Name: a simplified method for generating kidney organoids from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-04-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Denna forskning finansierades av National Institutes of Health R01 DK069403, UC2 DK126122 och P30-DK079307 och ASN Foundation for Kidney Research Ben J. Lipps Research Fellowship Program till AP.

Alla experiment med hPSC utfördes i enlighet med institutionella riktlinjer och utfördes i en klass II biosäkerhetskåpa med lämplig personlig skyddsutrustning. Alla reagenser är av cellodlingskvalitet om inget annat anges. Alla kulturer inkuberas vid 37 ° C, 5% CO2 luftatmosfär. I alla stadier av analysen kan embryoidkroppar eller njurorganoider samlas in och fixeras eller förberedas för analys. De hPSC-linjer som används för att generera dessa data har karakteriserats fullständigt och publicerats...

<ol>
	<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids.">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communications. 6, 8715 (2015).</li><li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury.">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li><li>Taguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+in+vivo+origin+of+metanephric+nephron+progenitors+enables+generation+of+complex+kidney+structures+from+pluripotent+stem+cells.">Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2013).</li><li>Przepiorski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+bioreactor-based+method+to+generate+kidney+organoids+from+pluripotent+stem+cells.">A simple bioreactor-based method to generate kidney organoids from pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 11 (2), 470-484 (2018).</li><li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids.">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communication. 6, 8715 (2015).</li><li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury.">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Taguchi, A., Nishinakamura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-order+kidney+organogenesis+from+pluripotent+stem+cells.">Higher-order kidney organogenesis from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).</li><li>Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+organoids+with+improved+collecting+duct+maturation+and+injury+modeling.">Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling.</a> Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).</li><li>Howden, S. E., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+using+defined+conditions.">Generating kidney organoids from human pluripotent stem cells using defined conditions.</a> Methods in Molecular Biology. 2155, 183-192 (2020).</li><li>Tanigawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin+is+superior+to+BMP7+for+efficient+maintenance+of+human+iPSC-derived+nephron+progenitors.">Activin is superior to BMP7 for efficient maintenance of human iPSC-derived nephron progenitors.</a> Stem Cell Reports. 13 (2), 322-337 (2019).</li><li>Sander, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+large-scale+production+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Protocol for large-scale production of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100150 (2020).</li><li>Ekblom, P., Thesleff, I., Miettinen, A., Saxen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+defined+medium+supplemented+with+transferrin.">Organogenesis in a defined medium supplemented with transferrin.</a> Cell Differentiation. 10 (5), 281-288 (1981).</li><li>Thesleff, I., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+transferrin+in+branching+morphogenesis,+growth+and+differentiation+of+the+embryonic+kidney.">Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 82, 147-161 (1984).</li><li>Freund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+redirects+differentiation+from+cardiogenic+mesoderm+and+endoderm+to+neuroectoderm+in+differentiating+human+embryonic+stem+cells.">Insulin redirects differentiation from cardiogenic mesoderm and endoderm to neuroectoderm in differentiating human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26 (3), 724-733 (2008).</li><li>Nishikawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimal+serum-free+defined+condition+for+in+vitro+culture+of+kidney+organoids.">An optimal serum-free defined condition for in vitro culture of kidney organoids.</a> Biochemistry and Biophysics Research Communication. 501 (4), 996-1002 (2018).</li><li>Oh, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+New+Zealand+donors.">Derivation of induced pluripotent stem cell lines from New Zealand donors.</a> Journal of the Royal Society of New Zealand. , 1-14 (2020).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney.">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2013).</li><li>Lam, A. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intermediate+mesoderm+that+forms+tubules+expressing+kidney+proximal+tubular+markers.">Rapid and efficient differentiation of human pluripotent stem cells into intermediate mesoderm that forms tubules expressing kidney proximal tubular markers.</a> Journal of American Society of Nephrology. 25 (6), 1211-1225 (2014).</li><li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+embryoid+body+microenvironment+to+direct+embryonic+stem+cell+differentiation.">Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation.</a> Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).</li><li>Imasawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+repatterns+human+podocyte+energy+metabolism+during+differentiation+and+diabetic+nephropathy.">High glucose repatterns human podocyte energy metabolism during differentiation and diabetic nephropathy.</a> FASEB Journal. 31 (1), 294-307 (2017).</li><li>Kim, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+condition+induces+autophagy+in+endothelial+progenitor+cells+contributing+to+angiogenic+impairment.">High glucose condition induces autophagy in endothelial progenitor cells contributing to angiogenic impairment.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (7), 1248-1252 (2014).</li><li>Piwkowska, A., Rogacka, D., Audzeyenka, I., Jankowski, M., Angielski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+concentration+affects+the+oxidant-antioxidant+balance+in+cultured+mouse+podocytes.">High glucose concentration affects the oxidant-antioxidant balance in cultured mouse podocytes.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 112 (6), 1661-1672 (2011).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+and+refinement+of+human+PSC-derived+kidney+organoid+differentiation+with+single-cell+transcriptomics.">Comparative analysis and refinement of human PSC-derived kidney organoid differentiation with single-cell transcriptomics.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 869-881 (2018).</li><li>Lei, X., Deng, Z., Duan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniform+embryoid+body+production+and+enhanced+mesendoderm+differentiation+with+murine+embryonic+stem+cells+in+a+rotary+suspension+bioreactor.">Uniform embryoid body production and enhanced mesendoderm differentiation with murine embryonic stem cells in a rotary suspension bioreactor.</a> Methods in Molecular Biology. , (2016).</li></ol>

Tidigare studier har visat att de inledande protokollstegen är kritiska för mellanliggande mesodermdifferentiering 5,19,20 och därför är det viktigt att implementera en strikt medelkomposition i detta skede. Avlägsnande av odefinierade komponenter som serum, albumin, proteinfritt hybridommedium II från det första steget i protokollet kan bidra till att förbättra konsekvent differentieringseffektivitet mellan analyserna...

Under de senaste åren har ett antal protokoll för att differentiera humana pluripotenta stamceller till njurorganoider utvecklats 1,2,3,4,5. Njurorganoider har tillhandahållit ett viktigt verktyg för att hjälpa forskning om nya regenerativa medicinska metoder, modellera njurrelaterade sjukdomar, utföra toxicitetsstudier och terapeutisk läkemedelsutveckling. Trots deras breda tillämplighet har njurorganoider begränsningar som brist på mognad, begränsad långsiktig odlingskapacitet in vitro och en brist på flera celltyper som finns i den mänskliga njuren 6,7,8. Det senaste arbetet har fokuserat på att förbättra nivån av organoidmognad, förlänga odlingsperioderna och utöka komplexiteten hos njurcellpopulationer genom att ändra de befintliga protokollen 9,10,11,12. I denna nuvarande iteration av vårt etablerade protokoll 5,13 har vi modifierat mediekomponenterna i det första steget i protokollet till ett serumfritt basmedium kompletterat med insulin-transferrin-selen-etanolamin (ITSE), lipider, polyvinylalkohol (E5-ILP) och CHIR99021 (Figur 1). Dessa förändringar ger ett fullständigt definierat, serumfritt, proteinfattigt medium, med mindre komponenter än vår tidigare mediumsammansättning 5,13 och utan ytterligare tillväxtfaktorer. Som ett resultat är det första stegets medium mindre arbetsintensivt att förbereda än vår tidigare publicerade version och kan minska batch-till-batch-variabiliteten5. Tidigare studier har visat att både insulin och transferrin är viktiga i serumfri odling14,15, men höga nivåer av insulin kan hämma mesodermdifferentiering16. Vi har bibehållit de låga insulinnivåerna som anges i det ursprungliga protokollet och ytterligare minskat nivåerna av KOSR (innehållande insulin) i andra etappen av analysen. I linje med andra protokoll för njurorganoidbildning är lägre nivåer av KOSR fördelaktiga för att upprätthålla en balans mellan proliferation och differentiering av njurvävnaden17. Dessutom har vi sänkt glukoskoncentrationen i vårt steg II-medium13.
Vår metod beskriver en inställning för suspensionsanalys av njurorganoider, vilket ger upp till ~ 1000 organoider från en initial ~ 60% sammanflytande hPSC 100 mm odlingsplatta som beskrivs i den ursprungliga publikationen 5,13. Detta protokoll kan enkelt skalas upp till att börja med flera 100 mm eller 150 mm plattor för att ytterligare öka organoidantalet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21-985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-adherence rinsing solution</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72054</td>
			<td>10 mM stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;disposable spinner flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-201-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Ultra-Low Attachment 6-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Slow-Speed Stirrers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-495-03</td>
			<td>Multi plate magnetic stirrer for spinner flask culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11054020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14-190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg / Oval Stirring Bars</td>
			<td>2mag</td>
			<td>PI20106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelta General-Purpose Tweezers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-456-103</td>
			<td>Keep sterile in the cell culture hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZBio Single Use Media Bottle, 250mL</td>
			<td>Foxx Life Sciences</td>
			<td>138-3211-FLS</td>
			<td>Used to make PVA 10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes (100 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Sterile Aspirating Pipet 2mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160; Cell Lifters - Cell lifter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Multi Function 3D Rotators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88-861-047</td>
			<td>Orbital shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1413302</td>
			<td>BME. Aliquot on ice and freeze. Another suitable matrix alternative is Matrigel or Cultrex.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td>GCDR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td>L-glutamine supplement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51-500-056</td>
			<td>ITSE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut&#160; Serum Replacement - Multi-Species</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A3181502</td>
			<td>KOSR. Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid Mixture 1, Chemically Defined</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>L0288-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 500mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2GPU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma&#160; Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 250mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2GPU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit</td>
			<td>2mag</td>
			<td>VMF 90250 U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive</td>
			<td>2mag</td>
			<td>VMF 40600</td>
			<td>6MSP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MP Biomedicals&#160; 7X Cleaning Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MP0976670A4</td>
			<td>Tissue culture suitable detergent. Make a 5% solution in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF, and mTeSR Plus medium have also been tested and are suitable alternatives.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50 mL Conical, Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-mpt</td>
			<td>Anti-mycoplasma reagent. Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer&#174; 200 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0776417</td>
			<td>Cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer&#174; 500 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0822591</td>
			<td>Cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol) 87-90% hydrolyzed&#160; (PVA)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P8136-250G</td>
			<td>10% in DPBS stirring at 98 degrees C until disolves, make in 138-3211-FLS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y-27632 (ROCKi)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td>10 mM stock in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Serological Pipets&#160; - 10mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Serological Pipets - 25mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Serological pipette - 5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-12D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeSR-E5</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5916</td>
			<td>Serum-free, low protein base medium for E5-ILP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variomag distriBOX 2 Distributor</td>
			<td>2mag</td>
			<td>VMF 90512</td>
			<td>If you use more than one MIXdrive</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simplified method for generating kidney organoids from human pluripotent stem cells

Njurorganoider genererade från hPSC har gett en obegränsad källa till njurvävnad. Mänskliga njurorganoider är ett ovärderligt verktyg för att studera njursjukdom och skada, utveckla cellbaserade terapier och testa nya terapier. För sådana tillämpningar behövs ett stort antal enhetliga organoider och mycket reproducerbara analyser. Vi har byggt vidare på vårt tidigare publicerade njurorganoidprotokoll för att förbättra organoidernas allmänna hälsa. Detta enkla, robusta 3D-protokoll involverar bildandet av enhetliga embryoidkroppar i minsta komponentmedium innehållande lipider, insulin-transferrin-selen-etanolamintillskott och polyvinylalkohol med GSK3-hämmare (CHIR99021) i 3 dagar, följt av odling i utslagssersättning av serumersättning (KOSR) -innehållande medium. Dessutom möjliggör agiterande analyser minskning av klumpning av embryoidkropparna och upprätthållande av en enhetlig storlek, vilket är viktigt för att minska variationen mellan organoider. Sammantaget ger protokollet en snabb, effektiv och kostnadseffektiv metod för att generera stora mängder njurorganoider.

I den senaste versionen av vårt protokoll initieras njurorganoiddifferentiering i ett definierat, lågt proteinmedium. Analyserna utförs helt i suspension och förlitar sig på den medfödda förmågan hos hPSC:s differentiering och organisation för initiering av tubulogenes. En enda analys som härrör från en 100 mm ~ 60% sammanflytande hPSC-odlingsplatta ger rutinmässigt 500-1000 njurorganoider, vilket visas i vår tidigare publikation5. På grund av så stort antal organoider som generera...

Watch this Scientific Journal Video about A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

Här beskriver vi ett protokoll för att generera njurorganoider från humana pluripotenta stamceller (hPSC). Detta protokoll genererar njurorganoider inom två veckor. De resulterande njurorganoiderna kan odlas i storskaliga spinnkolvar eller magnetiska omrörningsplattor med flera brunnar för parallella läkemedelstestmetoder.

En förenklad metod för att generera njurorganoider från humana pluripotenta stamceller

Kidney organoids generated from hPSCs have provided an unlimited source of renal tissue. Human kidney organoids are an invaluable tool for studying kidney ...

Denna metod kan utföras i alla laboratorier utrustade för cellodlingsexperiment. Med hjälp av denna metod kan vi främja vår förståelse av njurutveckling och sjukdomsvägar. Detta är en relativt enkel och billig metod jämfört med andra för att generera njurorganoider.Den största utmaningen med denna teknik är att upprätthålla högkvalitativ human pluripotent stamcellsodling. Det är viktigt att cellerna hålls vid mindre än 80% sammanflöde och delas regelbundet. Forskare som är nya för mänsklig pluripotent stamcellsodling bör bekanta sig med stamcellslinjerna innan de fortsätter till differentiering.Börja njurorganoidanalysen genom att tillsätta två milliliter komplett E5-ILP-medium i varje brunn på en sex-brunns ultralåg fästplatta. Odla humana pluripotenta stamceller, eller hPSC, i 100 millimeter vävnadsodlingsbehandlade plattor tills de når 60% sammanflöde. Tvätta hPSC två gånger med cirka åtta milliliter DPBS.Aspirera DPBS, tillsätt sedan två milliliter Dispase droppvis för att täcka cellerna och inkubera dem i sex minuter vid 37 grader Celsius. Tvätta cellerna tre gånger med cirka 10 ml DPBS. Aspirera DPBS, luta sedan plattan med 45 grader och skrapa ner cellerna med en celllyftare.Tvätta kolonierna ner från toppen med sex milliliter komplett E5-ILP-medium med en 10-milliliter serologisk pipett. Håll sedan pipetten vertikalt, bryt upp stora kolonier genom att försiktigt pipettera upp och ner, var försiktig så att du inte rör vid sidorna på odlingsplattan. Fördela koloniklusterna jämnt genom att tillsätta en milliliter per brunn i sexbrunnsplattan och placera sedan plattan på en orbital shaker inuti en 37-graders Celsius inkubator.Alternativt, om en orbital shaker inte är tillgänglig, kan cellerna statiskt odlas. På dag två, efter att ha låtit embryoidkropparna sätta sig i botten av plattan, luta plattan med 45 grader och aspirera mediet långsamt från toppen och lämna en milliliter per brunn. Tillsätt två milliliter beredd komplett medium per brunn och sätt tillbaka plattan till skakaren.På dag tre, efter att ha aspirerat mediet som tidigare visats, samla alla embryoidkroppar noggrant från varje brunn med hjälp av en 10 ml serologisk pipett och överför dem till ett 50 ml koniskt rör. För att samla eventuella återstående embryoidkroppar, skölj varje brunn med en milliliter DMEM med låg glukos och tillsätt dem till samma 50 ml koniska rör. Medan du väntar på att embryoidkropparna ska sätta sig i botten av röret, tillsätt två milliliter steg II-medium till varje brunn på sexbrunnsplattan.Sikta sedan ut stora embryoidkroppar genom att placera en 200 mikrometer cellsil ovanpå ett nytt 50-milliliter koniskt rör och pipettera alla embryoidkroppar försiktigt över cellsilen. Skölj cellsilen med ytterligare fem milliliter DMEM för att samla eventuella embryoida kroppar som sitter fast i silen. I senare skeden, använd först en 500-mikrometer sil för att sikta ut mycket stora embryoidkroppar, sedan passera filtratet genom en 200-mikrometer sil för att sikta ut mycket små embryoidkroppar utan tubuler.Samla in embryoidkroppar i rätt storlek, mellan 200 och 500 mikrometer, genom att invertera silen på 200 mikrometer till ett nytt 50-milliliters rör och tvätta silen med DPBS. Efter ansträngning, låt embryoidkropparna sätta sig till botten av det koniska röret, aspirera sedan supernatanten och tvätta med cirka 10 ml DMEM. Resuspendera sedan embryoidkropparna i sex milliliter av steg II-medium.Överför embryoidkropparna tillbaka till den sex-brunns ultralåga fästplattan och fördela dem jämnt mellan brunnarna. Eftersom de flesta organoiderna samlas på toppen av pipetten, lämna ungefär en halv milliliter i slutet och rör sedan försiktigt spetsen till media i varje brunn, så att organoider kan strömma in i brunnen. Överför embryoidkropparna till en 125-milliliter spinnerkolv med 45 ml steg II-medium.Ställ in den magnetiska omrörningshastigheten till 120 rpm och placera kolven i inkubatorn. För att mata embryoidkropparna eller njurorganoiderna, låt dem sätta sig kort till botten av spinnkolven, lyft sedan locket från kolvens ena sidoarm och placera den aspirerande pipetten inuti med spetsen som rör vid motsatt innervägg. Vinkla pipetten långsamt nedåt och aspirera ungefär hälften av mediet.Fyll på med 20 ml färskt steg II-medium genom att pipettera det genom samma öppning. Använd långa sterila pincett för att försiktigt placera en magnetisk omrörningsstång i varje brunn på en sexbrunnsplatta med embryoidkroppar eller njurorganoider. Placera plattan på den sexhjuliga magnetiska omrörningsplattan och ställ in hastigheten på 120 rpm.För att de magnetiska omrörningsstängerna ska snäppas på plats och börja snurra, ställ först in effektnivån till 100. När alla stänger börjar snurra, ta ner effektnivån till 25. Behåll njurorganoiderna genom att ändra hälften av mediet som tidigare visats.Immunofluorescens av paraffinsektioner av dag 14 njurorganoider visar närvaro av nefronsegment såsom njurtubuler som uttrycker hepatocytkärnfaktor-1 beta och Lotus tetragonolobuslektin, liksom podocytkluster som uttrycker V-maf muskuloaponeurotisk fibrosarkom onkogen homolog B och nefhrin. Modifieringarna i detta protokoll kan stödja expansion av endotelceller, vilket bekräftas genom färgning med trombocyt- och endotelcelladhesionsmolekyl-1 vid dag 26 av odlingen. Humana pluripotenta stamceller måste behandlas med Dispase under lämplig tid och tvättas sedan noggrant för att ta bort alla spår.Om Dispase inte avlägsnas helt kan det leda till celldöd och kluster av embryoidkroppar. Denna metod har hjälpt oss att undersöka utvecklingen av medfödda njursjukdomar, liksom olika njurskadevägar och potential för terapeutiska ingrepp in vitro.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-fria Derivering av Melanocyter från Human pluripotenta stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Definierade och skalbar generation av hepatocyte-liknande celler från mänskliga pluripotenta stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Snabb, regisserad differentiering av Retinal Pigment epitelial celler från mänskliga embryonala eller inducerade pluripotenta stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation av standardiserade och reproducerbara framhjärnan-typ Cerebral Organoids från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Effektiv differentiering av humana pluripotenta stamceller till leverceller

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation av Somite derivat från mänskliga inducerade stamceller pluripotenta

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

En statisk självstyrd metod för att generera hjärnorganoider från mänskliga embryonala stamceller

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

In vitro Neuromuscular Junction Induced from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In vitro Neuromuskulära Junction inducerad från humana inducerade pluripotenta stamceller

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized synapse that transmits action potentials from the motor neuron to skeletal muscle for mechanical ...

Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Riktad differentiering av hemogena endotelceller från humana pluripotenta stamceller

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial ...