Name: a simplified method for generating kidney organoids from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-04-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Esta pesquisa foi financiada pelos Institutos Nacionais de Saúde R01 DK069403, UC2 DK126122 e P30-DK079307 e asan Foundation for Kidney Research Ben J. Lipps Research Fellowship Program to AP.

Todos os experimentos utilizando hPSCs foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, e foram realizados em uma capa de biossegurança classe II com equipamentos de proteção individual adequados. Todos os reagentes são de grau de cultura celular, a menos que seja dito o contrário. Todas as culturas são incubadas a 37 °C, 5% de atmosfera de ar CO2 . Em todas as etapas do ensaio, corpos embrionários ou organoides renais podem ser coletados e fixados ou preparados para análise. As linh...

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	<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids.">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communications. 6, 8715 (2015).</li><li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury.">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li><li>Taguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+in+vivo+origin+of+metanephric+nephron+progenitors+enables+generation+of+complex+kidney+structures+from+pluripotent+stem+cells.">Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2013).</li><li>Przepiorski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+bioreactor-based+method+to+generate+kidney+organoids+from+pluripotent+stem+cells.">A simple bioreactor-based method to generate kidney organoids from pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 11 (2), 470-484 (2018).</li><li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids.">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communication. 6, 8715 (2015).</li><li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury.">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Taguchi, A., Nishinakamura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-order+kidney+organogenesis+from+pluripotent+stem+cells.">Higher-order kidney organogenesis from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).</li><li>Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+organoids+with+improved+collecting+duct+maturation+and+injury+modeling.">Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling.</a> Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).</li><li>Howden, S. E., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+using+defined+conditions.">Generating kidney organoids from human pluripotent stem cells using defined conditions.</a> Methods in Molecular Biology. 2155, 183-192 (2020).</li><li>Tanigawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin+is+superior+to+BMP7+for+efficient+maintenance+of+human+iPSC-derived+nephron+progenitors.">Activin is superior to BMP7 for efficient maintenance of human iPSC-derived nephron progenitors.</a> Stem Cell Reports. 13 (2), 322-337 (2019).</li><li>Sander, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+large-scale+production+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Protocol for large-scale production of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100150 (2020).</li><li>Ekblom, P., Thesleff, I., Miettinen, A., Saxen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+defined+medium+supplemented+with+transferrin.">Organogenesis in a defined medium supplemented with transferrin.</a> Cell Differentiation. 10 (5), 281-288 (1981).</li><li>Thesleff, I., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+transferrin+in+branching+morphogenesis,+growth+and+differentiation+of+the+embryonic+kidney.">Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 82, 147-161 (1984).</li><li>Freund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+redirects+differentiation+from+cardiogenic+mesoderm+and+endoderm+to+neuroectoderm+in+differentiating+human+embryonic+stem+cells.">Insulin redirects differentiation from cardiogenic mesoderm and endoderm to neuroectoderm in differentiating human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26 (3), 724-733 (2008).</li><li>Nishikawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimal+serum-free+defined+condition+for+in+vitro+culture+of+kidney+organoids.">An optimal serum-free defined condition for in vitro culture of kidney organoids.</a> Biochemistry and Biophysics Research Communication. 501 (4), 996-1002 (2018).</li><li>Oh, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+New+Zealand+donors.">Derivation of induced pluripotent stem cell lines from New Zealand donors.</a> Journal of the Royal Society of New Zealand. , 1-14 (2020).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney.">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2013).</li><li>Lam, A. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intermediate+mesoderm+that+forms+tubules+expressing+kidney+proximal+tubular+markers.">Rapid and efficient differentiation of human pluripotent stem cells into intermediate mesoderm that forms tubules expressing kidney proximal tubular markers.</a> Journal of American Society of Nephrology. 25 (6), 1211-1225 (2014).</li><li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+embryoid+body+microenvironment+to+direct+embryonic+stem+cell+differentiation.">Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation.</a> Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).</li><li>Imasawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+repatterns+human+podocyte+energy+metabolism+during+differentiation+and+diabetic+nephropathy.">High glucose repatterns human podocyte energy metabolism during differentiation and diabetic nephropathy.</a> FASEB Journal. 31 (1), 294-307 (2017).</li><li>Kim, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+condition+induces+autophagy+in+endothelial+progenitor+cells+contributing+to+angiogenic+impairment.">High glucose condition induces autophagy in endothelial progenitor cells contributing to angiogenic impairment.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (7), 1248-1252 (2014).</li><li>Piwkowska, A., Rogacka, D., Audzeyenka, I., Jankowski, M., Angielski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+concentration+affects+the+oxidant-antioxidant+balance+in+cultured+mouse+podocytes.">High glucose concentration affects the oxidant-antioxidant balance in cultured mouse podocytes.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 112 (6), 1661-1672 (2011).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+and+refinement+of+human+PSC-derived+kidney+organoid+differentiation+with+single-cell+transcriptomics.">Comparative analysis and refinement of human PSC-derived kidney organoid differentiation with single-cell transcriptomics.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 869-881 (2018).</li><li>Lei, X., Deng, Z., Duan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniform+embryoid+body+production+and+enhanced+mesendoderm+differentiation+with+murine+embryonic+stem+cells+in+a+rotary+suspension+bioreactor.">Uniform embryoid body production and enhanced mesendoderm differentiation with murine embryonic stem cells in a rotary suspension bioreactor.</a> Methods in Molecular Biology. , (2016).</li></ol>

Estudos anteriores mostraram que as etapas iniciais do protocolo são fundamentais para a diferenciação intermediária do mesoderm 5,19,20 e, portanto, é essencial implementar uma rigorosa composição média nesta fase. Remover componentes indefinidos como soro, albumina, híbridomoico livre de proteínas II do primeiro estágio do protocolo pode ajudar a melhorar a eficiência de diferenciação consistente entre os ensaios...

Nos últimos anos, uma série de protocolos para diferenciar células-tronco pluripotentes humanas em organoides renais foram desenvolvidos 1,2,3,4,5. Os organoides renais forneceram uma importante ferramenta para auxiliar a pesquisa em novas abordagens de medicina regenerativa, doenças relacionadas ao rim, realizar estudos de toxicidade e desenvolvimento de medicamentos terapêuticos. Apesar de sua ampla aplicabilidade, os organoides renais têm limitações como falta de maturação, capacidade de cultura limitada a longo prazo in vitro e uma escassez de vários tipos de células encontrados no rim humano 6,7,8. Trabalhos recentes têm focado na melhoria do nível de maturação organoide, ampliando os períodos culturais e ampliando a complexidade das populações de células renais, modificando os protocolos existentes 9,10,11,12. Nesta atual iteração do nosso protocolo estabelecido 5,13, modificamos os componentes médios na primeira etapa do protocolo para uma base sem soro complementada com insulina-transferrina-selênio-etanolamina (ITSE), lipídios, álcool polivinyl (E5-ILP) e CHIR99021 (Figura 1). Essas mudanças fornecem um meio de baixa proteína totalmente definido, sem soro, com menos componentes do que a nossa composição média anterior 5,13 e sem fatores adicionais de crescimento. Como resultado, o meio da primeira etapa é menos trabalhoso para preparar do que a nossa versão anteriormente publicada, e pode reduzir a variabilidade em lote paralote 5. Estudos anteriores mostraram que tanto a insulina quanto a transferrina são importantes na cultura livre de soro14,15, no entanto, altos níveis de insulina podem ser inibidores para a diferenciação de mesoderm16. Mantivemos os baixos níveis de insulina conforme previsto no protocolo original, e reduzimos ainda mais os níveis de KOSR (contendo insulina) no segundo estágio do ensaio. De acordo com outros protocolos para formação organoide renal, níveis mais baixos de KOSR são benéficos para manter um equilíbrio entre a proliferação e a diferenciação do tecido renal17. Além disso, reduzimos a concentração de glicose em nosso estágio II médio13.
Nosso método descreve uma configuração para ensaio de suspensão de organoides renais, produzindo até ~1.000 organoides de uma placa de cultura hPSC 100 mm confluente inicial de ~60% conforme descrito na publicação original 5,13. Este protocolo pode ser facilmente dimensionado até começar com várias placas de 100 mm ou 150 mm para aumentar ainda mais o número de organoides.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21-985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-adherence rinsing solution</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72054</td>
			<td>10 mM stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;disposable spinner flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-201-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Ultra-Low Attachment 6-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Slow-Speed Stirrers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-495-03</td>
			<td>Multi plate magnetic stirrer for spinner flask culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11054020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14-190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg / Oval Stirring Bars</td>
			<td>2mag</td>
			<td>PI20106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelta General-Purpose Tweezers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-456-103</td>
			<td>Keep sterile in the cell culture hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZBio Single Use Media Bottle, 250mL</td>
			<td>Foxx Life Sciences</td>
			<td>138-3211-FLS</td>
			<td>Used to make PVA 10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes (100 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Sterile Aspirating Pipet 2mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160; Cell Lifters - Cell lifter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Multi Function 3D Rotators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88-861-047</td>
			<td>Orbital shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1413302</td>
			<td>BME. Aliquot on ice and freeze. Another suitable matrix alternative is Matrigel or Cultrex.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td>GCDR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td>L-glutamine supplement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51-500-056</td>
			<td>ITSE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut&#160; Serum Replacement - Multi-Species</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A3181502</td>
			<td>KOSR. Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid Mixture 1, Chemically Defined</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>L0288-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 500mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2GPU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma&#160; Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 250mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2GPU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit</td>
			<td>2mag</td>
			<td>VMF 90250 U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive</td>
			<td>2mag</td>
			<td>VMF 40600</td>
			<td>6MSP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MP Biomedicals&#160; 7X Cleaning Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MP0976670A4</td>
			<td>Tissue culture suitable detergent. Make a 5% solution in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF, and mTeSR Plus medium have also been tested and are suitable alternatives.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50 mL Conical, Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-mpt</td>
			<td>Anti-mycoplasma reagent. Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer&#174; 200 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0776417</td>
			<td>Cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer&#174; 500 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0822591</td>
			<td>Cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol) 87-90% hydrolyzed&#160; (PVA)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P8136-250G</td>
			<td>10% in DPBS stirring at 98 degrees C until disolves, make in 138-3211-FLS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y-27632 (ROCKi)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td>10 mM stock in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Serological Pipets&#160; - 10mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Serological Pipets - 25mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Serological pipette - 5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-12D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeSR-E5</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5916</td>
			<td>Serum-free, low protein base medium for E5-ILP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variomag distriBOX 2 Distributor</td>
			<td>2mag</td>
			<td>VMF 90512</td>
			<td>If you use more than one MIXdrive</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simplified method for generating kidney organoids from human pluripotent stem cells

Organoides renais gerados a partir de hPSCs forneceram uma fonte ilimitada de tecido renal. Os organoides renais humanos são uma ferramenta inestimável para estudar doenças e lesões renais, desenvolver terapias baseadas em células e testar novas terapêuticas. Para tais aplicações, um grande número de organoides uniformes e ensaios altamente reprodutíveis são necessários. Nós construímos nosso protocolo organoide renal publicado anteriormente para melhorar a saúde geral dos organoides. Este protocolo 3D simples e robusto envolve a formação de corpos embrióides uniformes em meio de componente mínimo contendo lipídios, suplemento de insulina-transferrina-selênio-etanolamina e álcool polivinyl com inibidor GSK3 (CHIR99021) por 3 dias, seguido pela cultura em meio contendo soro de reposição de soro de knock-out (KOSR). Além disso, ensaios agitados permitem a redução da aglomeração dos corpos embrionários e a manutenção de um tamanho uniforme, importante para reduzir a variabilidade entre organoides. No geral, o protocolo fornece um método rápido, eficiente e econômico para gerar grandes quantidades de organoides renais.

Nesta versão mais recente do nosso protocolo, a diferenciação organoide renal é iniciada em um meio de proteína definido e baixo. Os ensaios são realizados inteiramente em suspensão e contam com a capacidade inata de diferenciação e organização dos HPSCs para o início da tubulogênese. Um único ensaio originário de uma placa de cultura hPSC de 100 mm ~60% confluente produz rotineiramente 500-1.000 organoides renais, como mostrado em nossa publicação anterior5. Devido a um número t...

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A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

Aqui descrevemos um protocolo para gerar organoides renais a partir de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs). Este protocolo gera organoides renais dentro de duas semanas. Os organoides renais resultantes podem ser cultivados em frascos rotadores em larga escala ou placas de agitação magnética multi-bem para abordagens paralelas de teste de drogas.

Um método simplificado para gerar organoides renais a partir de células-tronco pluripotentes humanas

Kidney organoids generated from hPSCs have provided an unlimited source of renal tissue. Human kidney organoids are an invaluable tool for studying kidney ...

Este método pode ser realizado em qualquer laboratório equipado para experimentos de cultura celular. Usando este método, podemos aprofundar nossa compreensão do desenvolvimento renal e caminhos da doença. Este é um método relativamente simples e barato comparado com outros para gerar organoides renais.O maior desafio dessa técnica é manter a cultura de células-tronco pluripotentes humanas de alta qualidade. É fundamental que as células sejam mantidas com menos de 80% de confluência e divididas regularmente. Pesquisadores novos na cultura de células-tronco pluripotentes humanos devem se familiarizar com as linhas de células-tronco antes de proceder à diferenciação.Inicie o ensaio organoide renal adicionando dois mililitros de meio E5-ILP completo em cada poço de uma placa de fixação ultra-baixa de seis poços. Cultura células-tronco pluripotentes humanas, ou hPSCs, em placas tratadas com cultura tecidual de 100 milímetros até atingirem 60% de confluência. Lave os hPSCs duas vezes com aproximadamente oito mililitros de DPBS.Aspire o DPBS, em seguida, adicione dois mililitros de Dispase dropwise para cobrir as células, e incuba-los por seis minutos a 37 graus Celsius. Lave as células três vezes com aproximadamente 10 mililitros de DPBS. Aspire o DPBS, depois incline a placa em 45 graus, e raspe as células com um levantador de células.Lave as colônias do topo com seis mililitros de meio E5-ILP completo usando uma pipeta sorológica de 10 mililitros. Em seguida, segurando a pipeta verticalmente, quebrar grandes colônias, gentilmente pipetting para cima e para baixo, tomando cuidado para não tocar os lados da placa de cultura. Distribua os aglomerados da colônia uniformemente adicionando um mililitro por poço na placa de seis poços, em seguida, coloque a placa em um agitador orbital dentro de uma incubadora Celsius de 37 graus.Alternativamente, se um agitador orbital não estiver disponível, as células podem ser cultivadas estaticamente. No segundo dia, depois de deixar os corpos embrionários se instalarem na parte inferior da placa, incline a placa em 45 graus e aspire o meio lentamente a partir do topo, deixando um mililitro por poço. Adicione dois mililitros de meio completo preparado por poço, e devolva a placa de volta ao agitador.No terceiro dia, depois de aspirar o meio como demonstrado anteriormente, colete todos os corpos embrionários cuidadosamente de cada poço usando uma pipeta sorológica de 10 mililitros, e transfira-os para um tubo cônico de 50 mililitros. Para coletar quaisquer corpos embrióides restantes, enxágue cada poço com um mililitro de DMEM de baixa glicose, e adicione-os ao mesmo tubo cônico de 50 mililitros. Enquanto espera que os corpos embrionários se instalem na parte inferior do tubo, adicione dois mililitros de meio estágio II a cada poço da placa de seis poços.Em seguida, peneirar grandes corpos embrióides colocando um coador de células de 200 micrômetros em cima de um novo tubo cônico de 50 mililitros e tubosto todos os corpos embrióides cuidadosamente sobre o coador celular. Enxágüe o coador celular com mais cinco mililitros de DMEM para coletar quaisquer corpos embrionários presos no coador. Em estágios posteriores, primeiro use um coador de 500 micrômetros para peneirar corpos embrionários muito grandes, em seguida, passar o filtrado através de um filtro de 200 micrômetros para peneirar corpos embrióides muito pequenos sem túbulos.Colete o tamanho correto de corpos embrionários, entre 200 e 500 micrômetros, invertendo o filtro de 200 micrômetros em um novo tubo de 50 mililitros e lavando o coador com DPBS. Após o esforço, permita que os corpos embrionários se acomodem no fundo do tubo cônico, depois aspirem o sobrenante e lavem com aproximadamente 10 mililitros de DMEM. Em seguida, resuspende os corpos embrióides em seis mililitros do estágio II médio.Transfira os corpos embrionários de volta para a placa de fixação ultra-baixa de seis poços, distribuindo-os uniformemente entre os poços. Como a maioria dos organoides coletam na parte superior da pipeta, deixe aproximadamente meio mililitro no final, em seguida, toque suavemente a ponta para a mídia em cada poço, permitindo que organoides fluam para dentro do poço. Transfira os corpos embrionários para um frasco rotador de 125 mililitros com 45 mililitros do meio estágio II.Coloque a velocidade de agitação magnética a 120 rpm e coloque o frasco na incubadora. Para alimentar os corpos embrionários ou organoides renais, deixe-os se acomodar brevemente no fundo do frasco rotador, em seguida, levante a tampa de um braço lateral do frasco, e coloque a pipeta aspirante dentro com a ponta tocando a parede interna oposta. Angule lentamente a pipeta para baixo e aspire aproximadamente metade do meio.Reabasteca com 20 mililitros de meio fresco estágio II, pipetando-o através da mesma abertura. Use longas fórceps estéreis para colocar cuidadosamente uma barra de agitação magnética em cada poço de uma placa de seis poços com corpos embrionários ou organoides renais. Coloque a placa na placa de agitação magnética de seis rodas e coloque a velocidade a 120 rpm.Para que as barras de agitação magnética se posicionem e comecem a girar, primeiro defina o nível de potência para 100. Uma vez que todas as barras comecem a girar, abaixe o nível de energia para 25. Mantenha os organoides renais alterando metade do meio como demonstrado anteriormente.A imunofluorescência de seções de parafina do dia 14 organoides renais mostram presença de segmentos de nefron, como túbulos renais expressando fator nuclear hepatocítico-1 beta e lectina de tetragonolobus lotus, bem como aglomerados podocyte expressando V-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma onco homogenelog B e nephrin. As modificações neste protocolo podem apoiar a expansão das células endoteliais, confirmadas pela coloração com plaqueta e molécula de adesão celular endotelial-1 no dia 26 da cultura. As células-tronco pluripotentes humanas precisam ser tratadas com dispase pelo tempo adequado e, em seguida, completamente lavadas para remover todos os vestígios.Se a despase não for completamente removida, pode levar à morte celular e agrupamento de corpos embrionários. Este método nos ajudou a examinar o desenvolvimento de doenças renais congênitas, bem como várias vias de lesão renal e potencial para intervenções terapêuticas in vitro.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Derivação sem alimentador de melanócitos a partir de células-tronco pluripotentes humanas

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Biologia do Desenvolvimento

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Definido e Geração de Scalable de células de hepatócitos-like de células-tronco pluripotentes humanas

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Rápida, dirigida a diferenciação de células epiteliais de pigmento Retinal de células-tronco humanas embrionárias ou induzida de Pluripotent

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Geração de padronizada e reprodutível Forebrain-tipo Organoids Cerebral de humanos induzida por células-tronco pluripotentes

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Diferenciação eficiente de células-tronco pluripotentes humanas em células hepáticas

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Na geração de Vitro do Somite derivados de humanos induzida por células tronco pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

Um método estática auto-direcionado para gerar organoides cerebrais a partir de células-tronco embrionárias humanas

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

In vitro Neuromuscular Junction Induced from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Junção neuromuscular in vitro induzida de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized synapse that transmits action potentials from the motor neuron to skeletal muscle for mechanical ...

Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Diferenciação Dirigida de Células Endoteliais Hemogênicas de Células-Tronco Pluripotentes Humanas

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial ...