Name: a simplified method for generating kidney organoids from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-04-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Denne forskningen ble finansiert av National Institutes of Health R01 DK069403, UC2 DK126122 og P30-DK079307 og ASN Foundation for Kidney Research Ben J. Lipps Research Fellowship Program til AP.

Alle eksperimenter som brukte hPSCer ble utført i samsvar med institusjonelle retningslinjer, og ble utført i en klasse II biosikkerhetshette med passende personlig verneutstyr. Alle reagenser er cellekulturklasse med mindre annet er oppgitt. Alle kulturer inkuberes ved 37 °C, 5 % CO2 luftatmosfære. I alle stadier av analysen kan embryoide kropper eller nyreorganoider samles inn, og fikses eller forberedes for analyse. HPSC-linjene som brukes til å generere disse dataene, er fullstendig karakterisert og p...

<ol>
	<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids.">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communications. 6, 8715 (2015).</li><li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury.">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li><li>Taguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+in+vivo+origin+of+metanephric+nephron+progenitors+enables+generation+of+complex+kidney+structures+from+pluripotent+stem+cells.">Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2013).</li><li>Przepiorski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+bioreactor-based+method+to+generate+kidney+organoids+from+pluripotent+stem+cells.">A simple bioreactor-based method to generate kidney organoids from pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 11 (2), 470-484 (2018).</li><li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids.">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communication. 6, 8715 (2015).</li><li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury.">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Taguchi, A., Nishinakamura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-order+kidney+organogenesis+from+pluripotent+stem+cells.">Higher-order kidney organogenesis from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).</li><li>Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+organoids+with+improved+collecting+duct+maturation+and+injury+modeling.">Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling.</a> Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).</li><li>Howden, S. E., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+using+defined+conditions.">Generating kidney organoids from human pluripotent stem cells using defined conditions.</a> Methods in Molecular Biology. 2155, 183-192 (2020).</li><li>Tanigawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin+is+superior+to+BMP7+for+efficient+maintenance+of+human+iPSC-derived+nephron+progenitors.">Activin is superior to BMP7 for efficient maintenance of human iPSC-derived nephron progenitors.</a> Stem Cell Reports. 13 (2), 322-337 (2019).</li><li>Sander, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+large-scale+production+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Protocol for large-scale production of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100150 (2020).</li><li>Ekblom, P., Thesleff, I., Miettinen, A., Saxen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+defined+medium+supplemented+with+transferrin.">Organogenesis in a defined medium supplemented with transferrin.</a> Cell Differentiation. 10 (5), 281-288 (1981).</li><li>Thesleff, I., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+transferrin+in+branching+morphogenesis,+growth+and+differentiation+of+the+embryonic+kidney.">Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 82, 147-161 (1984).</li><li>Freund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+redirects+differentiation+from+cardiogenic+mesoderm+and+endoderm+to+neuroectoderm+in+differentiating+human+embryonic+stem+cells.">Insulin redirects differentiation from cardiogenic mesoderm and endoderm to neuroectoderm in differentiating human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26 (3), 724-733 (2008).</li><li>Nishikawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimal+serum-free+defined+condition+for+in+vitro+culture+of+kidney+organoids.">An optimal serum-free defined condition for in vitro culture of kidney organoids.</a> Biochemistry and Biophysics Research Communication. 501 (4), 996-1002 (2018).</li><li>Oh, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+New+Zealand+donors.">Derivation of induced pluripotent stem cell lines from New Zealand donors.</a> Journal of the Royal Society of New Zealand. , 1-14 (2020).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney.">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2013).</li><li>Lam, A. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intermediate+mesoderm+that+forms+tubules+expressing+kidney+proximal+tubular+markers.">Rapid and efficient differentiation of human pluripotent stem cells into intermediate mesoderm that forms tubules expressing kidney proximal tubular markers.</a> Journal of American Society of Nephrology. 25 (6), 1211-1225 (2014).</li><li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+embryoid+body+microenvironment+to+direct+embryonic+stem+cell+differentiation.">Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation.</a> Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).</li><li>Imasawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+repatterns+human+podocyte+energy+metabolism+during+differentiation+and+diabetic+nephropathy.">High glucose repatterns human podocyte energy metabolism during differentiation and diabetic nephropathy.</a> FASEB Journal. 31 (1), 294-307 (2017).</li><li>Kim, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+condition+induces+autophagy+in+endothelial+progenitor+cells+contributing+to+angiogenic+impairment.">High glucose condition induces autophagy in endothelial progenitor cells contributing to angiogenic impairment.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (7), 1248-1252 (2014).</li><li>Piwkowska, A., Rogacka, D., Audzeyenka, I., Jankowski, M., Angielski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+concentration+affects+the+oxidant-antioxidant+balance+in+cultured+mouse+podocytes.">High glucose concentration affects the oxidant-antioxidant balance in cultured mouse podocytes.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 112 (6), 1661-1672 (2011).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+and+refinement+of+human+PSC-derived+kidney+organoid+differentiation+with+single-cell+transcriptomics.">Comparative analysis and refinement of human PSC-derived kidney organoid differentiation with single-cell transcriptomics.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 869-881 (2018).</li><li>Lei, X., Deng, Z., Duan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniform+embryoid+body+production+and+enhanced+mesendoderm+differentiation+with+murine+embryonic+stem+cells+in+a+rotary+suspension+bioreactor.">Uniform embryoid body production and enhanced mesendoderm differentiation with murine embryonic stem cells in a rotary suspension bioreactor.</a> Methods in Molecular Biology. , (2016).</li></ol>

Tidligere studier har vist at de første protokolltrinnene er kritiske for mellomliggende mesoderm differensiering 5,19,20 og derfor er det viktig å implementere en streng middels sammensetning på dette stadiet. Fjerning av udefinerte komponenter som serum, albumin, proteinfritt hybridom medium II fra første fase av protokollen kan bidra til å forbedre konsistent differensieringseffektivitet mellom analysene<sup class="xref"...

I de senere år har en rekke protokoller for å skille menneskelige pluripotente stamceller til nyreorganoider blitt utviklet 1,2,3,4,5. Nyreorganoider har gitt et viktig verktøy for å hjelpe forskning på nye regenerative medisintilnærminger, modell nyrerelaterte sykdommer, utføre toksisitetsstudier og terapeutisk legemiddelutvikling. Til tross for deres brede anvendbarhet har nyreorganoider begrensninger som mangel på modning, begrenset langsiktig kulturkapasitet in vitro og en paucity av flere celletyper som finnes i den menneskeligenyren 6,7,8. Nyere arbeid har fokusert på å forbedre nivået av organoid modning, utvide kulturperiodene og utvide kompleksiteten i nyrecellepopulasjoner ved å endre de eksisterende protokollene 9,10,11,12. I denne nåværende gjentakelsen av vår etablerte protokoll 5,13 har vi modifisert mediumkomponentene i første fase av protokollen til et serumfritt basismedium supplert med insulin-transferrin-selenium-etanamin (ITSE), lipider, polyvinylalkohol (E5-ILP) og CHIR99021 (figur 1). Disse endringene gir et fullt definert, serumfritt lavproteinmedium, med færre komponenter enn vår tidligere middels sammensetning 5,13 og uten ekstra vekstfaktorer. Som et resultat er det første fasemediet mindre arbeidskrevende å forberede enn vår tidligere publiserte versjon, og kan redusere variasjonen fra parti til parti5. Tidligere studier har vist at både insulin og transferrin er viktige i serumfri kultur14,15, men høye nivåer av insulin kan være hemmende for mesoderm differensiering16. Vi har opprettholdt de lave insulinnivåene som følger med i den opprinnelige protokollen, og ytterligere reduserte nivåer av KOSR (som inneholder insulin) i andre fase av analysen. I tråd med andre protokoller for nyreorganoiddannelse, er lavere nivåer av KOSR gunstige for å opprettholde en balanse mellom spredning og differensiering av nyrevevet17. I tillegg har vi senket glukosekonsentrasjonen i vårt trinn II medium13.
Vår metode beskriver et oppsett for suspensjonsanalyse av nyreorganoider, noe som gir opptil ~ 1000 organoider fra en innledende ~ 60% konfluent hPSC 100 mm kulturplate som beskrevet i den opprinnelige publikasjonen 5,13. Denne protokollen kan enkelt skaleres opp til å starte med flere 100 mm eller 150 mm plater for å øke organoidtallene ytterligere.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21-985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-adherence rinsing solution</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72054</td>
			<td>10 mM stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;disposable spinner flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-201-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Ultra-Low Attachment 6-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Slow-Speed Stirrers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-495-03</td>
			<td>Multi plate magnetic stirrer for spinner flask culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11054020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14-190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg / Oval Stirring Bars</td>
			<td>2mag</td>
			<td>PI20106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelta General-Purpose Tweezers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-456-103</td>
			<td>Keep sterile in the cell culture hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZBio Single Use Media Bottle, 250mL</td>
			<td>Foxx Life Sciences</td>
			<td>138-3211-FLS</td>
			<td>Used to make PVA 10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes (100 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Sterile Aspirating Pipet 2mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160; Cell Lifters - Cell lifter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Multi Function 3D Rotators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88-861-047</td>
			<td>Orbital shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1413302</td>
			<td>BME. Aliquot on ice and freeze. Another suitable matrix alternative is Matrigel or Cultrex.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td>GCDR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td>L-glutamine supplement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51-500-056</td>
			<td>ITSE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut&#160; Serum Replacement - Multi-Species</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A3181502</td>
			<td>KOSR. Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid Mixture 1, Chemically Defined</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>L0288-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 500mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2GPU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma&#160; Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 250mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2GPU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit</td>
			<td>2mag</td>
			<td>VMF 90250 U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive</td>
			<td>2mag</td>
			<td>VMF 40600</td>
			<td>6MSP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MP Biomedicals&#160; 7X Cleaning Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MP0976670A4</td>
			<td>Tissue culture suitable detergent. Make a 5% solution in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF, and mTeSR Plus medium have also been tested and are suitable alternatives.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50 mL Conical, Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-mpt</td>
			<td>Anti-mycoplasma reagent. Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer&#174; 200 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0776417</td>
			<td>Cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer&#174; 500 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0822591</td>
			<td>Cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol) 87-90% hydrolyzed&#160; (PVA)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P8136-250G</td>
			<td>10% in DPBS stirring at 98 degrees C until disolves, make in 138-3211-FLS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y-27632 (ROCKi)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td>10 mM stock in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Serological Pipets&#160; - 10mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Serological Pipets - 25mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Serological pipette - 5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-12D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeSR-E5</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5916</td>
			<td>Serum-free, low protein base medium for E5-ILP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variomag distriBOX 2 Distributor</td>
			<td>2mag</td>
			<td>VMF 90512</td>
			<td>If you use more than one MIXdrive</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simplified method for generating kidney organoids from human pluripotent stem cells

Nyreorganoider generert fra hPSCer har gitt en ubegrenset kilde til nyrevev. Humane nyreorganoider er et uvurderlig verktøy for å studere nyresykdom og skade, utvikle cellebaserte terapier og teste nye terapeutiske behandlinger. For slike applikasjoner er det nødvendig med et stort antall ensartede organoider og svært reproduserbare analyser. Vi har bygget på vår tidligere publiserte nyreorganoidprotokoll for å forbedre organoidenes generelle helse. Denne enkle, robuste 3D-protokollen innebærer dannelse av ensartede embryoide legemer i minimum komponentmedium som inneholder lipider, insulin-transferrin-selenium-etanamintilskudd og polyvinylalkohol med GSK3-hemmer (CHIR99021) i 3 dager, etterfulgt av kultur i knock-out serumerstatning (KOSR)-inneholdende medium. I tillegg gir agitating analyser mulighet for reduksjon i klumping av embryoide legemer og opprettholde en jevn størrelse, noe som er viktig for å redusere variasjon mellom organoider. Totalt sett gir protokollen en rask, effektiv og kostnadseffektiv metode for å generere store mengder nyreorganoider.

I denne nyeste versjonen av vår protokoll initieres nyreorganoid differensiering i et definert lavproteinmedium. Analysene utføres helt i suspensjon og er avhengige av den medfødte evnen til hPSCs differensiering og organisasjon for initiering av tubulogenesis. En enkelt analyse som stammer fra en 100 mm ~ 60% sammenfallende hPSC kulturplate gir rutinemessig 500-1000 nyreorganoider, som vist i vår forrige publikasjon5. På grunn av så høyt antall organoider generert, er denne protokollen god...

Watch this Scientific Journal Video about A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

Her beskriver vi en protokoll for å generere nyreorganoider fra humane pluripotente stamceller (hPSCer). Denne protokollen genererer nyreorganoider innen to uker. De resulterende nyreorganoidene kan dyrkes i store spinnerflasker eller multi-brønn magnetiske røreplater for parallelle legemiddeltestingsmetoder.

En forenklet metode for å generere nyreorganoider fra humane pluripotente stamceller

Kidney organoids generated from hPSCs have provided an unlimited source of renal tissue. Human kidney organoids are an invaluable tool for studying kidney ...

Denne metoden kan utføres i ethvert laboratorium utstyrt for cellekultureksperimenter. Ved hjelp av denne metoden kan vi fremme vår forståelse av nyreutvikling og sykdomsveier. Dette er en relativt enkel og billig metode sammenlignet med andre for å generere nyreorganoider.Den største utfordringen med denne teknikken er å opprettholde menneskelig pluripotent stamcellekultur av høy kvalitet. Det er viktig at cellene vedlikeholdes med mindre enn 80 % samløp og deles regelmessig. Forskere som er nye i menneskelig pluripotent stamcellekultur, bør gjøre seg kjent med stamcellelinjene før de går videre til differensiering.Begynn nyreorganoidanalysen ved å legge til to milliliter komplette E5-ILP-medium i hver brønn av en seks-brønns ultra-lav festeplate. Kultur menneskelige pluripotente stamceller, eller hPSCer, i 100 millimeter vevskulturbehandlede plater til de når 60% samløp. Vask hPSCene to ganger med omtrent åtte milliliter DPBS.Aspirer DPBS, legg deretter til to milliliter dispase dropwise for å dekke cellene, og inkuber dem i seks minutter ved 37 grader Celsius. Vask cellene tre ganger med ca. 10 milliliter DPBS. Aspirer DPBS, vipp deretter platen med 45 grader, og skrap cellene ned med en celleløfter.Vask koloniene ned fra toppen med seks milliliter komplette E5-ILP-medium ved hjelp av en 10 milliliter serologisk pipette. Deretter holder pipetten vertikalt, bryter opp store kolonier ved forsiktig pipettering opp og ned, pass på at du ikke berører sidene av kulturplaten. Fordel koloniklyngene jevnt ved å legge til en milliliter per brønn i seksbrønnplaten, og plasser deretter platen på en orbital shaker inne i en 37-graders Celsius-inkubator.Alternativt, hvis en orbital shaker ikke er tilgjengelig, kan cellene statisk dyrkes. På dag to, etter å ha latt de embryoide kroppene bosette seg på bunnen av platen, vipp platen med 45 grader, og aspirer mediet sakte fra toppen, og la en milliliter per brønn. Tilsett to milliliter tilberedt komplett medium per brønn, og returner platen tilbake til shakeren.På dag tre, etter å ha aspirert mediet som tidligere demonstrert, samle alle embryoide legemer forsiktig fra hver brønn ved hjelp av en 10 milliliter serologisk pipette, og overfør dem til et 50 milliliter konisk rør. For å samle eventuelle gjenværende embryoide legemer, skyll hver brønn med en milliliter lavglukose DMEM, og legg dem til samme 50 milliliter koniske rør. Mens du venter på at de embryoide kroppene skal bosette seg på bunnen av røret, legg til to milliliter av trinn II medium til hver brønn av seksbrønnsplaten.Deretter sikter du ut store embryoide kropper ved å plassere en 200-mikrometer cellesil på toppen av et nytt 50 milliliter konisk rør og pipetter alle embryoide legemer forsiktig over cellesilen. Skyll cellesilen med ytterligere fem milliliter DMEM for å samle eventuelle embryoide legemer som sitter fast i silen. På senere stadier, bruk først en 500-mikrometer sil for å sile ut svært store embryoide kropper, og send deretter filtratet gjennom en 200-mikrometersil for å sile ut svært små embryoide kropper uten tubuli.Samle riktig størrelse embryoide kropper, mellom 200 og 500 mikrometer, ved å invertere 200-mikrometersilen i et nytt 50 milliliterrør og vaske silen med DPBS. Etter anstrengelse, la de embryoide kroppene slå seg ned til bunnen av det koniske røret, aspirer deretter supernatanten og vask med ca. 10 milliliter DMEM. Deretter resuspenderer de embryoide kroppene i seks milliliter av trinn II-medium.Overfør de embryoide kroppene tilbake til den seks-brønns ultra-lave festeplaten, og fordel dem jevnt blant brønnene. Siden de fleste organoidene samler seg på toppen av pipetten, la omtrent en halv milliliter på slutten, og berør deretter forsiktig spissen til media i hver brønn, slik at organoider kan strømme inn i brønnen. Overfør de embryoide kroppene til en 125 milliliter spinnerflaske med 45 milliliter trinn II-medium.Sett den magnetiske rørehastigheten til 120 o/min, og plasser kolben i inkubatoren. For å mate embryoide kropper eller nyreorganoider, la dem bosette seg kort til bunnen av spinnerflasken, løft deretter lokket fra den ene sidearmen på kolben, og legg den aspirerende pipetten inni med spissen som berører motsatt innvendig vegg. Vinkle pipetten langsomt ned, og aspirer omtrent halvparten av mediet.Fyll på med 20 milliliter friskt Stage II-medium ved å pipette det gjennom samme åpning. Bruk lange sterile tang for å forsiktig plassere en magnetisk rørestang i hver brønn på en seksbrønnsplate med embryoide kropper eller nyreorganoider. Plasser platen på den magnetiske røreplaten med seks hjul, og sett hastigheten til 120 o/min.For at de magnetiske rørestengene skal komme på plass og begynne å spinne, må du først sette effektnivået til 100. Når alle stolpene begynner å spinne, bringer du kraftnivået ned til 25. Opprettholde nyre organoider ved å endre halvparten av mediet som tidligere demonstrert.Immunfluorescence av paraffin seksjoner av dag 14 nyre organoider viser tilstedeværelse av nephron segmenter som nyre tubules uttrykker hepatocyte kjernefysisk faktor-1 beta og Lotus tetragonolobus lectin, samt podocyte klynger som uttrykker V-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog B og nephrin. Modifikasjonene i denne protokollen kan støtte utvidelse av endotelceller, som bekreftet ved farging med blodplater og endotelcelleadhesjonsmolekyl-1 på dag 26 av kulturen. Humane pluripotente stamceller må behandles med Dispase i riktig tid, deretter grundig vasket for å fjerne alle spor.Hvis Dispase ikke er helt fjernet, kan det føre til celledød og klynge av embryoide kropper. Denne metoden har hjulpet oss med å undersøke utviklingen av medfødte nyresykdommer, samt ulike nyreskadeveier og potensial for terapeutiske intervensjoner in vitro.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-fri Utledning av Melanocytter fra Menneskelig Pluripotent stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Definert og Scalable Generation of hepatocytter lignende celler fra menneskelige Pluripotent stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Rask, rettet differensiering av netthinnens Pigment epitelceller fra menneskelige embryonale eller indusert Pluripotent stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generasjon av standardiserte og reproduserbar Forebrain-type Cerebral Organoids fra menneske indusert Pluripotent stamceller

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Effektiv differensiering av Human Pluripotent stamceller i leverceller

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro generasjon av Somite derivater fra menneske indusert stamceller Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

En statisk selvrettet metode for å generere hjerneorganoider fra humane embryonale stamceller

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

In vitro Neuromuscular Junction Induced from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In vitro neuromuskulært veikryss indusert fra humane induserte pluripotente stamceller

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized synapse that transmits action potentials from the motor neuron to skeletal muscle for mechanical ...

Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Rettet differensiering av hemogene endotelceller fra humane pluripotente stamceller

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial ...