Name: a simplified method for generating kidney organoids from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-04-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Dit onderzoek werd gefinancierd door de National Institutes of Health R01 DK069403, UC2 DK126122 en P30-DK079307 en ASN Foundation for Kidney Research Ben J. Lipps Research Fellowship Program aan AP.

Alle experimenten met hPSC's werden uitgevoerd in overeenstemming met institutionele richtlijnen en werden uitgevoerd in een klasse II bioveiligheidskap met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. Alle reagentia zijn van celkweekkwaliteit, tenzij anders vermeld. Alle culturen worden geïncubeerd bij 37 °C, 5% CO2 luchtatmosfeer. In alle stadia van de test kunnen embryoïde lichamen of nierorganoïden worden verzameld en gefixeerd of voorbereid voor analyse. De hPSC-lijnen die zijn gebruikt om deze gegeve...

<ol>
	<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids.">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communications. 6, 8715 (2015).</li><li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury.">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li><li>Taguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+in+vivo+origin+of+metanephric+nephron+progenitors+enables+generation+of+complex+kidney+structures+from+pluripotent+stem+cells.">Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2013).</li><li>Przepiorski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+bioreactor-based+method+to+generate+kidney+organoids+from+pluripotent+stem+cells.">A simple bioreactor-based method to generate kidney organoids from pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 11 (2), 470-484 (2018).</li><li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids.">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communication. 6, 8715 (2015).</li><li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury.">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Taguchi, A., Nishinakamura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-order+kidney+organogenesis+from+pluripotent+stem+cells.">Higher-order kidney organogenesis from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).</li><li>Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+organoids+with+improved+collecting+duct+maturation+and+injury+modeling.">Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling.</a> Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).</li><li>Howden, S. E., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+using+defined+conditions.">Generating kidney organoids from human pluripotent stem cells using defined conditions.</a> Methods in Molecular Biology. 2155, 183-192 (2020).</li><li>Tanigawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin+is+superior+to+BMP7+for+efficient+maintenance+of+human+iPSC-derived+nephron+progenitors.">Activin is superior to BMP7 for efficient maintenance of human iPSC-derived nephron progenitors.</a> Stem Cell Reports. 13 (2), 322-337 (2019).</li><li>Sander, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+large-scale+production+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Protocol for large-scale production of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100150 (2020).</li><li>Ekblom, P., Thesleff, I., Miettinen, A., Saxen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+defined+medium+supplemented+with+transferrin.">Organogenesis in a defined medium supplemented with transferrin.</a> Cell Differentiation. 10 (5), 281-288 (1981).</li><li>Thesleff, I., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+transferrin+in+branching+morphogenesis,+growth+and+differentiation+of+the+embryonic+kidney.">Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 82, 147-161 (1984).</li><li>Freund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+redirects+differentiation+from+cardiogenic+mesoderm+and+endoderm+to+neuroectoderm+in+differentiating+human+embryonic+stem+cells.">Insulin redirects differentiation from cardiogenic mesoderm and endoderm to neuroectoderm in differentiating human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26 (3), 724-733 (2008).</li><li>Nishikawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimal+serum-free+defined+condition+for+in+vitro+culture+of+kidney+organoids.">An optimal serum-free defined condition for in vitro culture of kidney organoids.</a> Biochemistry and Biophysics Research Communication. 501 (4), 996-1002 (2018).</li><li>Oh, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+New+Zealand+donors.">Derivation of induced pluripotent stem cell lines from New Zealand donors.</a> Journal of the Royal Society of New Zealand. , 1-14 (2020).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney.">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2013).</li><li>Lam, A. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intermediate+mesoderm+that+forms+tubules+expressing+kidney+proximal+tubular+markers.">Rapid and efficient differentiation of human pluripotent stem cells into intermediate mesoderm that forms tubules expressing kidney proximal tubular markers.</a> Journal of American Society of Nephrology. 25 (6), 1211-1225 (2014).</li><li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+embryoid+body+microenvironment+to+direct+embryonic+stem+cell+differentiation.">Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation.</a> Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).</li><li>Imasawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+repatterns+human+podocyte+energy+metabolism+during+differentiation+and+diabetic+nephropathy.">High glucose repatterns human podocyte energy metabolism during differentiation and diabetic nephropathy.</a> FASEB Journal. 31 (1), 294-307 (2017).</li><li>Kim, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+condition+induces+autophagy+in+endothelial+progenitor+cells+contributing+to+angiogenic+impairment.">High glucose condition induces autophagy in endothelial progenitor cells contributing to angiogenic impairment.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (7), 1248-1252 (2014).</li><li>Piwkowska, A., Rogacka, D., Audzeyenka, I., Jankowski, M., Angielski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+concentration+affects+the+oxidant-antioxidant+balance+in+cultured+mouse+podocytes.">High glucose concentration affects the oxidant-antioxidant balance in cultured mouse podocytes.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 112 (6), 1661-1672 (2011).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+and+refinement+of+human+PSC-derived+kidney+organoid+differentiation+with+single-cell+transcriptomics.">Comparative analysis and refinement of human PSC-derived kidney organoid differentiation with single-cell transcriptomics.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 869-881 (2018).</li><li>Lei, X., Deng, Z., Duan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniform+embryoid+body+production+and+enhanced+mesendoderm+differentiation+with+murine+embryonic+stem+cells+in+a+rotary+suspension+bioreactor.">Uniform embryoid body production and enhanced mesendoderm differentiation with murine embryonic stem cells in a rotary suspension bioreactor.</a> Methods in Molecular Biology. , (2016).</li></ol>

Eerdere studies hebben aangetoond dat de eerste protocolstappen van cruciaal belang zijn voor intermediaire mesodermdifferentiatie 5,19,20 en daarom is het essentieel om in dit stadium een strikte mediumsamenstelling te implementeren. Het verwijderen van ongedefinieerde componenten zoals serum, albumine, eiwitvrij hybridoma medium II uit de eerste fase van het protocol kan helpen om de consistente differentiatie-efficiëntie tus...

In de afgelopen jaren zijn een aantal protocollen ontwikkeld om menselijke pluripotente stamcellen te differentiëren in nierorganoïden 1,2,3,4,5. Nierorganoïden hebben een belangrijk hulpmiddel geboden bij het onderzoek naar nieuwe regeneratieve geneeskundebenaderingen, modelleren niergerelateerde ziekten, het uitvoeren van toxiciteitsstudies en de ontwikkeling van therapeutische geneesmiddelen. Ondanks hun brede toepasbaarheid hebben nierorganoïden beperkingen zoals gebrek aan rijping, beperkte kweekcapaciteit op lange termijn in vitro en een tekort aan verschillende celtypen in de menselijke nier 6,7,8. Recent werk heeft zich gericht op het verbeteren van het niveau van organoïde rijping, het verlengen van de kweekperioden en het uitbreiden van de complexiteit van niercelpopulaties door de bestaande protocollente wijzigen 9,10,11,12. In deze huidige iteratie van ons vastgestelde protocol 5,13 hebben we de mediumcomponenten in de eerste fase van het protocol gewijzigd in een serumvrij basemedium aangevuld met insuline-transferrine-selenium-ethanolamine (ITSE), lipiden, polyvinylalcohol (E5-ILP) en CHIR99021 (figuur 1). Deze veranderingen zorgen voor een volledig gedefinieerd, serumvrij, eiwitarm medium, met minder componenten dan onze vorige mediumsamenstelling 5,13 en zonder extra groeifactoren. Als gevolg hiervan is het medium van de eerste fase minder arbeidsintensief om voor te bereiden dan onze eerder gepubliceerde versie en kan de batch-tot-batch variabiliteit5 verminderen. Eerdere studies hebben aangetoond dat zowel insuline als transferrine belangrijk zijn in serumvrije cultuur14,15, maar hoge niveaus van insuline kunnen remmend zijn voor mesodermdifferentiatie16. We hebben de lage insulinespiegels gehandhaafd zoals voorzien in het oorspronkelijke protocol en verder verlaagde niveaus van KOSR (met insuline) in de tweede fase van de test. In overeenstemming met andere protocollen voor de vorming van nierorganoïden, zijn lagere niveaus van KOSR gunstig voor het handhaven van een evenwicht tussen proliferatie en differentiatie van het nierweefsel17. Daarnaast hebben we de glucoseconcentratie in ons Stadium II medium13 verlaagd.
Onze methode beschrijft een opstelling voor suspensietest van nierorganoïden, die tot ~ 1.000 organoïden oplevert van een initiële ~ 60% confluent hPSC 100 mm kweekplaat zoals beschreven in de oorspronkelijke publicatie 5,13. Dit protocol kan eenvoudig worden opgeschaald naar meerdere platen van 100 mm of 150 mm om het aantal organoïden verder te verhogen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21-985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-adherence rinsing solution</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72054</td>
			<td>10 mM stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;disposable spinner flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-201-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Ultra-Low Attachment 6-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Slow-Speed Stirrers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-495-03</td>
			<td>Multi plate magnetic stirrer for spinner flask culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11054020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14-190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg / Oval Stirring Bars</td>
			<td>2mag</td>
			<td>PI20106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelta General-Purpose Tweezers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-456-103</td>
			<td>Keep sterile in the cell culture hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZBio Single Use Media Bottle, 250mL</td>
			<td>Foxx Life Sciences</td>
			<td>138-3211-FLS</td>
			<td>Used to make PVA 10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes (100 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Sterile Aspirating Pipet 2mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160; Cell Lifters - Cell lifter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Multi Function 3D Rotators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88-861-047</td>
			<td>Orbital shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1413302</td>
			<td>BME. Aliquot on ice and freeze. Another suitable matrix alternative is Matrigel or Cultrex.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td>GCDR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td>L-glutamine supplement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51-500-056</td>
			<td>ITSE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut&#160; Serum Replacement - Multi-Species</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A3181502</td>
			<td>KOSR. Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid Mixture 1, Chemically Defined</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>L0288-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 500mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2GPU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma&#160; Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 250mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2GPU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit</td>
			<td>2mag</td>
			<td>VMF 90250 U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive</td>
			<td>2mag</td>
			<td>VMF 40600</td>
			<td>6MSP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MP Biomedicals&#160; 7X Cleaning Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MP0976670A4</td>
			<td>Tissue culture suitable detergent. Make a 5% solution in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF, and mTeSR Plus medium have also been tested and are suitable alternatives.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50 mL Conical, Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-mpt</td>
			<td>Anti-mycoplasma reagent. Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer&#174; 200 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0776417</td>
			<td>Cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer&#174; 500 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0822591</td>
			<td>Cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol) 87-90% hydrolyzed&#160; (PVA)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P8136-250G</td>
			<td>10% in DPBS stirring at 98 degrees C until disolves, make in 138-3211-FLS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y-27632 (ROCKi)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td>10 mM stock in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Serological Pipets&#160; - 10mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Serological Pipets - 25mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Serological pipette - 5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-12D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeSR-E5</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5916</td>
			<td>Serum-free, low protein base medium for E5-ILP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variomag distriBOX 2 Distributor</td>
			<td>2mag</td>
			<td>VMF 90512</td>
			<td>If you use more than one MIXdrive</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simplified method for generating kidney organoids from human pluripotent stem cells

Nierorganoïden gegenereerd uit hPSC's hebben gezorgd voor een onbeperkte bron van nierweefsel. Menselijke nierorganoïden zijn een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van nierziekte en -letsel, het ontwikkelen van celgebaseerde therapieën en het testen van nieuwe therapieën. Voor dergelijke toepassingen zijn grote aantallen uniforme organoïden en zeer reproduceerbare assays nodig. We hebben voortgebouwd op ons eerder gepubliceerde nierorganoïde protocol om de algehele gezondheid van de organoïden te verbeteren. Dit eenvoudige, robuuste 3D-protocol omvat de vorming van uniforme embryoïde lichamen in minimaal componentmedium met lipiden, insuline-transferrine-selenium-ethanolaminesupplement en polyvinylalcohol met GSK3-remmer (CHIR99021) gedurende 3 dagen, gevolgd door kweek in knock-out serumvervanging (KOSR)-bevattend medium. Bovendien zorgen agitatietests voor vermindering van het samenklonteren van de embryoïde lichamen en het handhaven van een uniforme grootte, wat belangrijk is voor het verminderen van variabiliteit tussen organoïden. Over het algemeen biedt het protocol een snelle, efficiënte en kosteneffectieve methode voor het genereren van grote hoeveelheden nierorganoïden.

In deze meest recente versie van ons protocol wordt nierorganoïde differentiatie geïnitieerd in een gedefinieerd, eiwitarm medium. De assays worden volledig in suspensie uitgevoerd en zijn afhankelijk van het aangeboren vermogen van hPSCs-differentiatie en -organisatie voor het initiëren van tubulogenese. Een enkele test afkomstig van een 100 mm ~ 60% confluente hPSC-cultuurplaat levert routinematig 500-1.000 nierorganoïden op, zoals getoond in onze vorige publicatie5. Vanwege het grote aantal...

Watch this Scientific Journal Video about A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

Hier beschrijven we een protocol om nierorganoïden te genereren uit menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's). Dit protocol genereert nierorganoïden binnen twee weken. De resulterende nierorganoïden kunnen worden gekweekt in grootschalige spinnerkolven of magnetische roerplaten met meerdere bronnen voor parallelle medicijntestbenaderingen.

Een vereenvoudigde methode voor het genereren van nierorganoïden uit menselijke pluripotente stamcellen

Kidney organoids generated from hPSCs have provided an unlimited source of renal tissue. Human kidney organoids are an invaluable tool for studying kidney ...

Deze methode kan worden uitgevoerd in elk laboratorium dat is uitgerust voor celkweekexperimenten. Met behulp van deze methode kunnen we ons begrip van nierontwikkeling en ziekteroutes vergroten. Dit is een relatief eenvoudige en goedkope methode in vergelijking met anderen voor het genereren van nierorganoïden.De grootste uitdaging van deze techniek is het handhaven van hoogwaardige menselijke pluripotente stamcelkweek. Het is van cruciaal belang dat de cellen op minder dan 80% confluentie worden gehouden en regelmatig worden gesplitst. Onderzoekers die nieuw zijn in de menselijke pluripotente stamcelcultuur moeten zich vertrouwd maken met de stamcellijnen voordat ze overgaan tot differentiatie.Begin de nierorganoïde-test door twee milliliter volledig E5-ILP-medium toe te voegen aan elke put van een ultralage bevestigingsplaat met zes putten. Kweek menselijke pluripotente stamcellen, of hPSC's, in met weefselkweek behandelde platen van 100 millimeter totdat ze 60% confluentie bereiken. Was de hPSC's tweemaal met ongeveer acht milliliter DPBS.Aspiraleer de DPBS, voeg vervolgens twee milliliter Dispase druppelsgewijs toe om de cellen te bedekken en incubeer ze gedurende zes minuten bij 37 graden Celsius. Was de cellen driemaal met ongeveer 10 milliliter DPBS. Zuig de DPBS op, kantel de plaat vervolgens 45 graden en schraap de cellen naar beneden met een cellifter.Spoel de kolonies van bovenaf af met zes milliliter compleet E5-ILP-medium met behulp van een serologische pipet van 10 milliliter. Houd vervolgens de pipet verticaal en breek grote kolonies op door voorzichtig op en neer te pipetteren, waarbij u ervoor zorgt dat u de zijkanten van de kweekplaat niet raakt. Verdeel de kolonieclusters gelijkmatig door één milliliter per put toe te voegen aan de zes-putplaat en plaats de plaat vervolgens op een orbitale shaker in een incubator van 37 graden Celsius.Als alternatief, als er geen orbitale shaker beschikbaar is, kunnen de cellen statisch worden gekweekt. Op dag twee, nadat je de embryoïde lichamen aan de onderkant van de plaat hebt laten bezinken, kantel je de plaat 45 graden en zuig je het medium langzaam van bovenaf op, waardoor er één milliliter per put overblijft. Voeg twee milliliter bereid medium per put toe en breng de plaat terug naar de shaker.Op dag drie, na het aanzuigen van het medium zoals eerder aangetoond, verzamelt u alle embryoïde lichamen zorgvuldig uit elke put met behulp van een serologische pipet van 10 milliliter en brengt u ze over naar een conische buis van 50 milliliter. Om eventuele resterende embryoïde lichamen te verzamelen, spoelt u elke put met één milliliter dmem met lage glucose en voegt u ze toe aan dezelfde conische buis van 50 milliliter. Terwijl u wacht tot de embryoïde lichamen zich op de bodem van de buis hebben gevestigd, voegt u twee milliliter Stadium II-medium toe aan elke put van de plaat met zes putten.Zeef vervolgens grote embryoïde lichamen uit door een celzeef van 200 micrometer bovenop een nieuwe conische buis van 50 milliliter te plaatsen en alle embryoïde lichamen zorgvuldig over de celzeef te pipetteren. Spoel de celzeef met nog eens vijf milliliter DMEM om eventuele embryoïde lichamen die vastzitten in de zeef te verzamelen. Gebruik in latere stadia eerst een zeef van 500 micrometer om zeer grote embryoïde lichamen uit te zeven en passeer vervolgens het filtraat door een zeef van 200 micrometer om zeer kleine embryoïde lichamen zonder tubuli uit te zeven.Verzamel de juiste grootte embryoïde lichamen, tussen 200 en 500 micrometer, door de zeef van 200 micrometer om te keren in een nieuwe buis van 50 milliliter en de zeef te wassen met DPBS. Laat na het persen de embryoïde lichamen zich op de bodem van de conische buis nestelen, anspiraleer vervolgens het supernatant en was met ongeveer 10 milliliter DMEM. Resuspend de embryoïde lichamen vervolgens in zes milliliter stadium II-medium.Breng de embryoïde lichamen terug in de ultralage bevestigingsplaat met zes putten en verdeel ze gelijkmatig over de putten. Omdat de meeste organoïden zich aan de bovenkant van de pipet verzamelen, laat u ongeveer een halve milliliter aan het einde achter en raakt u vervolgens voorzichtig de punt aan de media in elke put, waardoor organoïden in de put kunnen stromen. Breng de embryoïde lichamen over in een spinnerkolf van 125 milliliter met 45 milliliter stadium II-medium.Stel de magneetroersnelheid in op 120 rpm en plaats de kolf in de couveuse. Om de embryoïde lichamen of nierorganoïden te voeden, laat u ze kort op de bodem van de spinnerkolf bezinken, til dan het deksel van één zijarm van de kolf op en plaats de aanzuigende pipet binnenin met de punt die de tegenoverliggende binnenwand raakt. Richt de pipet langzaam naar beneden en zuig ongeveer de helft van het medium op.Vul aan met 20 milliliter vers Stage II medium door het door dezelfde opening te pipetteren. Gebruik een lange steriele tang om voorzichtig één magnetische roerstaaf in elke put van een zes-well plaat met embryoïde lichamen of nierorganoïden te plaatsen. Plaats de plaat op de zeswielige magneetroerplaat en stel de snelheid in op 120 tpm.Om de magneetroerstaven in positie te klikken en te laten draaien, stelt u eerst het vermogensniveau in op 100. Zodra alle balken beginnen te draaien, breng je het vermogensniveau terug naar 25. Onderhoud de nierorganoïden door de helft van het medium te veranderen, zoals eerder is aangetoond.Immunofluorescentie van paraffinesecties van dag 14 nierorganoïden vertonen de aanwezigheid van nefronsegmenten zoals niertubuli die hepatocytenkernfactor-1 bèta en Lotus tetragonolobus lectine tot expressie brengen, evenals podocytenclusters die V-maf musculoaponeurotisch fibrosarcoom tot expressie brengen opcogene homoloog B en nefrine. De modificaties in dit protocol kunnen de uitbreiding van endotheelcellen ondersteunen, zoals bevestigd door kleuring met bloedplaatjes en endotheelceladhesiemolecuul-1 op dag 26 van de kweek. Menselijke pluripotente stamcellen moeten gedurende de juiste tijd met Dispase worden behandeld en vervolgens grondig worden gewassen om alle sporen te verwijderen.Als Dispase niet volledig wordt verwijderd, kan dit leiden tot celdood en clustering van embryoïde lichamen. Deze methode heeft ons geholpen de ontwikkeling van aangeboren nierziekten te onderzoeken, evenals verschillende routes voor nierbeschadiging en potentieel voor therapeutische interventies in vitro.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-vrij Afleiding van melanocyten uit menselijke pluripotente stamcellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Gedefinieerd en Scalable Generatie van hepatocyt-achtige cellen uit menselijke pluripotente stamcellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Snelle, gerichte differentiatie van de epitheliale cellen van de retinale Pigment van menselijke embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generatie van gestandaardiseerde en reproduceerbaar reukkolf-type cerebrale Organoids van mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Efficiënte differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in levercellen

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In Vitro generatie van Somiet derivaten uit menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen-cellen

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

Een statische zelfsturende methode voor het genereren van hersenorganoïden uit menselijke embryonale stamcellen

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

In vitro Neuromuscular Junction Induced from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In vitro Neuromusculaire Verbinding veroorzaakt uit menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized synapse that transmits action potentials from the motor neuron to skeletal muscle for mechanical ...

Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Gerichte differentiatie van hemogene endotheelcellen uit menselijke pluripotente stamcellen

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial ...