepatocyt nuklear faktor-1 beta og Lotus tetragonolobus lectin, samt podocytklynger, der udtrykker V-maf muskuloaponeurobiotisk fibrosarkom onkogen homolog B og nephrin. Modifikationerne i denne protokol kan understøtte udvidelse af endotelceller, som bekræftet ved farvning med blodplade- og endotelcelleadhæsionsmolekyle-1 på dag 26 i kulturen. Humane pluripotente stamceller skal behandles med Dispase i passende tid og derefter vaskes grundigt for at fjerne alle spor.Hvis Dispase ikke fjernes fuldstændigt, kan det føre til celledød og klyngedannelse af embryoide kroppe. Denne metode har hjulpet os med at undersøge udviklingen af medfødte nyresygdomme samt forskellige nyreskadeveje og potentiale for terapeutiske interventioner in vitro.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-fri Udledning af melanocytter fra menneskelige pluripotente stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Defineret og skalerbar Generation af hepatocyt-lignende celler fra menneskelige pluripotente stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Hurtig, instrueret differentiering af retinale Pigment epitel celler fra menneskelige embryonale eller induceret pluripotente stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation af standardiserede og reproducerbare forhjernen-type Cerebral Organoids fra menneskelige induceret pluripotente stamceller

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Effektiv differentiering af humane pluripotente stamceller i leverceller

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation af Somite derivater fra menneskelige induceret celler pluripotente stamceller

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

En statisk selvstyret metode til generering af hjerneorganoider fra menneskelige embryonale stamceller

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

In vitro Neuromuscular Junction Induced from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In vitro neuromuskulær junction induceret fra humane inducerede pluripotente stamceller

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized synapse that transmits action potentials from the motor neuron to skeletal muscle for mechanical ...

Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Rettet differentiering af hæmogene endotelceller fra humane pluripotente stamceller

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial ...