Name: a simplified method for generating kidney organoids from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-04-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

इस शोध को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ R01 DK069403, UC2 DK126122 और P30-DK079307 और ASN Foundation for Kidney Research Ben J. Lipps Research Fellowship Program द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

एचपीएससी का उपयोग करने वाले सभी प्रयोग संस्थागत दिशानिर्देशों के अनुपालन में किए गए थे, और उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों के साथ कक्षा II जैव सुरक्षा हुड में किए गए थे। सभी अभिकर्मक सेल संस्कृति-ग्रेड ?...

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	<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids.">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communications. 6, 8715 (2015).</li><li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury.">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li><li>Taguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+in+vivo+origin+of+metanephric+nephron+progenitors+enables+generation+of+complex+kidney+structures+from+pluripotent+stem+cells.">Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2013).</li><li>Przepiorski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+bioreactor-based+method+to+generate+kidney+organoids+from+pluripotent+stem+cells.">A simple bioreactor-based method to generate kidney organoids from pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 11 (2), 470-484 (2018).</li><li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids.">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communication. 6, 8715 (2015).</li><li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury.">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Taguchi, A., Nishinakamura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-order+kidney+organogenesis+from+pluripotent+stem+cells.">Higher-order kidney organogenesis from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).</li><li>Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+organoids+with+improved+collecting+duct+maturation+and+injury+modeling.">Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling.</a> Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).</li><li>Howden, S. E., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+using+defined+conditions.">Generating kidney organoids from human pluripotent stem cells using defined conditions.</a> Methods in Molecular Biology. 2155, 183-192 (2020).</li><li>Tanigawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin+is+superior+to+BMP7+for+efficient+maintenance+of+human+iPSC-derived+nephron+progenitors.">Activin is superior to BMP7 for efficient maintenance of human iPSC-derived nephron progenitors.</a> Stem Cell Reports. 13 (2), 322-337 (2019).</li><li>Sander, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+large-scale+production+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Protocol for large-scale production of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100150 (2020).</li><li>Ekblom, P., Thesleff, I., Miettinen, A., Saxen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+defined+medium+supplemented+with+transferrin.">Organogenesis in a defined medium supplemented with transferrin.</a> Cell Differentiation. 10 (5), 281-288 (1981).</li><li>Thesleff, I., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+transferrin+in+branching+morphogenesis,+growth+and+differentiation+of+the+embryonic+kidney.">Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 82, 147-161 (1984).</li><li>Freund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+redirects+differentiation+from+cardiogenic+mesoderm+and+endoderm+to+neuroectoderm+in+differentiating+human+embryonic+stem+cells.">Insulin redirects differentiation from cardiogenic mesoderm and endoderm to neuroectoderm in differentiating human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26 (3), 724-733 (2008).</li><li>Nishikawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimal+serum-free+defined+condition+for+in+vitro+culture+of+kidney+organoids.">An optimal serum-free defined condition for in vitro culture of kidney organoids.</a> Biochemistry and Biophysics Research Communication. 501 (4), 996-1002 (2018).</li><li>Oh, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+New+Zealand+donors.">Derivation of induced pluripotent stem cell lines from New Zealand donors.</a> Journal of the Royal Society of New Zealand. , 1-14 (2020).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney.">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2013).</li><li>Lam, A. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intermediate+mesoderm+that+forms+tubules+expressing+kidney+proximal+tubular+markers.">Rapid and efficient differentiation of human pluripotent stem cells into intermediate mesoderm that forms tubules expressing kidney proximal tubular markers.</a> Journal of American Society of Nephrology. 25 (6), 1211-1225 (2014).</li><li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+embryoid+body+microenvironment+to+direct+embryonic+stem+cell+differentiation.">Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation.</a> Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).</li><li>Imasawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+repatterns+human+podocyte+energy+metabolism+during+differentiation+and+diabetic+nephropathy.">High glucose repatterns human podocyte energy metabolism during differentiation and diabetic nephropathy.</a> FASEB Journal. 31 (1), 294-307 (2017).</li><li>Kim, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+condition+induces+autophagy+in+endothelial+progenitor+cells+contributing+to+angiogenic+impairment.">High glucose condition induces autophagy in endothelial progenitor cells contributing to angiogenic impairment.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (7), 1248-1252 (2014).</li><li>Piwkowska, A., Rogacka, D., Audzeyenka, I., Jankowski, M., Angielski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+concentration+affects+the+oxidant-antioxidant+balance+in+cultured+mouse+podocytes.">High glucose concentration affects the oxidant-antioxidant balance in cultured mouse podocytes.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 112 (6), 1661-1672 (2011).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+and+refinement+of+human+PSC-derived+kidney+organoid+differentiation+with+single-cell+transcriptomics.">Comparative analysis and refinement of human PSC-derived kidney organoid differentiation with single-cell transcriptomics.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 869-881 (2018).</li><li>Lei, X., Deng, Z., Duan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniform+embryoid+body+production+and+enhanced+mesendoderm+differentiation+with+murine+embryonic+stem+cells+in+a+rotary+suspension+bioreactor.">Uniform embryoid body production and enhanced mesendoderm differentiation with murine embryonic stem cells in a rotary suspension bioreactor.</a> Methods in Molecular Biology. , (2016).</li></ol>

पिछले अध्ययनों से पता चला है कि प्रारंभिक प्रोटोकॉल चरण मध्यवर्ती मेसोडर्म भेदभाव 5,19,20 के लिए महत्वपूर्ण हैं और इसलिए, इस स्तर पर एक कठोर मध्यम संरचना को लागू करना आव?...

हाल के वर्षों में, मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं को गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स में अलग करने के लिए कई प्रोटोकॉल 1,2,3,4,5 विकसित किए गए हैं। गुर्दे organoids नए पुनर्योजी चिकित्सा दृष्टिकोण, मॉडल गुर्दे से संबंधित बीमारियों, विषाक्तता अध्ययन और चिकित्सीय दवा के विकास में अनुसंधान में सहायता करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान किया है। उनकी व्यापक प्रयोज्यता के बावजूद, गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स की सीमाएं हैं जैसे परिपक्वता की कमी, विट्रो में सीमित दीर्घकालिक संस्कृति क्षमता, और मानव गुर्दे में पाए जाने वाले कई सेलप्रकारों की कमी 6,7,8। हाल के काम ने ऑर्गेनोइड परिपक्वता के स्तर में सुधार करने, संस्कृति की अवधि का विस्तार करने और मौजूदा प्रोटोकॉल 9,10,11,12 को संशोधित करके गुर्दे की कोशिका आबादी की जटिलता का विस्तार करने पर ध्यान केंद्रित किया है। हमारे स्थापित प्रोटोकॉल 5,13 के इस वर्तमान पुनरावृत्ति में, हमने प्रोटोकॉल के पहले चरण में मध्यम घटकों को सीरम-मुक्त बेस माध्यम में संशोधित किया है, जो इंसुलिन-ट्रांसफरिन-सेलेनियम-इथेनॉलामाइन (आईटीएसई), लिपिड, पॉलीविनाइल अल्कोहल (ई 5-आईएलपी) और CHIR99021 (चित्रा 1) के साथ पूरक है। ये परिवर्तन एक पूरी तरह से परिभाषित, सीरम-मुक्त, कम-प्रोटीन माध्यम प्रदान करते हैं, जिसमें हमारे पिछले मध्यम संरचना 5,13 की तुलना में कम घटक होते हैं और अतिरिक्त विकास कारकों के बिना। नतीजतन, पहला चरण माध्यम हमारे पहले प्रकाशित संस्करण की तुलना में तैयार करने के लिए कम श्रम-गहन है, और बैच-टू-बैच परिवर्तनशीलताको कम कर सकता है। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि इंसुलिन और ट्रांसफरिन दोनों सीरम-मुक्त संस्कृति14,15 में महत्वपूर्ण हैं, हालांकि, इंसुलिन का उच्च स्तर मेसोडर्म भेदभाव16 के लिए निरोधात्मक हो सकता है। हमने मूल प्रोटोकॉल में प्रदान किए गए कम इंसुलिन के स्तर को बनाए रखा है, और परख के दूसरे चरण में KOSR (इंसुलिन युक्त) के स्तर को और कम कर दिया है। गुर्दे के ऑर्गेनोइड गठन के लिए अन्य प्रोटोकॉल के अनुरूप, KOSR के निम्न स्तर गुर्दे केऊतकों के प्रसार और भेदभाव के बीच संतुलन बनाए रखने के लिए फायदेमंद हैं। इसके अलावा, हमने अपने चरण II माध्यम13 में ग्लूकोज एकाग्रता को कम कर दिया है।
हमारी विधि गुर्दे organoids के निलंबन परख के लिए एक सेटअप का वर्णन करता है, एक प्रारंभिक ~ 60% confluent hPSC 100 मिमी संस्कृति प्लेट से ~ 1,000 organoids तक उपज के रूप में मूल प्रकाशन 5,13 में वर्णित है. इस प्रोटोकॉल को आसानी से कई 100 मिमी या 150 मिमी प्लेटों के साथ शुरू करने के लिए बढ़ाया जा सकता है ताकि ऑर्गेनोइड संख्या को और बढ़ाया जा सके।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21-985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-adherence rinsing solution</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72054</td>
			<td>10 mM stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;disposable spinner flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-201-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Ultra-Low Attachment 6-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Slow-Speed Stirrers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-495-03</td>
			<td>Multi plate magnetic stirrer for spinner flask culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11054020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14-190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg / Oval Stirring Bars</td>
			<td>2mag</td>
			<td>PI20106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelta General-Purpose Tweezers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-456-103</td>
			<td>Keep sterile in the cell culture hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZBio Single Use Media Bottle, 250mL</td>
			<td>Foxx Life Sciences</td>
			<td>138-3211-FLS</td>
			<td>Used to make PVA 10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes (100 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Sterile Aspirating Pipet 2mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160; Cell Lifters - Cell lifter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Multi Function 3D Rotators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88-861-047</td>
			<td>Orbital shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1413302</td>
			<td>BME. Aliquot on ice and freeze. Another suitable matrix alternative is Matrigel or Cultrex.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td>GCDR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td>L-glutamine supplement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51-500-056</td>
			<td>ITSE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut&#160; Serum Replacement - Multi-Species</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A3181502</td>
			<td>KOSR. Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid Mixture 1, Chemically Defined</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>L0288-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 500mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2GPU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma&#160; Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 250mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2GPU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit</td>
			<td>2mag</td>
			<td>VMF 90250 U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive</td>
			<td>2mag</td>
			<td>VMF 40600</td>
			<td>6MSP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MP Biomedicals&#160; 7X Cleaning Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MP0976670A4</td>
			<td>Tissue culture suitable detergent. Make a 5% solution in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF, and mTeSR Plus medium have also been tested and are suitable alternatives.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50 mL Conical, Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-mpt</td>
			<td>Anti-mycoplasma reagent. Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer&#174; 200 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0776417</td>
			<td>Cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer&#174; 500 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0822591</td>
			<td>Cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol) 87-90% hydrolyzed&#160; (PVA)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P8136-250G</td>
			<td>10% in DPBS stirring at 98 degrees C until disolves, make in 138-3211-FLS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y-27632 (ROCKi)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td>10 mM stock in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Serological Pipets&#160; - 10mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Serological Pipets - 25mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Serological pipette - 5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-12D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeSR-E5</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5916</td>
			<td>Serum-free, low protein base medium for E5-ILP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variomag distriBOX 2 Distributor</td>
			<td>2mag</td>
			<td>VMF 90512</td>
			<td>If you use more than one MIXdrive</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simplified method for generating kidney organoids from human pluripotent stem cells

एचपीएससी से उत्पन्न गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स ने गुर्दे के ऊतकों का एक असीमित स्रोत प्रदान किया है। मानव गुर्दे organoids गुर्दे की बीमारी और चोट का अध्ययन करने, सेल आधारित उपचार विकसित करने और नए चिकित्सीय परीक्षण के लिए एक अमूल्य उपकरण हैं। इस तरह के अनुप्रयोगों के लिए, बड़ी संख्या में समान ऑर्गेनोइड्स और अत्यधिक पुन: प्रस्तुत करने योग्य assays की आवश्यकता होती है। हमने ऑर्गेनोइड्स के समग्र स्वास्थ्य में सुधार करने के लिए अपने पहले से प्रकाशित किडनी ऑर्गेनोइड प्रोटोकॉल पर निर्माण किया है। इस सरल, मजबूत 3 डी प्रोटोकॉल में लिपिड, इंसुलिन-ट्रांसफरिन-सेलेनियम-एथेनोलामाइन पूरक और जीएसके 3 अवरोधक (CHIR99021) के साथ पॉलीविनाइल अल्कोहल युक्त न्यूनतम घटक माध्यम में समान भ्रूण निकायों का गठन शामिल है, इसके बाद नॉक-आउट सीरम रिप्लेसमेंट (KOSR) में संस्कृति होती है- युक्त माध्यम। इसके अलावा, आंदोलनकारी assays embryoid निकायों के clumping में कमी और एक समान आकार को बनाए रखने के लिए अनुमति देता है, जो organoids के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। कुल मिलाकर, प्रोटोकॉल बड़ी मात्रा में गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने के लिए एक तेज़, कुशल और लागत प्रभावी विधि प्रदान करता है।

हमारे प्रोटोकॉल के इस सबसे हालिया संस्करण में, गुर्दे के ऑर्गेनोइड भेदभाव को एक परिभाषित, कम प्रोटीन माध्यम में शुरू किया जाता है। assays पूरी तरह से निलंबन में प्रदर्शन कर रहे हैं और hPSCs भेदभाव और tubulogenesis की द?...

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A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

यहां हम मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी) से गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। यह प्रोटोकॉल दो सप्ताह के भीतर गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करता है। परिणामी गुर्दे organoids बड़े पैमाने पर स्पिनर फ्लास्क या समानांतर दवा परीक्षण दृष्टिकोण के लिए बहु अच्छी तरह से चुंबकीय हलचल प्लेटों में सुसंस्कृत किया जा सकता है।

मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने के लिए एक सरलीकृत विधि

Kidney organoids generated from hPSCs have provided an unlimited source of renal tissue. Human kidney organoids are an invaluable tool for studying kidney ...

इस विधि को सेल संस्कृति प्रयोगों के लिए सुसज्जित किसी भी प्रयोगशाला में किया जा सकता है। इस विधि का उपयोग करके, हम गुर्दे के विकास और रोग मार्गों की हमारी समझ को आगे बढ़ा सकते हैं। यह गुर्दे organoids उत्पन्न करने के लिए दूसरों की तुलना में एक अपेक्षाकृत सरल और सस्ती विधि है।इस तकनीक की सबसे बड़ी चुनौती उच्च गुणवत्ता वाले मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल संस्कृति को बनाए रखना है। यह महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं को 80% से कम confluency पर बनाए रखा जाता है और नियमित रूप से विभाजित किया जाता है। मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल संस्कृति के लिए नए शोधकर्ताओं को भेदभाव के लिए आगे बढ़ने से पहले स्टेम सेल लाइनों के साथ खुद को परिचित करना चाहिए।एक छह अच्छी तरह से अल्ट्रा कम लगाव प्लेट के प्रत्येक कुएं में पूरा E5-ILP माध्यम के दो milliliters जोड़ने के द्वारा गुर्दे organoid परख शुरू करो. संस्कृति मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं, या एचपीएससी, 100-मिलीमीटर ऊतक संस्कृति-उपचारित प्लेटों में, जब तक कि वे 60% confluency तक नहीं पहुंच जाते। डीपीबीएस के लगभग आठ मिलीलीटर के साथ दो बार एचपीएससी को धोएं।DPBS aspirate, फिर कोशिकाओं को कवर करने के लिए Dispase dropwise के दो milliters जोड़ें, और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर छह मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। DPBS के लगभग 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को तीन बार धोएं। DPBS aspirate, फिर 45 डिग्री से प्लेट झुकाव, और एक सेल भारोत्तोलक के साथ कोशिकाओं को नीचे खुरचना।एक 10-मिलीलीटर सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके पूर्ण E5-ILP माध्यम के छह मिलीलीटर के साथ शीर्ष से नीचे कालोनियों को धोएं। फिर, पिपेट को लंबवत रूप से पकड़कर, बड़े उपनिवेशों को धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइप करके तोड़ दें, इस बात का ध्यान रखें कि संस्कृति प्लेट के किनारों को न छुएं। छह-अच्छी तरह से प्लेट में प्रति अच्छी तरह से एक मिलीलीटर जोड़कर कॉलोनी समूहों को समान रूप से वितरित करें, फिर प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर के अंदर एक कक्षीय शेकर पर रखें।वैकल्पिक रूप से, यदि एक कक्षीय शेकर उपलब्ध नहीं है, तो कोशिकाओं को स्थिर रूप से सुसंस्कृत किया जा सकता है। दूसरे दिन, भ्रूणीय निकायों को प्लेट के नीचे बसने के बाद, प्लेट को 45 डिग्री तक झुकाएं, और मध्यम को ऊपर से धीरे-धीरे एस्पिरेट करें, प्रति अच्छी तरह से एक मिलीलीटर छोड़ दें। तैयार पूर्ण माध्यम के दो मिलीलीटर प्रति अच्छी तरह से जोड़ें, और प्लेट को शेकर में वापस कर दें।तीसरे दिन, पहले के रूप में प्रदर्शित माध्यम को एस्पिरेट करने के बाद, 10-मिलीलीटर सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक कुएं से सभी भ्रूण निकायों को सावधानीपूर्वक इकट्ठा करें, और उन्हें 50-मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। किसी भी शेष भ्रूण निकायों को इकट्ठा करने के लिए, प्रत्येक को कम ग्लूकोज डीएमईएम के एक मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से कुल्ला करें, और उन्हें एक ही 50-मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में जोड़ें। ट्यूब के तल पर बसने के लिए भ्रूणीय निकायों की प्रतीक्षा करते समय, छह-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में चरण II माध्यम के दो मिलीलीटर जोड़ें।इसके बाद, एक नए 50-मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के शीर्ष पर 200-माइक्रोमीटर सेल स्ट्रेनर रखकर और सेल छलनी पर सभी भ्रूण निकायों को सावधानीपूर्वक पिपेट करके बड़े भ्रूणीय निकायों को छलनी करें। छलनी में फंसे किसी भी भ्रूण निकायों को इकट्ठा करने के लिए डीएमईएम के अतिरिक्त पांच मिलीलीटर के साथ सेल छलनी को कुल्ला करें। बाद के चरणों में, पहले बहुत बड़े भ्रूणीय निकायों को छलनी करने के लिए 500-माइक्रोमीटर छलनी का उपयोग करें, फिर नलिकाओं के बिना बहुत छोटे भ्रूण निकायों को छलनी करने के लिए 200-माइक्रोमीटर छलनी के माध्यम से फ़िल्टर को पारित करें।200 से 500 माइक्रोमीटर के बीच सही आकार के भ्रूण निकायों को इकट्ठा करें, 200-माइक्रोमीटर छलनी को एक नए 50-मिलीमीटर ट्यूब में उलटकर और डीपीबीएस के साथ छलनी को धोकर। तनाव के बाद, भ्रूण निकायों को शंक्वाकार ट्यूब के नीचे बसने की अनुमति दें, फिर supernatant को एस्पिरेट करें, और DMEM के लगभग 10 मिलीलीटर के साथ धोएं। फिर, चरण II माध्यम के छह मिलीलीटर में भ्रूणीय निकायों को फिर से निलंबित करें।भ्रूणीय निकायों को छह-अच्छी तरह से अल्ट्रा-कम अनुलग्नक प्लेट में वापस स्थानांतरित करें, उन्हें कुओं के बीच समान रूप से वितरित करें। चूंकि अधिकांश ऑर्गेनोइड्स पिपेट के शीर्ष पर इकट्ठा होते हैं, इसलिए अंत में लगभग आधा मिलीलीटर छोड़ दें, फिर धीरे से प्रत्येक कुएं में मीडिया को टिप को स्पर्श करें, जिससे ऑर्गेनोइड्स को कुएं में प्रवाहित किया जा सके। चरण II माध्यम के 45 मिलीलीटर के साथ एक 125-मिलीलीटर स्पिनर फ्लास्क में भ्रूण निकायों को स्थानांतरित करें।चुंबकीय हलचल की गति को 120 आरपीएम पर सेट करें, और फ्लास्क को इनक्यूबेटर में रखें। भ्रूणीय निकायों या गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स को खिलाने के लिए, उन्हें स्पिनर फ्लास्क के नीचे संक्षेप में बसने दें, फिर फ्लास्क के एक तरफ की बांह से ढक्कन उठाएं, और एस्पिरेटिंग पिपेट को अंदर की ओर की दीवार के विपरीत को छूने वाली नोक के साथ अंदर रखें। धीरे-धीरे पिपेट को नीचे की ओर कोण करें, और माध्यम के लगभग आधे हिस्से को एस्पिरेट करें।एक ही उद्घाटन के माध्यम से इसे pipetting द्वारा ताजा चरण द्वितीय माध्यम के 20 milliliters के साथ फिर से भरें। लंबे बाँझ संदंश का उपयोग ध्यान से भ्रूण निकायों या गुर्दे organoids के साथ एक छह अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में एक चुंबकीय हलचल पट्टी जगह करने के लिए। प्लेट को छह पहिया चुंबकीय हलचल प्लेट पर रखें, और गति को 120 आरपीएम पर सेट करें।चुंबकीय हलचल सलाखों के लिए स्थिति में स्नैप करने और कताई शुरू करने के लिए, पहले बिजली के स्तर को 100 पर सेट करें। एक बार जब सभी सलाखों कताई शुरू करते हैं, तो बिजली के स्तर को 25 तक नीचे लाएं। पहले से प्रदर्शित आधे माध्यम को बदलकर गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स को बनाए रखें।दिन 14 गुर्दे organoids के पैराफिन वर्गों के immunofluorescence नेफ्रॉन खंडों की उपस्थिति दिखाते हैं जैसे कि गुर्दे की नलिकाएं हेपेटोसाइट परमाणु कारक -1 बीटा और लोटस टेट्रागोनोलोबस लेक्टिन को व्यक्त करती हैं, साथ ही साथ पोडोसाइट क्लस्टर वी-एमएएफ मस्कुलोपोन्यूरोटिक फाइब्रोसारकोमोटिक फाइब्रोसारकोमा ओंकोजीन होमोलॉग बी और नेफ्रिन को व्यक्त करते हैं। इस प्रोटोकॉल में संशोधन एंडोथेलियल कोशिकाओं के विस्तार का समर्थन कर सकते हैं, जैसा कि संस्कृति के दिन 26 में प्लेटलेट और एंडोथेलियल सेल आसंजन अणु -1 के साथ धुंधला होने से पुष्टि की गई है। मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं को उचित समय के लिए डिस्पेज़ के साथ इलाज करने की आवश्यकता होती है, फिर सभी निशानों को हटाने के लिए अच्छी तरह से धोया जाता है।यदि डिस्पेज़ को पूरी तरह से हटाया नहीं जाता है, तो यह कोशिका मृत्यु और भ्रूण निकायों के क्लस्टरिंग का कारण बन सकता है। इस विधि ने हमें जन्मजात गुर्दे की बीमारियों के विकास की जांच करने में मदद की है, साथ ही साथ विभिन्न गुर्दे की चोट के मार्गों और विट्रो में चिकित्सीय हस्तक्षेप की क्षमता है।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

मानव स्टेम कोशिकाओं से melanocytes के फीडर मुफ्त व्युत्पत्ति

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

परिभाषित किया है और मानव स्टेम कोशिकाओं से Hepatocyte कोशिकाओं की तरह की स्केलेबल जनरेशन

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

मानव भ्रूण या प्रेरित Pluripotent स्टेम कोशिकाओं से रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं के तेजी से, निर्देशित भेदभाव

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम कोशिकाओं से मानकीकृत और प्रतिलिपि Forebrain-प्रकार सेरेब्रल Organoids की पीढ़ी

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

लिवर सेल में मानव Pluripotent स्टेम सेल के कुशल भेदभाव

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल से Somite डेरिवेटिव के विट्रो पीढ़ी में

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

मानव भ्रूण स्टेम सेल से मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड पैदा करने के लिए एक स्थिर स्व-निर्देशित विधि

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

In vitro Neuromuscular Junction Induced from Human Induced Pluripotent Stem Cells

इन विट्रो न्यूरोमस्कुलर जंक्शन मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल से प्रेरित

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized synapse that transmits action potentials from the motor neuron to skeletal muscle for mechanical ...

Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells

मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से हेमोजेनिक एंडोथेलियल कोशिकाओं का निर्देशित भेदभाव

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial ...