Name: a simplified method for generating kidney organoids from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-04-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Cette recherche a été financée par les National Institutes of Health R01 DK069403, UC2 DK126122 et P30-DK079307 et le programme de bourses de recherche Ben J. Lipps de la Fondation ASN pour la recherche rénale à AP.

Toutes les expériences utilisant des CSEh ont été réalisées conformément aux directives de l’établissement et ont été réalisées dans une hotte de biosécurité de classe II avec un équipement de protection individuelle approprié. Tous les réactifs sont de qualité de culture cellulaire, sauf indication contraire. Toutes les cultures sont incubées à 37 °C, 5 % de CO2 dans l’atmosphère. À toutes les étapes du test, des corps embryoïques ou des organoïdes rénaux peuvent être collectés...

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	<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids.">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communications. 6, 8715 (2015).</li><li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury.">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li><li>Taguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+in+vivo+origin+of+metanephric+nephron+progenitors+enables+generation+of+complex+kidney+structures+from+pluripotent+stem+cells.">Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2013).</li><li>Przepiorski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+bioreactor-based+method+to+generate+kidney+organoids+from+pluripotent+stem+cells.">A simple bioreactor-based method to generate kidney organoids from pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 11 (2), 470-484 (2018).</li><li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids.">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communication. 6, 8715 (2015).</li><li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury.">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Taguchi, A., Nishinakamura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-order+kidney+organogenesis+from+pluripotent+stem+cells.">Higher-order kidney organogenesis from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).</li><li>Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+organoids+with+improved+collecting+duct+maturation+and+injury+modeling.">Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling.</a> Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).</li><li>Howden, S. E., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+using+defined+conditions.">Generating kidney organoids from human pluripotent stem cells using defined conditions.</a> Methods in Molecular Biology. 2155, 183-192 (2020).</li><li>Tanigawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin+is+superior+to+BMP7+for+efficient+maintenance+of+human+iPSC-derived+nephron+progenitors.">Activin is superior to BMP7 for efficient maintenance of human iPSC-derived nephron progenitors.</a> Stem Cell Reports. 13 (2), 322-337 (2019).</li><li>Sander, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+large-scale+production+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Protocol for large-scale production of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100150 (2020).</li><li>Ekblom, P., Thesleff, I., Miettinen, A., Saxen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+defined+medium+supplemented+with+transferrin.">Organogenesis in a defined medium supplemented with transferrin.</a> Cell Differentiation. 10 (5), 281-288 (1981).</li><li>Thesleff, I., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+transferrin+in+branching+morphogenesis,+growth+and+differentiation+of+the+embryonic+kidney.">Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 82, 147-161 (1984).</li><li>Freund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+redirects+differentiation+from+cardiogenic+mesoderm+and+endoderm+to+neuroectoderm+in+differentiating+human+embryonic+stem+cells.">Insulin redirects differentiation from cardiogenic mesoderm and endoderm to neuroectoderm in differentiating human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26 (3), 724-733 (2008).</li><li>Nishikawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimal+serum-free+defined+condition+for+in+vitro+culture+of+kidney+organoids.">An optimal serum-free defined condition for in vitro culture of kidney organoids.</a> Biochemistry and Biophysics Research Communication. 501 (4), 996-1002 (2018).</li><li>Oh, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+New+Zealand+donors.">Derivation of induced pluripotent stem cell lines from New Zealand donors.</a> Journal of the Royal Society of New Zealand. , 1-14 (2020).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney.">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2013).</li><li>Lam, A. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intermediate+mesoderm+that+forms+tubules+expressing+kidney+proximal+tubular+markers.">Rapid and efficient differentiation of human pluripotent stem cells into intermediate mesoderm that forms tubules expressing kidney proximal tubular markers.</a> Journal of American Society of Nephrology. 25 (6), 1211-1225 (2014).</li><li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+embryoid+body+microenvironment+to+direct+embryonic+stem+cell+differentiation.">Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation.</a> Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).</li><li>Imasawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+repatterns+human+podocyte+energy+metabolism+during+differentiation+and+diabetic+nephropathy.">High glucose repatterns human podocyte energy metabolism during differentiation and diabetic nephropathy.</a> FASEB Journal. 31 (1), 294-307 (2017).</li><li>Kim, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+condition+induces+autophagy+in+endothelial+progenitor+cells+contributing+to+angiogenic+impairment.">High glucose condition induces autophagy in endothelial progenitor cells contributing to angiogenic impairment.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (7), 1248-1252 (2014).</li><li>Piwkowska, A., Rogacka, D., Audzeyenka, I., Jankowski, M., Angielski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+concentration+affects+the+oxidant-antioxidant+balance+in+cultured+mouse+podocytes.">High glucose concentration affects the oxidant-antioxidant balance in cultured mouse podocytes.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 112 (6), 1661-1672 (2011).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+and+refinement+of+human+PSC-derived+kidney+organoid+differentiation+with+single-cell+transcriptomics.">Comparative analysis and refinement of human PSC-derived kidney organoid differentiation with single-cell transcriptomics.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 869-881 (2018).</li><li>Lei, X., Deng, Z., Duan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniform+embryoid+body+production+and+enhanced+mesendoderm+differentiation+with+murine+embryonic+stem+cells+in+a+rotary+suspension+bioreactor.">Uniform embryoid body production and enhanced mesendoderm differentiation with murine embryonic stem cells in a rotary suspension bioreactor.</a> Methods in Molecular Biology. , (2016).</li></ol>

Des études antérieures ont montré que les étapes initiales du protocole sont critiques pour la différenciation intermédiaire du mésoderme 5,19,20 et, par conséquent, il est essentiel de mettre en œuvre une composition moyenne stricte à ce stade. L’élimination des composants non définis tels que le sérum, l’albumine, le milieu d’hybridome sans protéines II de la première étape du protocole peut aider à amé...

Au cours des dernières années, un certain nombre de protocoles visant à différencier les cellules souches pluripotentes humaines en organoïdes rénaux ont été développés 1,2,3,4,5. Les organoïdes rénaux ont fourni un outil important pour aider la recherche sur de nouvelles approches de médecine régénérative, modéliser les maladies rénales, effectuer des études de toxicité et le développement de médicaments thérapeutiques. Malgré leur large applicabilité, les organoïdes rénaux ont des limites telles que le manque de maturation, la capacité de culture limitée à long terme in vitro et une pénurie de plusieurs types de cellules trouvées dans le rein humain 6,7,8. Des travaux récents se sont concentrés sur l’amélioration du niveau de maturation organoïde, l’extension des périodes de culture et l’expansion de la complexité des populations de cellules rénales en modifiant les protocoles existants 9,10,11,12. Dans cette itération de notre protocole établi 5,13, nous avons modifié les composants du milieu dans la première étape du protocole en un milieu de base sans sérum complété par insuline-transferrine-sélénium-éthanolamine (ITSE), lipides, alcool polyvinylique (E5-ILP) et CHIR99021 (Figure 1). Ces changements fournissent un milieu entièrement défini, sans sérum, à faible teneur en protéines, avec moins de composants que notre composition moyenne précédente 5,13 et sans facteurs de croissance supplémentaires. En conséquence, le support de première étape est moins laborieux à préparer que notre version précédemment publiée, et peut réduire la variabilité d’un lot àl’autre 5. Des études antérieures ont montré que l’insuline et la transferrine sont importantes dans la culture sans sérum14,15, cependant, des niveaux élevés d’insuline peuvent être inhibiteurs de la différenciation du mésoderme16. Nous avons maintenu les faibles niveaux d’insuline prévus dans le protocole original, et réduit davantage les niveaux de KOSR (contenant de l’insuline) dans la deuxième étape du test. Conformément à d’autres protocoles pour la formation d’organoïdes rénaux, des niveaux inférieurs de KOSR sont bénéfiques pour maintenir un équilibre entre la prolifération et la différenciation du tissu rénal17. De plus, nous avons abaissé la concentration de glucose dans notre milieu de stade II13.
Notre méthode décrit une configuration pour le dosage en suspension d’organoïdes rénaux, donnant jusqu’à ~ 1 000 organoïdes à partir d’une plaque de culture initiale hPSC 100 mm confluente à ~ 60% comme décrit dans la publication originale 5,13. Ce protocole peut être facilement mis à l’échelle jusqu’à commencer avec plusieurs plaques de 100 mm ou 150 mm pour augmenter encore le nombre d’organoïdes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21-985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-adherence rinsing solution</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72054</td>
			<td>10 mM stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;disposable spinner flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-201-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Ultra-Low Attachment 6-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Slow-Speed Stirrers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-495-03</td>
			<td>Multi plate magnetic stirrer for spinner flask culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11054020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14-190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg / Oval Stirring Bars</td>
			<td>2mag</td>
			<td>PI20106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelta General-Purpose Tweezers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-456-103</td>
			<td>Keep sterile in the cell culture hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZBio Single Use Media Bottle, 250mL</td>
			<td>Foxx Life Sciences</td>
			<td>138-3211-FLS</td>
			<td>Used to make PVA 10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes (100 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Sterile Aspirating Pipet 2mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160; Cell Lifters - Cell lifter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Multi Function 3D Rotators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88-861-047</td>
			<td>Orbital shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1413302</td>
			<td>BME. Aliquot on ice and freeze. Another suitable matrix alternative is Matrigel or Cultrex.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td>GCDR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td>L-glutamine supplement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51-500-056</td>
			<td>ITSE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut&#160; Serum Replacement - Multi-Species</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A3181502</td>
			<td>KOSR. Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid Mixture 1, Chemically Defined</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>L0288-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 500mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2GPU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma&#160; Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 250mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2GPU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit</td>
			<td>2mag</td>
			<td>VMF 90250 U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive</td>
			<td>2mag</td>
			<td>VMF 40600</td>
			<td>6MSP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MP Biomedicals&#160; 7X Cleaning Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MP0976670A4</td>
			<td>Tissue culture suitable detergent. Make a 5% solution in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF, and mTeSR Plus medium have also been tested and are suitable alternatives.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50 mL Conical, Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-mpt</td>
			<td>Anti-mycoplasma reagent. Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer&#174; 200 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0776417</td>
			<td>Cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer&#174; 500 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0822591</td>
			<td>Cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol) 87-90% hydrolyzed&#160; (PVA)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P8136-250G</td>
			<td>10% in DPBS stirring at 98 degrees C until disolves, make in 138-3211-FLS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y-27632 (ROCKi)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td>10 mM stock in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Serological Pipets&#160; - 10mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Serological Pipets - 25mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Serological pipette - 5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-12D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeSR-E5</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5916</td>
			<td>Serum-free, low protein base medium for E5-ILP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variomag distriBOX 2 Distributor</td>
			<td>2mag</td>
			<td>VMF 90512</td>
			<td>If you use more than one MIXdrive</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simplified method for generating kidney organoids from human pluripotent stem cells

Les organoïdes rénaux générés par les CSEh ont fourni une source illimitée de tissu rénal. Les organoïdes rénaux humains sont un outil inestimable pour étudier les maladies et les lésions rénales, développer des thérapies cellulaires et tester de nouvelles thérapies. Pour de telles applications, un grand nombre d’organoïdes uniformes et des tests hautement reproductibles sont nécessaires. Nous nous sommes appuyés sur notre protocole organoïde rénal publié précédemment pour améliorer la santé globale des organoïdes. Ce protocole 3D simple et robuste implique la formation de corps embryoïdes uniformes dans un milieu de composant minimum contenant des lipides, un supplément d’insuline-transferrine-sélénium-éthanolamine et de l’alcool polyvinylique avec inhibiteur de GSK3 (CHIR99021) pendant 3 jours, suivi d’une culture dans un milieu contenant un substitut sérique knock-out (KOSR). En outre, les essais d’agitation permettent de réduire l’agglutination des corps embryoïdes et de maintenir une taille uniforme, ce qui est important pour réduire la variabilité entre les organoïdes. Dans l’ensemble, le protocole fournit une méthode rapide, efficace et rentable pour générer de grandes quantités d’organoïdes rénaux.

Dans cette version la plus récente de notre protocole, la différenciation organoïde rénale est initiée dans un milieu défini à faible teneur en protéines. Les essais sont effectués entièrement en suspension et reposent sur la capacité innée de différenciation et d’organisation des CSEh pour l’initiation de la tubulogenèse. Un seul essai provenant d’une plaque de culture hPSC confluente de 100 mm ~ 60% donne régulièrement 500 à 1 000 organoïdes rénaux, comme indiqué dans notre publication précé...

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A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

Nous décrivons ici un protocole pour générer des organoïdes rénaux à partir de cellules souches pluripotentes humaines (CSEh). Ce protocole génère des organoïdes rénaux en deux semaines. Les organoïdes rénaux qui en résultent peuvent être cultivés dans des flacons de spinner à grande échelle ou des plaques d’agitation magnétiques multi-puits pour des approches parallèles de test de drogues.

Une méthode simplifiée pour générer des organoïdes rénaux à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Kidney organoids generated from hPSCs have provided an unlimited source of renal tissue. Human kidney organoids are an invaluable tool for studying kidney ...

Cette méthode peut être réalisée dans n’importe quel laboratoire équipé pour des expériences de culture cellulaire. En utilisant cette méthode, nous pouvons approfondir notre compréhension du développement rénal et des voies de la maladie. Il s’agit d’une méthode relativement simple et peu coûteuse par rapport à d’autres pour générer des organoïdes rénaux.Le plus grand défi de cette technique est de maintenir une culture de cellules souches pluripotentes humaines de haute qualité. Il est essentiel que les cellules soient maintenues à moins de 80% de confluence et se divisent régulièrement. Les chercheurs novices en culture de cellules souches pluripotentes chez l’homme devraient se familiariser avec les lignées de cellules souches avant de procéder à la différenciation.Commencez le test organoïde rénal en ajoutant deux millilitres de milieu E5-ILP complet dans chaque puits d’une plaque de fixation ultra-basse de six puits. Cultiver des cellules souches pluripotentes humaines, ou CSEh, dans des plaques de culture tissulaire de 100 millimètres jusqu’à ce qu’elles atteignent 60% de confluence. Lavez les CSEh deux fois avec environ huit millilitres de DPBS.Aspirer le DPBS, puis ajouter deux millilitres de Dispase goutte à goutte pour couvrir les cellules, et les incuber pendant six minutes à 37 degrés Celsius. Lavez les cellules trois fois avec environ 10 millilitres de DPBS. Aspirez le DPBS, puis inclinez la plaque de 45 degrés et grattez les cellules avec un élévateur de cellules.Laver les colonies par le haut avec six millilitres de milieu E5-ILP complet à l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres. Ensuite, en tenant la pipette verticalement, brisez les grandes colonies en pipetant doucement de haut en bas, en prenant soin de ne pas toucher les côtés de la plaque de culture. Répartissez les grappes de colonies uniformément en ajoutant un millilitre par puits dans la plaque à six puits, puis placez la plaque sur un agitateur orbital à l’intérieur d’un incubateur de 37 degrés Celsius.Alternativement, si un agitateur orbital n’est pas disponible, les cellules peuvent être cultivées statiquement. Le deuxième jour, après avoir laissé les corps embryoïdes se déposer au bas de la plaque, inclinez la plaque de 45 degrés et aspirez lentement le milieu par le haut, en laissant un millilitre par puits. Ajouter deux millilitres de milieu complet préparé par puits et remettre la plaque à l’agitateur.Le troisième jour, après avoir aspiré le milieu comme démontré précédemment, prélever soigneusement tous les corps embryoïdes de chaque puits à l’aide d’une pipette sérologique de 10 millilitres et les transférer dans un tube conique de 50 millilitres. Pour recueillir les corps embryoïdes restants, rincez chaque puits avec un millilitre de DMEM à faible teneur en glucose et ajoutez-les dans le même tube conique de 50 millilitres. En attendant que les corps imbroïdes se déposent au fond du tube, ajoutez deux millilitres de milieu de stade II à chaque puits de la plaque à six puits.Ensuite, tamisez les gros corps embryoïques en plaçant une passoire cellulaire de 200 micromètres sur un nouveau tube conique de 50 millilitres et en pipetant soigneusement tous les corps embryonnaires sur la passoire cellulaire. Rincez la passoire cellulaire avec cinq millilitres supplémentaires de DMEM pour recueillir tous les corps embryoïdes coincés dans la passoire. Aux stades ultérieurs, utilisez d’abord une passoire de 500 micromètres pour tamiser de très gros corps embryonnaires, puis passez le filtrat à travers une passoire de 200 micromètres pour tamiser de très petits corps embryoïdes sans tubules.Collectez les corps d’embryides de taille correcte, entre 200 et 500 micromètres, en inversant la passoire de 200 micromètres dans un nouveau tube de 50 millilitres et en lavant la passoire avec DPBS. Après avoir filtré, laissez les corps embryoïdes se déposer au fond du tube conique, puis aspirez le surnageant et lavez avec environ 10 millilitres de DMEM. Ensuite, ressuspendez les corps embryoïdes dans six millilitres de milieu de stade II.Transférez les corps embryoïdes dans la plaque d’attachement ultra-basse à six puits, en les répartissant uniformément entre les puits. Étant donné que la plupart des organoïdes s’accumulent au sommet de la pipette, laissez environ un demi-millilitre à la fin, puis touchez doucement la pointe au milieu dans chaque puits, permettant aux organoïdes de s’écouler dans le puits. Transférer les corps d’embryides dans une fiole de 125 millilitres avec 45 millilitres de milieu de stade II.Réglez la vitesse d’agitation magnétique à 120 tr/min et placez la fiole dans l’incubateur. Pour nourrir les corps embryoïdes ou les organoïdes rénaux, laissez-les s’installer brièvement au fond de la fiole de spinner, puis soulevez le couvercle d’un bras latéral de la fiole et placez la pipette d’aspiration à l’intérieur avec la pointe touchant la paroi intérieure opposée. Inclinez lentement la pipette vers le bas et aspirez environ la moitié du milieu.Reconstituez-le avec 20 millilitres de milieu frais de stade II en le pipetant à travers la même ouverture. Utilisez de longues pinces stériles pour placer soigneusement une barre d’agitation magnétique dans chaque puits d’une plaque de six puits avec des corps embryoïdes ou des organoïdes rénaux. Placez la plaque sur la plaque d’agitation magnétique à six roues et réglez la vitesse à 120 tr / min.Pour que les barres d’agitation magnétiques s’enclenchent et commencent à tourner, réglez d’abord le niveau de puissance à 100. Une fois que toutes les barres commencent à tourner, ramenez le niveau de puissance à 25. Maintenir les organoïdes rénaux en changeant la moitié du milieu comme démontré précédemment.L’immunofluorescence des sections de paraffine des organoïdes rénaux du jour 14 montre la présence de segments de néphron tels que des tubules rénaux exprimant le facteur nucléaire hépatocytaire bêta-1 et la lectine tétragonolobus de Lotus, ainsi que des amas de podocytes exprimant le fibrosarcome musculoaponeurotique V-maf oncogène homologue B et néphrine. Les modifications apportées à ce protocole peuvent favoriser l’expansion des cellules endothéliales, comme le confirme la coloration avec la molécule d’adhésion des plaquettes et des cellules endothéliales-1 au jour 26 de la culture. Les cellules souches pluripotentes humaines doivent être traitées avec Dispase pendant la durée appropriée, puis soigneusement lavées pour éliminer toutes les traces.Si Dispase n’est pas complètement éliminé, il peut entraîner la mort cellulaire et le regroupement des corps embryoïdes. Cette méthode nous a aidés à examiner le développement de maladies rénales congénitales, ainsi que diverses voies de lésions rénales et le potentiel d’interventions thérapeutiques in vitro.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

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Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Recherche

Biologie du développement

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

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Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

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We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

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Dans Vitro génération du Somite dérivés de Human induit Pluripotent Stem cellules

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