Name: a simplified method for generating kidney organoids from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-04-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Questa ricerca è stata finanziata dal National Institutes of Health R01 DK069403, UC2 DK126122 e P30-DK079307 e ASN Foundation for Kidney Research Ben J. Lipps Research Fellowship Program to AP.

Tutti gli esperimenti che utilizzano hPSC sono stati eseguiti in conformità con le linee guida istituzionali e sono stati condotti in una cappa di biosicurezza di Classe II con adeguati dispositivi di protezione individuale. Tutti i reagenti sono di grado di coltura cellulare, salvo diversa indicazione. Tutte le colture vengono incubate a 37 °C, 5% CO2 atmosfera atmosferica. In tutte le fasi del test, i corpi embrioidi o gli organoidi renali possono essere raccolti e fissati o preparati per l'analisi. Le lin...

<ol>
	<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids.">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communications. 6, 8715 (2015).</li><li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury.">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li><li>Taguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+in+vivo+origin+of+metanephric+nephron+progenitors+enables+generation+of+complex+kidney+structures+from+pluripotent+stem+cells.">Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2013).</li><li>Przepiorski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+bioreactor-based+method+to+generate+kidney+organoids+from+pluripotent+stem+cells.">A simple bioreactor-based method to generate kidney organoids from pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 11 (2), 470-484 (2018).</li><li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids.">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communication. 6, 8715 (2015).</li><li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury.">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Taguchi, A., Nishinakamura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-order+kidney+organogenesis+from+pluripotent+stem+cells.">Higher-order kidney organogenesis from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).</li><li>Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+organoids+with+improved+collecting+duct+maturation+and+injury+modeling.">Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling.</a> Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).</li><li>Howden, S. E., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+using+defined+conditions.">Generating kidney organoids from human pluripotent stem cells using defined conditions.</a> Methods in Molecular Biology. 2155, 183-192 (2020).</li><li>Tanigawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin+is+superior+to+BMP7+for+efficient+maintenance+of+human+iPSC-derived+nephron+progenitors.">Activin is superior to BMP7 for efficient maintenance of human iPSC-derived nephron progenitors.</a> Stem Cell Reports. 13 (2), 322-337 (2019).</li><li>Sander, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+large-scale+production+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Protocol for large-scale production of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100150 (2020).</li><li>Ekblom, P., Thesleff, I., Miettinen, A., Saxen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+defined+medium+supplemented+with+transferrin.">Organogenesis in a defined medium supplemented with transferrin.</a> Cell Differentiation. 10 (5), 281-288 (1981).</li><li>Thesleff, I., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+transferrin+in+branching+morphogenesis,+growth+and+differentiation+of+the+embryonic+kidney.">Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 82, 147-161 (1984).</li><li>Freund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+redirects+differentiation+from+cardiogenic+mesoderm+and+endoderm+to+neuroectoderm+in+differentiating+human+embryonic+stem+cells.">Insulin redirects differentiation from cardiogenic mesoderm and endoderm to neuroectoderm in differentiating human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26 (3), 724-733 (2008).</li><li>Nishikawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimal+serum-free+defined+condition+for+in+vitro+culture+of+kidney+organoids.">An optimal serum-free defined condition for in vitro culture of kidney organoids.</a> Biochemistry and Biophysics Research Communication. 501 (4), 996-1002 (2018).</li><li>Oh, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+New+Zealand+donors.">Derivation of induced pluripotent stem cell lines from New Zealand donors.</a> Journal of the Royal Society of New Zealand. , 1-14 (2020).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney.">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2013).</li><li>Lam, A. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intermediate+mesoderm+that+forms+tubules+expressing+kidney+proximal+tubular+markers.">Rapid and efficient differentiation of human pluripotent stem cells into intermediate mesoderm that forms tubules expressing kidney proximal tubular markers.</a> Journal of American Society of Nephrology. 25 (6), 1211-1225 (2014).</li><li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+embryoid+body+microenvironment+to+direct+embryonic+stem+cell+differentiation.">Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation.</a> Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).</li><li>Imasawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+repatterns+human+podocyte+energy+metabolism+during+differentiation+and+diabetic+nephropathy.">High glucose repatterns human podocyte energy metabolism during differentiation and diabetic nephropathy.</a> FASEB Journal. 31 (1), 294-307 (2017).</li><li>Kim, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+condition+induces+autophagy+in+endothelial+progenitor+cells+contributing+to+angiogenic+impairment.">High glucose condition induces autophagy in endothelial progenitor cells contributing to angiogenic impairment.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (7), 1248-1252 (2014).</li><li>Piwkowska, A., Rogacka, D., Audzeyenka, I., Jankowski, M., Angielski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+concentration+affects+the+oxidant-antioxidant+balance+in+cultured+mouse+podocytes.">High glucose concentration affects the oxidant-antioxidant balance in cultured mouse podocytes.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 112 (6), 1661-1672 (2011).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+and+refinement+of+human+PSC-derived+kidney+organoid+differentiation+with+single-cell+transcriptomics.">Comparative analysis and refinement of human PSC-derived kidney organoid differentiation with single-cell transcriptomics.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 869-881 (2018).</li><li>Lei, X., Deng, Z., Duan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniform+embryoid+body+production+and+enhanced+mesendoderm+differentiation+with+murine+embryonic+stem+cells+in+a+rotary+suspension+bioreactor.">Uniform embryoid body production and enhanced mesendoderm differentiation with murine embryonic stem cells in a rotary suspension bioreactor.</a> Methods in Molecular Biology. , (2016).</li></ol>

Studi precedenti hanno dimostrato che le fasi iniziali del protocollo sono fondamentali per la differenziazione del mesoderma intermedio 5,19,20 e, pertanto, è essenziale implementare una composizione media rigorosa in questa fase. La rimozione di componenti indefiniti come siero, albumina, ibridoma medio II privo di proteine dal primo stadio del protocollo può aiutare a migliorare l'efficienza di differenziazione coerente tra...

Negli ultimi anni, sono stati sviluppati una serie di protocolli per differenziare le cellule staminali pluripotenti umane in organoidi renali 1,2,3,4,5. Gli organoidi renali hanno fornito uno strumento importante per aiutare la ricerca su nuovi approcci di medicina rigenerativa, modellare malattie renali, eseguire studi di tossicità e sviluppo di farmaci terapeutici. Nonostante la loro ampia applicabilità, gli organoidi renali hanno limitazioni come la mancanza di maturazione, la limitata capacità di coltura a lungo termine in vitro e una scarsità di diversi tipi di cellule presenti nel rene umano 6,7,8. Recenti lavori si sono concentrati sul miglioramento del livello di maturazione organoide, estendendo i periodi di coltura ed espandendo la complessità delle popolazioni di cellule renali modificando i protocolli esistenti 9,10,11,12. In questa attuale iterazione del nostro protocollo stabilito 5,13, abbiamo modificato i componenti medi nella prima fase del protocollo in un mezzo base privo di siero integrato con insulina-transferrina-selenio-etanolammina (ITSE), lipidi, alcool polivinilico (E5-ILP) e CHIR99021 (Figura 1). Questi cambiamenti forniscono un mezzo completamente definito, privo di siero, a basso contenuto proteico, con meno componenti rispetto alla nostra precedente composizione media 5,13 e senza ulteriori fattori di crescita. Di conseguenza, il mezzo di prima fase è meno laborioso da preparare rispetto alla nostra versione pubblicata in precedenza e può ridurre la variabilità da lotto a lotto5. Studi precedenti hanno dimostrato che sia l'insulina che la transferrina sono importanti nella coltura priva di siero14,15, tuttavia, alti livelli di insulina possono essere inibitori della differenziazione del mesoderma16. Abbiamo mantenuto i bassi livelli di insulina come previsto nel protocollo originale e ulteriormente ridotto i livelli di KOSR (contenente insulina) nella seconda fase del test. In linea con altri protocolli per la formazione di organoidi renali, livelli più bassi di KOSR sono utili per mantenere un equilibrio tra proliferazione e differenziazione del tessuto renale17. Inoltre, abbiamo abbassato la concentrazione di glucosio nel nostro mezzo di stadio II13.
Il nostro metodo descrive una configurazione per il dosaggio in sospensione di organoidi renali, producendo fino a ~ 1.000 organoidi da una piastra di coltura iniziale di hPSC 100 mm confluente al ~ 60% come descritto nella pubblicazione originale 5,13. Questo protocollo può essere facilmente scalato fino a partire da più piastre da 100 mm o 150 mm per aumentare ulteriormente i numeri organoidi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21-985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-adherence rinsing solution</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72054</td>
			<td>10 mM stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;disposable spinner flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-201-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Ultra-Low Attachment 6-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Slow-Speed Stirrers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-495-03</td>
			<td>Multi plate magnetic stirrer for spinner flask culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11054020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14-190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg / Oval Stirring Bars</td>
			<td>2mag</td>
			<td>PI20106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelta General-Purpose Tweezers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-456-103</td>
			<td>Keep sterile in the cell culture hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZBio Single Use Media Bottle, 250mL</td>
			<td>Foxx Life Sciences</td>
			<td>138-3211-FLS</td>
			<td>Used to make PVA 10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes (100 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Sterile Aspirating Pipet 2mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160; Cell Lifters - Cell lifter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Multi Function 3D Rotators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88-861-047</td>
			<td>Orbital shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1413302</td>
			<td>BME. Aliquot on ice and freeze. Another suitable matrix alternative is Matrigel or Cultrex.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td>GCDR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td>L-glutamine supplement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51-500-056</td>
			<td>ITSE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut&#160; Serum Replacement - Multi-Species</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A3181502</td>
			<td>KOSR. Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid Mixture 1, Chemically Defined</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>L0288-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 500mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2GPU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma&#160; Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 250mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2GPU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit</td>
			<td>2mag</td>
			<td>VMF 90250 U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive</td>
			<td>2mag</td>
			<td>VMF 40600</td>
			<td>6MSP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MP Biomedicals&#160; 7X Cleaning Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MP0976670A4</td>
			<td>Tissue culture suitable detergent. Make a 5% solution in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF, and mTeSR Plus medium have also been tested and are suitable alternatives.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50 mL Conical, Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-mpt</td>
			<td>Anti-mycoplasma reagent. Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer&#174; 200 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0776417</td>
			<td>Cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer&#174; 500 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0822591</td>
			<td>Cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol) 87-90% hydrolyzed&#160; (PVA)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P8136-250G</td>
			<td>10% in DPBS stirring at 98 degrees C until disolves, make in 138-3211-FLS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y-27632 (ROCKi)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td>10 mM stock in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Serological Pipets&#160; - 10mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Serological Pipets - 25mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Serological pipette - 5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-12D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeSR-E5</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5916</td>
			<td>Serum-free, low protein base medium for E5-ILP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variomag distriBOX 2 Distributor</td>
			<td>2mag</td>
			<td>VMF 90512</td>
			<td>If you use more than one MIXdrive</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simplified method for generating kidney organoids from human pluripotent stem cells

Gli organoidi renali generati dalle hPSC hanno fornito una fonte illimitata di tessuto renale. Gli organoidi renali umani sono uno strumento inestimabile per studiare malattie e lesioni renali, sviluppare terapie cellulari e testare nuove terapie. Per tali applicazioni è necessario un gran numero di organoidi uniformi e saggi altamente riproducibili. Abbiamo costruito sul nostro protocollo organoide renale precedentemente pubblicato per migliorare la salute generale degli organoidi. Questo semplice e robusto protocollo 3D prevede la formazione di corpi embrioidi uniformi in un mezzo componente minimo contenente lipidi, integratore di insulina-transferrina-selenio-etanolammina e alcool polivinilico con inibitore GSK3 (CHIR99021) per 3 giorni, seguito da coltura in mezzo contenente siero sostitutivo knock-out (KOSR). Inoltre, i saggi di agitazione consentono di ridurre l'aggregazione dei corpi embrioidi e di mantenere una dimensione uniforme, che è importante per ridurre la variabilità tra gli organoidi. Nel complesso, il protocollo fornisce un metodo veloce, efficiente ed economico per generare grandi quantità di organoidi renali.

In questa versione più recente del nostro protocollo, la differenziazione degli organoidi renali viene avviata in un mezzo definito a basso contenuto proteico. I saggi vengono eseguiti interamente in sospensione e si basano sulla capacità innata di differenziazione e organizzazione delle hPSC per l'inizio della tubulogenesi. Un singolo test proveniente da una piastra di coltura hPSC confluente da 100 mm ~ 60% produce abitualmente 500-1.000 organoidi renali, come mostrato nella nostra precedente pubblicazione<sup class=...

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A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

Qui descriviamo un protocollo per generare organoidi renali da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC). Questo protocollo genera organoidi renali entro due settimane. Gli organoidi renali risultanti possono essere coltivati in fiaschi spinner su larga scala o piastre magnetiche multi-pozzo per approcci paralleli di test antidroga.

Un metodo semplificato per la generazione di organoidi renali da cellule staminali pluripotenti umane

Kidney organoids generated from hPSCs have provided an unlimited source of renal tissue. Human kidney organoids are an invaluable tool for studying kidney ...

Questo metodo può essere eseguito in qualsiasi laboratorio attrezzato per esperimenti di coltura cellulare. Usando questo metodo, possiamo approfondire la nostra comprensione dello sviluppo renale e dei percorsi della malattia. Questo è un metodo relativamente semplice e poco costoso rispetto ad altri per generare organoidi renali.La più grande sfida di questa tecnica è mantenere una coltura di cellule staminali pluripotenti umane di alta qualità. È fondamentale che le cellule siano mantenute a meno dell'80% di confluenza e divise regolarmente. I ricercatori nuovi alla coltura umana di cellule staminali pluripotenti dovrebbero familiarizzare con le linee di cellule staminali prima di procedere alla differenziazione.Iniziare il test organoide renale aggiungendo due millilitri di mezzo E5-ILP completo in ciascun pozzetto di una piastra di attacco ultra-bassa a sei pozzetti. Coltiva cellule staminali pluripotenti umane, o hPSC, in piastre trattate con colture tissutali da 100 millimetri fino a raggiungere il 60% di confluenza. Lavare le hPSC due volte con circa otto millilitri di DPBS.Aspirare il DPBS, quindi aggiungere due millilitri di Dispase dropwise per coprire le cellule e incubarle per sei minuti a 37 gradi Celsius. Lavare le cellule tre volte con circa 10 millilitri di DPBS. Aspirare il DPBS, quindi inclinare la piastra di 45 gradi e raschiare le celle verso il basso con un sollevatore di celle.Lavare le colonie dall'alto con sei millilitri di mezzo E5-ILP completo usando una pipetta sierologica da 10 millilitri. Quindi, tenendo la pipetta verticalmente, rompere grandi colonie pipettando delicatamente su e giù, facendo attenzione a non toccare i lati della piastra di coltura. Distribuire uniformemente i grappoli di colonie aggiungendo un millilitro per pozzetto nella piastra a sei pozzetti, quindi posizionare la piastra su uno shaker orbitale all'interno di un incubatore a 37 gradi Celsius.In alternativa, se non è disponibile uno shaker orbitale, le cellule possono essere coltivate staticamente. Il secondo giorno, dopo aver lasciato che i corpi embrioidi si depositassero nella parte inferiore della piastra, inclinare la piastra di 45 gradi e aspirare lentamente il mezzo dall'alto, lasciando un millilitro per pozzetto. Aggiungere due millilitri di mezzo completo preparato per pozzetto e riportare la piastra allo shaker.Il terzo giorno, dopo aver aspirato il mezzo come precedentemente dimostrato, raccogliere tutti i corpi embrioidi con attenzione da ciascun pozzetto usando una pipetta sierologica da 10 millilitri e trasferirli in un tubo conico da 50 millilitri. Per raccogliere eventuali corpi embrioidi rimanenti, sciacquare ciascuno con un millilitro di DMEM a basso contenuto di glucosio e aggiungerli allo stesso tubo conico da 50 millilitri. Mentre aspetti che i corpi embrioidi si depositino sul fondo del tubo, aggiungi due millilitri di mezzo allo stadio II a ciascun pozzetto della piastra a sei pozzetti.Successivamente, setacciare grandi corpi embrioidi posizionando un filtro cellulare da 200 micrometri sopra un nuovo tubo conico da 50 millilitri e pipettando attentamente tutti i corpi embrioidi sopra il colino cellulare. Risciacquare il colino cellulare con altri cinque millilitri di DMEM per raccogliere eventuali corpi embrioidi bloccati nel colino. Nelle fasi successive, utilizzare prima un filtro da 500 micrometri per setacciare corpi embrioidi molto grandi, quindi far passare il filtrato attraverso un filtro da 200 micrometri per setacciare corpi embrioidi molto piccoli senza tubuli.Raccogliere i corpi embrioidi di dimensioni corrette, tra 200 e 500 micrometri, invertendo il filtro da 200 micrometri in un nuovo tubo da 50 millilitri e lavando il filtro con DPBS. Dopo lo sforzo, lasciare che i corpi embrioidi si depositino sul fondo del tubo conico, quindi aspirare il surnatante e lavare con circa 10 millilitri di DMEM. Quindi, risospendere i corpi embrioidi in sei millilitri di stadio II del mezzo.Trasferire i corpi embrioidi nella piastra di attacco ultra-bassa a sei pozzetti, distribuendoli uniformemente tra i pozzetti. Poiché la maggior parte degli organoidi si raccoglie nella parte superiore della pipetta, lasciare circa mezzo millilitro alla fine, quindi toccare delicatamente la punta al mezzo in ciascun pozzetto, consentendo agli organoidi di fluire nel pozzo. Trasferire i corpi embrioidi in un pallone da 125 millilitri con 45 millilitri di mezzo stage II.Impostare la velocità di agitazione magnetica a 120 giri / min e posizionare il pallone nell'incubatrice. Per nutrire i corpi embrioidi o gli organoidi renali, lasciarli depositare brevemente sul fondo del pallone spinner, quindi sollevare il coperchio da un braccio laterale del pallone e posizionare la pipetta aspirante all'interno con la punta che tocca la parete interna opposta. Inclinare lentamente la pipetta verso il basso e aspirare circa la metà del mezzo.Ricostituire con 20 millilitri di mezzo fresco Stage II pipettandolo attraverso la stessa apertura. Utilizzare lunghe pinze sterili per posizionare con cura una barra magnetica in ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti con corpi embrioidi o organoidi renali. Posizionare la piastra sulla piastra magnetica a sei ruote e impostare la velocità su 120 giri / min.Affinché le barre magnetiche si aggancino in posizione e inizino a girare, impostare prima il livello di potenza su 100. Una volta che tutte le barre iniziano a girare, porta il livello di potenza a 25. Mantenere gli organoidi renali cambiando metà del mezzo come precedentemente dimostrato.L'immunofluorescenza delle sezioni di paraffina degli organoidi renali del giorno 14 mostra la presenza di segmenti di nefrone come i tubuli renali che esprimono il fattore nucleare epatocitario-1 beta e la lectina del tetragonolobus del loto, nonché cluster di podociti che esprimono il fibrosarcoma muscolo-oponeurotico V-maf oncogene omologo B e nefrina. Le modifiche in questo protocollo possono supportare l'espansione delle cellule endoteliali, come confermato dalla colorazione con molecola di adesione piastrinica ed endoteliale-1 al giorno 26 della coltura. Le cellule staminali pluripotenti umane devono essere trattate con Dispase per il periodo di tempo appropriato, quindi accuratamente lavate per rimuovere tutte le tracce.Se Dispase non viene completamente rimosso, può portare alla morte cellulare e al raggruppamento di corpi embrioidi. Questo metodo ci ha aiutato a esaminare lo sviluppo di malattie renali congenite, nonché vari percorsi di danno renale e il potenziale per interventi terapeutici in vitro.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

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Ricerca

Biologia dello sviluppo

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Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

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