Name: a simplified method for generating kidney organoids from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-04-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Это исследование финансировалось Национальными институтами здравоохранения R01 DK069403, UC2 DK126122 и P30-DK079307 и ASN Foundation for Kidney Research Fellowship Program to AP.

Все эксперименты с использованием гПСК проводились в соответствии с институциональными руководящими принципами и проводились в капюшоне биобезопасности класса II с соответствующими средствами индивидуальной защиты. Все реагенты относятся к клеточной культуре, если не указано иное. ?...

<ol>
	<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids.">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communications. 6, 8715 (2015).</li><li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury.">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li><li>Taguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+in+vivo+origin+of+metanephric+nephron+progenitors+enables+generation+of+complex+kidney+structures+from+pluripotent+stem+cells.">Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2013).</li><li>Przepiorski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+bioreactor-based+method+to+generate+kidney+organoids+from+pluripotent+stem+cells.">A simple bioreactor-based method to generate kidney organoids from pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 11 (2), 470-484 (2018).</li><li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids.">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communication. 6, 8715 (2015).</li><li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury.">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Taguchi, A., Nishinakamura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-order+kidney+organogenesis+from+pluripotent+stem+cells.">Higher-order kidney organogenesis from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).</li><li>Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+organoids+with+improved+collecting+duct+maturation+and+injury+modeling.">Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling.</a> Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).</li><li>Howden, S. E., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+using+defined+conditions.">Generating kidney organoids from human pluripotent stem cells using defined conditions.</a> Methods in Molecular Biology. 2155, 183-192 (2020).</li><li>Tanigawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin+is+superior+to+BMP7+for+efficient+maintenance+of+human+iPSC-derived+nephron+progenitors.">Activin is superior to BMP7 for efficient maintenance of human iPSC-derived nephron progenitors.</a> Stem Cell Reports. 13 (2), 322-337 (2019).</li><li>Sander, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+large-scale+production+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Protocol for large-scale production of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100150 (2020).</li><li>Ekblom, P., Thesleff, I., Miettinen, A., Saxen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+defined+medium+supplemented+with+transferrin.">Organogenesis in a defined medium supplemented with transferrin.</a> Cell Differentiation. 10 (5), 281-288 (1981).</li><li>Thesleff, I., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+transferrin+in+branching+morphogenesis,+growth+and+differentiation+of+the+embryonic+kidney.">Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 82, 147-161 (1984).</li><li>Freund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+redirects+differentiation+from+cardiogenic+mesoderm+and+endoderm+to+neuroectoderm+in+differentiating+human+embryonic+stem+cells.">Insulin redirects differentiation from cardiogenic mesoderm and endoderm to neuroectoderm in differentiating human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26 (3), 724-733 (2008).</li><li>Nishikawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimal+serum-free+defined+condition+for+in+vitro+culture+of+kidney+organoids.">An optimal serum-free defined condition for in vitro culture of kidney organoids.</a> Biochemistry and Biophysics Research Communication. 501 (4), 996-1002 (2018).</li><li>Oh, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+New+Zealand+donors.">Derivation of induced pluripotent stem cell lines from New Zealand donors.</a> Journal of the Royal Society of New Zealand. , 1-14 (2020).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney.">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2013).</li><li>Lam, A. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intermediate+mesoderm+that+forms+tubules+expressing+kidney+proximal+tubular+markers.">Rapid and efficient differentiation of human pluripotent stem cells into intermediate mesoderm that forms tubules expressing kidney proximal tubular markers.</a> Journal of American Society of Nephrology. 25 (6), 1211-1225 (2014).</li><li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+embryoid+body+microenvironment+to+direct+embryonic+stem+cell+differentiation.">Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation.</a> Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).</li><li>Imasawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+repatterns+human+podocyte+energy+metabolism+during+differentiation+and+diabetic+nephropathy.">High glucose repatterns human podocyte energy metabolism during differentiation and diabetic nephropathy.</a> FASEB Journal. 31 (1), 294-307 (2017).</li><li>Kim, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+condition+induces+autophagy+in+endothelial+progenitor+cells+contributing+to+angiogenic+impairment.">High glucose condition induces autophagy in endothelial progenitor cells contributing to angiogenic impairment.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (7), 1248-1252 (2014).</li><li>Piwkowska, A., Rogacka, D., Audzeyenka, I., Jankowski, M., Angielski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+concentration+affects+the+oxidant-antioxidant+balance+in+cultured+mouse+podocytes.">High glucose concentration affects the oxidant-antioxidant balance in cultured mouse podocytes.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 112 (6), 1661-1672 (2011).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+and+refinement+of+human+PSC-derived+kidney+organoid+differentiation+with+single-cell+transcriptomics.">Comparative analysis and refinement of human PSC-derived kidney organoid differentiation with single-cell transcriptomics.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 869-881 (2018).</li><li>Lei, X., Deng, Z., Duan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniform+embryoid+body+production+and+enhanced+mesendoderm+differentiation+with+murine+embryonic+stem+cells+in+a+rotary+suspension+bioreactor.">Uniform embryoid body production and enhanced mesendoderm differentiation with murine embryonic stem cells in a rotary suspension bioreactor.</a> Methods in Molecular Biology. , (2016).</li></ol>

Предыдущие исследования показали, что начальные этапы протокола имеют решающее значение для промежуточной дифференциации мезодермы 5,19,20 и, следовательно, на этом этапе необходимо реализовать строгий состав среды. Удаление неопредел?...

В последние годы разработан ряд протоколов дифференциации плюрипотентных стволовых клеток человека в органоиды почек 1,2,3,4,5. Почечные органоиды предоставили важный инструмент для содействия исследованиям новых подходов к регенеративной медицине, моделированию заболеваний, связанных с почками, проведению исследований токсичности и разработке терапевтических препаратов. Несмотря на их широкую применимость, почечные органоиды имеют такие ограничения, как отсутствие созревания, ограниченная долгосрочная культуральная способность in vitro и нехватка нескольких типов клеток, обнаруженных в почках человека 6,7,8. Недавняя работа была сосредоточена на улучшении уровня созревания органоидов, продлении периодов культивирования и расширении сложности популяций клеток почек путем изменения существующих протоколов 9,10,11,12. В данной итерации нашего установленного протокола 5,13 мы модифицировали компоненты среды на первом этапе протокола в безсывороточную базовую среду, дополненную инсулин-трансферрин-селен-этаноламин (ITSE), липидами, поливиниловым спиртом (E5-ILP) и CHIR99021 (рисунок 1). Эти изменения обеспечивают полностью определенную, не содержащую сыворотки, низкобелковую среду, с меньшим количеством компонентов, чем наша предыдущая средняя композиция 5,13 и без дополнительных факторов роста. В результате, среда первой ступени является менее трудоемкой в приготовлении, чем наша ранее опубликованная версия, и может снизить изменчивость от партии к партии5. Предыдущие исследования показали, что как инсулин, так и трансферрин важны в безсыворочной культуре14,15, однако высокие уровни инсулина могут быть ингибирующими дифференцировку мезодермы16. Мы сохранили низкий уровень инсулина, как это предусмотрено в первоначальном протоколе, и еще больше снизили уровни KOSR (содержащего инсулин) на втором этапе анализа. В соответствии с другими протоколами образования органоидов почек, более низкие уровни KOSR полезны для поддержания баланса между пролиферацией и дифференцировкойпочечной ткани 17. Кроме того, мы снизили концентрацию глюкозы в нашей среде стадии II13.
Наш метод описывает установку для суспензионного анализа почечных органоидов, получая до ~1000 органоидов из исходной ~60% сливающейся hPSC 100 мм культуральной пластины, как описано в оригинальной публикации 5,13. Этот протокол может быть легко масштабирован до начала с нескольких пластин 100 мм или 150 мм для дальнейшего увеличения числа органоидов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21-985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-adherence rinsing solution</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72054</td>
			<td>10 mM stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;disposable spinner flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-201-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Ultra-Low Attachment 6-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Slow-Speed Stirrers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-495-03</td>
			<td>Multi plate magnetic stirrer for spinner flask culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11054020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14-190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg / Oval Stirring Bars</td>
			<td>2mag</td>
			<td>PI20106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelta General-Purpose Tweezers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-456-103</td>
			<td>Keep sterile in the cell culture hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZBio Single Use Media Bottle, 250mL</td>
			<td>Foxx Life Sciences</td>
			<td>138-3211-FLS</td>
			<td>Used to make PVA 10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes (100 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Sterile Aspirating Pipet 2mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160; Cell Lifters - Cell lifter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Multi Function 3D Rotators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88-861-047</td>
			<td>Orbital shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1413302</td>
			<td>BME. Aliquot on ice and freeze. Another suitable matrix alternative is Matrigel or Cultrex.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td>GCDR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td>L-glutamine supplement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51-500-056</td>
			<td>ITSE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut&#160; Serum Replacement - Multi-Species</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A3181502</td>
			<td>KOSR. Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid Mixture 1, Chemically Defined</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>L0288-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 500mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2GPU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma&#160; Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 250mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2GPU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit</td>
			<td>2mag</td>
			<td>VMF 90250 U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive</td>
			<td>2mag</td>
			<td>VMF 40600</td>
			<td>6MSP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MP Biomedicals&#160; 7X Cleaning Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MP0976670A4</td>
			<td>Tissue culture suitable detergent. Make a 5% solution in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF, and mTeSR Plus medium have also been tested and are suitable alternatives.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50 mL Conical, Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-mpt</td>
			<td>Anti-mycoplasma reagent. Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer&#174; 200 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0776417</td>
			<td>Cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer&#174; 500 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0822591</td>
			<td>Cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol) 87-90% hydrolyzed&#160; (PVA)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P8136-250G</td>
			<td>10% in DPBS stirring at 98 degrees C until disolves, make in 138-3211-FLS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y-27632 (ROCKi)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td>10 mM stock in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Serological Pipets&#160; - 10mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Serological Pipets - 25mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Serological pipette - 5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-12D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeSR-E5</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5916</td>
			<td>Serum-free, low protein base medium for E5-ILP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variomag distriBOX 2 Distributor</td>
			<td>2mag</td>
			<td>VMF 90512</td>
			<td>If you use more than one MIXdrive</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simplified method for generating kidney organoids from human pluripotent stem cells

Почечные органоиды, полученные из hPSCs, обеспечили неограниченный источник почечной ткани. Органоиды почек человека являются бесценным инструментом для изучения заболеваний и повреждений почек, разработки клеточной терапии и тестирования новых терапевтических средств. Для таких применений необходимо большое количество однородных органоидов и высоковоспроизводимых анализов. Мы опираемся на наш ранее опубликованный протокол органоидов почек для улучшения общего состояния здоровья органоидов. Этот простой, надежный 3D-протокол включает в себя формирование однородных эмбриоидных тел в минимальной компонентной среде, содержащей липиды, добавку инсулин-трансферрин-селен-этаноламин и поливиниловый спирт с ингибитором GSK3 (CHIR99021) в течение 3 дней с последующей культивированием в нокаутирующей сывороточной замещающей среде (KOSR). Кроме того, агитационные анализы позволяют уменьшить слипание эмбриоидных тел и сохранить однородный размер, что важно для снижения изменчивости между органоидами. В целом, протокол обеспечивает быстрый, эффективный и экономически эффективный метод генерации большого количества почечных органоидов.

В этой последней версии нашего протокола дифференциация органоидов почек инициируется в определенной среде с низким содержанием белка. Анализы выполняются полностью в суспензии и основаны на врожденной способности дифференцировки и организации hPSCs для инициирования тубулогенеза. О?...

Watch this Scientific Journal Video about A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

Здесь мы описываем протокол генерации почечных органоидов из плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSCs). Этот протокол генерирует почечные органоиды в течение двух недель. Полученные органоиды почек могут быть культивированы в крупномасштабных колбах спиннера или многолуночных магнитных пластинах перемешивания для параллельных подходов к тестированию лекарств.

Упрощенный метод получения органоидов почек из плюрипотентных стволовых клеток человека

Kidney organoids generated from hPSCs have provided an unlimited source of renal tissue. Human kidney organoids are an invaluable tool for studying kidney ...

Этот метод может быть выполнен в любой лаборатории, оборудованной для экспериментов с клеточными культурами. Используя этот метод, мы можем углубить наше понимание развития почек и путей заболевания. Это относительно простой и недорогой метод по сравнению с другими для получения почечных органоидов.Самой большой проблемой этого метода является поддержание высококачественной культуры плюрипотентных стволовых клеток человека. Очень важно, чтобы клетки поддерживались на уровне слияния менее 80% и регулярно расщеплялись. Исследователи, новички в культуре плюрипотентных стволовых клеток человека, должны ознакомиться с линиями стволовых клеток, прежде чем приступать к дифференцировке.Начните анализ органоидов почек, добавив два миллилитра полной среды E5-ILP в каждую лунку шестилуночной сверхнизкой пластины прикрепления. Культивируйте человеческие плюрипотентные стволовые клетки, или hPSCs, в 100-миллиметровые пластины, обработанные культурой тканей, пока они не достигнут 60% слияния. Дважды промыть гПСК примерно восемью миллилитрами DPBS.Аспирируйте DPBS, затем добавьте два миллилитра Dispase по каплям, чтобы покрыть клетки, и инкубируйте их в течение шести минут при 37 градусах Цельсия. Промыть клетки три раза примерно 10 миллилитрами DPBS. Аспирируйте DPBS, затем наклоните пластину на 45 градусов и соскоблите ячейки вниз с помощью подъемника ячеек.Промыть колонии сверху шестью миллилитрами полной среды E5-ILP с помощью 10-миллилитровой серологической пипетки. Затем, удерживая пипетку вертикально, разбейте большие колонии, осторожно пипетируя вверх и вниз, следя за тем, чтобы не коснуться сторон культуральной пластины. Распределите кластеры колоний равномерно, добавив один миллилитр на лунку в шестилуночную пластину, а затем поместите пластину на орбитальный шейкер внутри инкубатора с температурой 37 градусов Цельсия.Альтернативно, если орбитальный шейкер недоступен, клетки могут быть статически культивированы. На второй день, позволив эмбриоидным телам осесть в нижней части пластины, наклоните пластину на 45 градусов и медленно аспирируйте среду сверху, оставляя один миллилитр на лунку. Добавьте два миллилитра подготовленной полной среды на лунку и верните тарелку обратно в шейкер.На третий день, после аспирации среды, как было показано ранее, тщательно соберите все эмбриональные тела из каждой лунки, используя 10-миллилитровую серологическую пипетку, и перенесите их в 50-миллилитровую коническую трубку. Чтобы собрать все оставшиеся эмбриоидные тела, промыть каждую лунку одним миллилитром низкоглюкообразного ДМЭМ и добавить их в ту же 50-миллилитровую коническую трубку. Ожидая, пока эмбриоидные тела осядут на дне трубки, добавьте два миллилитра среды II стадии к каждой лунке шестилуночной пластины.Затем просеивайте большие эмбриоидные тела, помещая 200-микрометровый клеточный сеток поверх новой 50-миллилитровой конической трубки и тщательно пипетируя все эмбриоидные тела над клеточным сетчатым фильтром. Промыть клеточный ситечко дополнительными пятью миллилитрами DMEM, чтобы собрать любые эмбриональные тела, застрявшие в ситечке. На более поздних стадиях сначала используйте 500-микрометровый сетчатый фильтр для отслаивания очень больших эмбриональных тел, затем пропустите фильтрат через 200-микрометровое ситечко, чтобы отсеять очень маленькие эмбриональные тела без канальцев.Соберите эмбриональные тела правильного размера, от 200 до 500 микрометров, путем инвертирования 200-микрометрового сетчатого фильтра в новую 50-миллилитровую трубку и промывки сетчатого фильтра DPBS. После процеживания дайте эмбриоидным телам осесть на дно конической трубки, затем аспирируйте супернатант и промыть примерно 10 миллилитрами DMEM. Затем повторно суспендируют эмбриоидные тела в шести миллилитрах среды стадии II.Перенесите эмбриоидные тела обратно в шестилуночную сверхнизкую пластину крепления, равномерно распределив их между скважинами. Поскольку большинство органоидов собираются в верхней части пипетки, оставьте примерно половину миллилитра на конце, затем осторожно прикоснитесь кончиком к среде в каждой лунке, позволяя органоидам течь в лунку. Перенесите эмбриоидные тела в 125-миллилитровую колбу с 45 миллилитрами среды II стадии.Установите магнитную скорость перемешивания на 120 об/мин и поместите колбу в инкубатор. Чтобы накормить эмбриоидные тела или почечные органоиды, дайте им ненадолго осесть на дно колбы спиннера, затем поднимите крышку с одного бокового рычага колбы и поместите аспирационную пипетку внутрь с наконечником, касающимся противоположной внутренней стенки. Медленно наклоните пипетку вниз и аспирируйте примерно половину среды.Пополняйте 20 миллилитрами свежей среды Stage II, пипетируя ее через то же отверстие. Используйте длинные стерильные щипцы, чтобы аккуратно поместить один магнитный перемешивание в каждую лунку шестилуночной пластины с эмбриональными телами или почечными органоидами. Поместите пластину на шестиколесную магнитную перемешиваемую пластину и установите скорость 120 об/мин.Чтобы магнитные перемешивания защелкнулись и начали вращаться, сначала установите уровень мощности на 100. Как только все брусья начнут вращаться, уменьшите уровень мощности до 25. Поддерживайте органоиды почек, изменяя половину среды, как было продемонстрировано ранее.Иммунофлуоресценция парафиновых срезов органоидов почек 14-го дня показывает наличие сегментов нефронов, таких как почечные канальцы, экспрессирующие ядерный фактор гепатоцитов-1 бета и лектин тетрагонолоба лотоса, а также кластеры подоцитов, экспрессирующие V-маф мускулоапоневротическую фибросаркому онкогенный гомолог В и нефрин. Модификации в этом протоколе могут поддерживать расширение эндотелиальных клеток, что подтверждается окрашиванием молекулой адгезии тромбоцитов и эндотелиальных клеток-1 на 26-й день культуры. Человеческие плюрипотентные стволовые клетки необходимо обрабатывать Диспазой в течение соответствующего количества времени, а затем тщательно промыть, чтобы удалить все следы.Если Диспаза не полностью удалена, это может привести к гибели клеток и кластеризации эмбриональных тел. Этот метод помог нам изучить развитие врожденных заболеваний почек, а также различные пути повреждения почек и потенциал для терапевтических вмешательств in vitro.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-свободный Вывод меланоцитов из человеческих плюрипотентные стволовые клетки

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Определено и масштабируемая Генерация гепатоцитов-подобных клеток из человеческих плюрипотентные стволовые клетки

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Быстрое, режиссер дифференциация клеток эпителия сетчатки пигмента от человеческого эмбриона или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Поколение стандартизированных и воспроизводимые переднего мозга тип мозгового Organoids от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Эффективная дифференциация стволовых клеток человека в клетки печени

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

В Vitro поколения Сомит производных от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

Статический самостоятельно направленный метод генерации органов мозга из эмбриональных стволовых клеток человека

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

In vitro Neuromuscular Junction Induced from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In vitro нейромышечная развязка, индуцированная из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized synapse that transmits action potentials from the motor neuron to skeletal muscle for mechanical ...

Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Направленная дифференцировка гемогенных эндотелиальных клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial ...