Name: a simplified method for generating kidney organoids from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-04-13T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Bu araştırma Ulusal Sağlık Enstitüleri R01 DK069403, UC2 DK126122 ve P30-DK079307 ve ASN Böbrek Araştırmaları Vakfı Ben J. Lipps Araştırma Burs Programı tarafından AP'ye finanse edilmiştir.

hPSC'leri kullanan tüm deneyler kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi ve uygun kişisel koruyucu ekipmana sahip bir Sınıf II biyogüvenlik başlığında gerçekleştirildi. Tüm reaktifler, aksi belirtilmedikçe hücre kültürü sınıfındadır. Tüm kültürler 37 °C, %5 CO2 hava atmosferinde inkübe edilir. Tahlilin tüm aşamalarında, embriyoid cisimler veya böbrek organoidleri toplanabilir ve analiz için sabitlenebilir veya hazırlanabilir. Bu verileri oluşturmak için kullanıla...

<ol>
	<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids.">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communications. 6, 8715 (2015).</li><li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury.">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li><li>Taguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+the+in+vivo+origin+of+metanephric+nephron+progenitors+enables+generation+of+complex+kidney+structures+from+pluripotent+stem+cells.">Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2013).</li><li>Przepiorski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+bioreactor-based+method+to+generate+kidney+organoids+from+pluripotent+stem+cells.">A simple bioreactor-based method to generate kidney organoids from pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 11 (2), 470-484 (2018).</li><li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids.">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communication. 6, 8715 (2015).</li><li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury.">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis.">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li><li>Taguchi, A., Nishinakamura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-order+kidney+organogenesis+from+pluripotent+stem+cells.">Higher-order kidney organogenesis from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).</li><li>Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+organoids+with+improved+collecting+duct+maturation+and+injury+modeling.">Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling.</a> Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).</li><li>Howden, S. E., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+using+defined+conditions.">Generating kidney organoids from human pluripotent stem cells using defined conditions.</a> Methods in Molecular Biology. 2155, 183-192 (2020).</li><li>Tanigawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin+is+superior+to+BMP7+for+efficient+maintenance+of+human+iPSC-derived+nephron+progenitors.">Activin is superior to BMP7 for efficient maintenance of human iPSC-derived nephron progenitors.</a> Stem Cell Reports. 13 (2), 322-337 (2019).</li><li>Sander, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+large-scale+production+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Protocol for large-scale production of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100150 (2020).</li><li>Ekblom, P., Thesleff, I., Miettinen, A., Saxen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organogenesis+in+a+defined+medium+supplemented+with+transferrin.">Organogenesis in a defined medium supplemented with transferrin.</a> Cell Differentiation. 10 (5), 281-288 (1981).</li><li>Thesleff, I., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+transferrin+in+branching+morphogenesis,+growth+and+differentiation+of+the+embryonic+kidney.">Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 82, 147-161 (1984).</li><li>Freund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+redirects+differentiation+from+cardiogenic+mesoderm+and+endoderm+to+neuroectoderm+in+differentiating+human+embryonic+stem+cells.">Insulin redirects differentiation from cardiogenic mesoderm and endoderm to neuroectoderm in differentiating human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26 (3), 724-733 (2008).</li><li>Nishikawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimal+serum-free+defined+condition+for+in+vitro+culture+of+kidney+organoids.">An optimal serum-free defined condition for in vitro culture of kidney organoids.</a> Biochemistry and Biophysics Research Communication. 501 (4), 996-1002 (2018).</li><li>Oh, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+induced+pluripotent+stem+cell+lines+from+New+Zealand+donors.">Derivation of induced pluripotent stem cell lines from New Zealand donors.</a> Journal of the Royal Society of New Zealand. , 1-14 (2020).</li><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney.">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2013).</li><li>Lam, A. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intermediate+mesoderm+that+forms+tubules+expressing+kidney+proximal+tubular+markers.">Rapid and efficient differentiation of human pluripotent stem cells into intermediate mesoderm that forms tubules expressing kidney proximal tubular markers.</a> Journal of American Society of Nephrology. 25 (6), 1211-1225 (2014).</li><li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+embryoid+body+microenvironment+to+direct+embryonic+stem+cell+differentiation.">Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation.</a> Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).</li><li>Imasawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+repatterns+human+podocyte+energy+metabolism+during+differentiation+and+diabetic+nephropathy.">High glucose repatterns human podocyte energy metabolism during differentiation and diabetic nephropathy.</a> FASEB Journal. 31 (1), 294-307 (2017).</li><li>Kim, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+condition+induces+autophagy+in+endothelial+progenitor+cells+contributing+to+angiogenic+impairment.">High glucose condition induces autophagy in endothelial progenitor cells contributing to angiogenic impairment.</a> Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (7), 1248-1252 (2014).</li><li>Piwkowska, A., Rogacka, D., Audzeyenka, I., Jankowski, M., Angielski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+concentration+affects+the+oxidant-antioxidant+balance+in+cultured+mouse+podocytes.">High glucose concentration affects the oxidant-antioxidant balance in cultured mouse podocytes.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 112 (6), 1661-1672 (2011).</li><li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+and+refinement+of+human+PSC-derived+kidney+organoid+differentiation+with+single-cell+transcriptomics.">Comparative analysis and refinement of human PSC-derived kidney organoid differentiation with single-cell transcriptomics.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 869-881 (2018).</li><li>Lei, X., Deng, Z., Duan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uniform+embryoid+body+production+and+enhanced+mesendoderm+differentiation+with+murine+embryonic+stem+cells+in+a+rotary+suspension+bioreactor.">Uniform embryoid body production and enhanced mesendoderm differentiation with murine embryonic stem cells in a rotary suspension bioreactor.</a> Methods in Molecular Biology. , (2016).</li></ol>

Önceki çalışmalar, ilk protokol adımlarının ara mezoderm farklılaşması 5,19,20 için kritik olduğunu ve bu nedenle bu aşamada sıkı bir orta bileşimin uygulanmasının gerekli olduğunu göstermiştir. Serum, albümin, proteinsiz hibridoma medium II gibi tanımlanmamış bileşenlerin protokolün ilk aşamasından çıkarılması, tahliller21 arasındaki tutarlı farklılaşma verimliliğini...

Son yıllarda, insan pluripotent kök hücrelerini böbrek organoidlerine ayırmak için bir dizi protokol geliştirilmiştir 1,2,3,4,5. Böbrek organoidleri, yeni rejeneratif tıp yaklaşımlarına yönelik araştırmalara yardımcı olmak, böbrekle ilgili hastalıkları modellemek, toksisite çalışmaları yapmak ve terapötik ilaç geliştirmek için önemli bir araç sağlamıştır. Geniş uygulanabilirliklerine rağmen, böbrek organoidlerinin olgunlaşma eksikliği, in vitro sınırlı uzun süreli kültür kapasitesi ve insan böbreğinde bulunan çeşitli hücre tiplerinin azlığı gibi sınırlamaları vardır 6,7,8. Son çalışmalar, organoid olgunlaşma seviyesini iyileştirmeye, kültür sürelerini uzatmaya ve mevcut protokollerideğiştirerek böbrek hücresi popülasyonlarının karmaşıklığını genişletmeye odaklanmıştır 9,10,11,12. Yerleşik protokolümüzün 5,13'ünün bu mevcut yinelemesinde, protokolün ilk aşamasındaki ortam bileşenlerini, insülin-transferrin-selenyum-etanolamin (ITSE), lipitler, polivinil alkol (E5-ILP) ve CHIR99021 ile desteklenmiş serumsuz bir baz ortama değiştirdik (Şekil 1). Bu değişiklikler, önceki orta bileşimimiz 5,13'ten daha az bileşene sahip ve ek büyüme faktörleri olmadan, tam olarak tanımlanmış, serum içermeyen, düşük proteinli bir ortam sağlar. Sonuç olarak, ilk aşama ortamının hazırlanması daha önce yayınlanmış sürümümüze göre daha az emek yoğundur ve partiden partiye değişkenliğiazaltabilir 5. Önceki çalışmalar, serumsuz kültür14,15'te hem insülin hem de transferrinin önemli olduğunu göstermiştir, ancak yüksek insülin seviyeleri mezoderm farklılaşmasına inhibide olabilir16. Orijinal protokolde belirtildiği gibi düşük insülin seviyelerini koruduk ve tahlilin ikinci aşamasında KOSR seviyelerini (insülin içeren) daha da azalttık. Böbrek organoid oluşumu için diğer protokollere uygun olarak, daha düşük KOSR seviyeleri, böbrek dokusunun çoğalması ve farklılaşması arasındaki dengeyi korumak için faydalıdır17. Ek olarak, Aşama II ortam13'ümüzdeki glikoz konsantrasyonunu düşürdük.
Yöntemimiz, orijinal yayın 5,13'te açıklandığı gibi, başlangıçtaki ~% 60 birleşik hPSC 100 mm kültür plakasından ~ 1.000 organoid veren böbrek organoidlerinin süspansiyon testi için bir kurulum tanımlamaktadır. Bu protokol, organoid sayılarını daha da artırmak için birden fazla 100 mm veya 150 mm plaka ile başlayarak kolayca ölçeklendirilebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>21-985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-adherence rinsing solution</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72054</td>
			<td>10 mM stock in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;disposable spinner flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-201-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Ultra-Low Attachment 6-well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Slow-Speed Stirrers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-495-03</td>
			<td>Multi plate magnetic stirrer for spinner flask culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7923</td>
			<td>Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11054020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14-190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg / Oval Stirring Bars</td>
			<td>2mag</td>
			<td>PI20106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excelta General-Purpose Tweezers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-456-103</td>
			<td>Keep sterile in the cell culture hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZBio Single Use Media Bottle, 250mL</td>
			<td>Foxx Life Sciences</td>
			<td>138-3211-FLS</td>
			<td>Used to make PVA 10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes (100 mm)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Sterile Aspirating Pipet 2mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160; Cell Lifters - Cell lifter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-100-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand&#160;Multi Function 3D Rotators</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>88-861-047</td>
			<td>Orbital shaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1413302</td>
			<td>BME. Aliquot on ice and freeze. Another suitable matrix alternative is Matrigel or Cultrex.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td>GCDR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>35-050-061</td>
			<td>L-glutamine supplement.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>51-500-056</td>
			<td>ITSE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut&#160; Serum Replacement - Multi-Species</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A3181502</td>
			<td>KOSR. Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipid Mixture 1, Chemically Defined</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>L0288-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 500mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2GPU05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma&#160; Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 250mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2GPU02RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit</td>
			<td>2mag</td>
			<td>VMF 90250 U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive</td>
			<td>2mag</td>
			<td>VMF 40600</td>
			<td>6MSP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MP Biomedicals&#160; 7X Cleaning Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MP0976670A4</td>
			<td>Tissue culture suitable detergent. Make a 5% solution in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td>hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF, and mTeSR Plus medium have also been tested and are suitable alternatives.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 50 mL Conical, Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc 15mL Conical Sterile Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmocin</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>ant-mpt</td>
			<td>Anti-mycoplasma reagent. Aliquot and freeze</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer&#174; 200 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0776417</td>
			<td>Cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer&#174; 500 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0822591</td>
			<td>Cell strainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol) 87-90% hydrolyzed&#160; (PVA)</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>P8136-250G</td>
			<td>10% in DPBS stirring at 98 degrees C until disolves, make in 138-3211-FLS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y-27632 (ROCKi)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td>10 mM stock in DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Serological Pipets&#160; - 10mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-11E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Serological Pipets - 25mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Disposable Serological pipette - 5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-12D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TeSR-E5</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>5916</td>
			<td>Serum-free, low protein base medium for E5-ILP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variomag distriBOX 2 Distributor</td>
			<td>2mag</td>
			<td>VMF 90512</td>
			<td>If you use more than one MIXdrive</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simplified method for generating kidney organoids from human pluripotent stem cells

hPSC'lerden üretilen böbrek organoidleri, sınırsız bir böbrek dokusu kaynağı sağlamıştır. İnsan böbrek organoidleri, böbrek hastalığı ve hasarını incelemek, hücre bazlı tedaviler geliştirmek ve yeni terapötikleri test etmek için paha biçilmez bir araçtır. Bu tür uygulamalar için, çok sayıda üniform organoid ve yüksek oranda tekrarlanabilir tahlillere ihtiyaç vardır. Organoidlerin genel sağlığını iyileştirmek için daha önce yayınlanmış böbrek organoid protokolümüzün üzerine inşa ettik. Bu basit, sağlam 3D protokolü, 3 gün boyunca lipitler, insülin-transferrin-selenyum-etanolamin takviyesi ve GSK3 inhibitörü (CHIR99021) ile polivinil alkol içeren minimum bileşen ortamında üniform embriyoid cisimlerin oluşumunu ve ardından nakavt serum replasmanı (KOSR) içeren ortamda kültürü içerir. Ek olarak, ajitasyon tahlilleri, embriyoid cisimlerin kümelenmesinde azalmaya ve organoidler arasındaki değişkenliği azaltmak için önemli olan düzgün bir boyutun korunmasına izin verir. Genel olarak, protokol büyük miktarlarda böbrek organoidi üretmek için hızlı, verimli ve uygun maliyetli bir yöntem sağlar.

Protokolümüzün bu en son versiyonunda, böbrek organoid farklılaşması tanımlanmış, düşük proteinli bir ortamda başlatılır. Tahliller tamamen süspansiyon halinde gerçekleştirilir ve hPSC'lerin tübülogenezin başlatılması için farklılaşma ve organizasyonun doğuştan gelen yeteneğine dayanır. 100 mm ~% 60 oranında bir akıcılık hPSC kültür plakasından kaynaklanan tek bir tahlil, önceki yayınımızda gösterildiği gibi rutin olarak 500-1.000 böbrek organoidi verir5</sup...

Watch this Scientific Journal Video about A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

Burada, insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC'ler) böbrek organoidleri üretmek için bir protokol tarif ediyoruz. Bu protokol iki hafta içinde böbrek organoidleri üretir. Elde edilen böbrek organoidleri, paralel ilaç testi yaklaşımları için büyük ölçekli iplikçi şişelerinde veya çok kuyulu manyetik karıştırma plakalarında kültürlenebilir.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Böbrek Organoidleri Üretmek için Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Kidney organoids generated from hPSCs have provided an unlimited source of renal tissue. Human kidney organoids are an invaluable tool for studying kidney ...

Bu yöntem, hücre kültürü deneyleri için donatılmış herhangi bir laboratuvarda gerçekleştirilebilir. Bu yöntemi kullanarak, böbrek gelişimi ve hastalık yolları hakkındaki anlayışımızı ilerletebiliriz. Bu, böbrek organoidleri üretmek için diğerlerine kıyasla nispeten basit ve ucuz bir yöntemdir.Bu tekniğin en büyük zorluğu, yüksek kaliteli insan pluripotent kök hücre kültürünü korumaktır. Hücrelerin% 80'den daha az bir yoğunlukta tutulması ve düzenli olarak bölünmesi çok önemlidir. İnsan pluripotent kök hücre kültüründe yeni olan araştırmacılar, farklılaşmaya geçmeden önce kök hücre hatlarına aşina olmalıdır.Böbrek organoid tahliline, altı kuyucuklu ultra düşük bağlantı plakasının her bir kuyucuğuna iki mililitre tam E5-ILP ortamı ekleyerek başlayın. İnsan pluripotent kök hücrelerini veya hPSC'leri, 100 milimetre doku kültürü ile muamele edilmiş plakalarda% 60 akıcılığa ulaşana kadar kültürleyin. hPSC'leri yaklaşık sekiz mililitre DPBS ile iki kez yıkayın.DPBS'yi aspire edin, ardından hücreleri örtmek için damla damla iki mililitre Dispase ekleyin ve 37 santigrat derecede altı dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri yaklaşık 10 mililitre DPBS ile üç kez yıkayın. DPBS'yi aspire edin, ardından plakayı 45 derece eğin ve hücreleri bir hücre kaldırıcı ile kazıyın.10 mililitrelik serolojik pipet kullanarak kolonileri üstten altı mililitre tam E5-ILP ortamı ile yıkayın. Daha sonra, pipeti dikey olarak tutarak, kültür plakasının kenarlarına dokunmamaya dikkat ederek, yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek, büyük kolonileri parçalayın. Altı kuyucuklu plakaya kuyu başına bir mililitre ekleyerek koloni kümelerini eşit olarak dağıtın, ardından plakayı 37 derecelik bir santigrat inkübatörün içindeki yörüngesel bir çalkalayıcıya yerleştirin.Alternatif olarak, bir orbital çalkalayıcı mevcut değilse, hücreler statik olarak kültürlenebilir. İkinci günde, embriyoid cisimlerin plakanın dibine yerleşmesine izin verdikten sonra, plakayı 45 derece eğin ve ortamı üstten yavaşça aspire ederek kuyucuk başına bir mililitre bırakın. Kuyucuk başına iki mililitre hazırlanmış tam ortam ekleyin ve plakayı çalkalayıcıya geri döndürün.Üçüncü günde, daha önce gösterildiği gibi ortamı aspire ettikten sonra, 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak tüm embriyoid cisimleri her bir kuyucuktan dikkatlice toplayın ve 50 mililitrelik bir konik tüpe aktarın. Kalan embriyoid cisimleri toplamak için, her bir kuyucuğu bir mililitre düşük glikozlu DMEM ile durulayın ve bunları aynı 50 mililitrelik konik tüpe ekleyin. Embriyoid cisimlerin tüpün dibine yerleşmesini beklerken, altı kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna iki mililitre Aşama II orta ekleyin.Daha sonra, yeni bir 50 mililitrelik konik tüpün üzerine 200 mikrometrelik bir hücre süzgeci yerleştirerek ve tüm embriyoid cisimleri hücre süzgeci üzerinde dikkatlice pipetleyerek büyük embriyoid cisimleri eleyin. Süzgecin içine sıkışmış embriyoid cisimleri toplamak için hücre süzgecini ilave beş mililitre DMEM ile durulayın. Daha sonraki aşamalarda, önce çok büyük embriyoid cisimleri elemek için 500 mikrometrelik bir süzgeç kullanın, daha sonra tübülsüz çok küçük embriyoid cisimleri elemek için filtratın 200 mikrometrelik bir süzgeçten geçirilmesi.200 mikrometrelik süzgeci 50 mililitrelik yeni bir tüpe çevirerek ve süzgeci DPBS ile yıkayarak 200 ila 500 mikrometre arasında doğru boyutta embriyoid gövdeleri toplayın. Süzdükten sonra, embriyoid cisimlerin konik tüpün dibine yerleşmesine izin verin, daha sonra süpernatanı aspire edin ve yaklaşık 10 mililitre DMEM ile yıkayın. Daha sonra, embriyoid cisimleri altı mililitre Aşama II ortamında yeniden askıya alın.Embriyoid cisimleri altı kuyucuklu ultra düşük bağlantı plakasına geri aktarın ve kuyucuklar arasında eşit olarak dağıtın. Organoidlerin çoğu pipetin tepesinde toplandığından, sonunda yaklaşık yarım mililitre bırakın, ardından ucu her bir kuyucuktaki ortama hafifçe dokundurarak organoidlerin kuyuya akmasına izin verin. Embriyoid cisimleri, 45 mililitre Aşama II ortama sahip 125 mililitrelik bir iplikçi şişesine aktarın.Manyetik karıştırma hızını 120 rpm'ye ayarlayın ve şişeyi inkübatöre yerleştirin. Embriyoid cisimleri veya böbrek organoidlerini beslemek için, iplikçi şişenin dibine kısa bir süre yerleşmelerine izin verin, ardından kapağı şişenin bir yan kolundan kaldırın ve aspire edici pipeti, ucu karşı iç duvara değecek şekilde içine yerleştirin. Pipetin yavaşça aşağı doğru açılı olmasını sağlayın ve ortamın yaklaşık yarısını aspire edin.Aynı açıklıktan pipetleyerek, 20 mililitre taze Stage II ortamı ile doldurun. Embriyoid gövdeli veya böbrek organoidleri içeren altı kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna dikkatlice bir manyetik karıştırma çubuğu yerleştirmek için uzun steril forseps kullanın. Plakayı altı tekerlekli manyetik karıştırma plakasına yerleştirin ve hızı 120 rpm'ye ayarlayın.Manyetik karıştırma çubuklarının yerine oturması ve dönmeye başlaması için, önce güç seviyesini 100 olarak ayarlayın. Tüm çubuklar dönmeye başladığında, güç seviyesini 25'e indirin. Daha önce gösterildiği gibi ortamın yarısını değiştirerek böbrek organoidlerini koruyun.14. gün böbrek organoidlerinin parafin kesitlerinin immünofloresansı, hepatosit nükleer faktör-1 beta ve Lotus tetragonolobus lektini eksprese eden renal tübüller gibi nefron segmentlerinin yanı sıra V-maf musküloaponevrotik fibrosarkom onkogen homolog B ve nefrin'i eksprese eden podosit kümelerinin varlığını göstermektedir. Bu protokoldeki modifikasyonlar, kültürün 26. gününde trombosit ve endotel hücre adezyon molekülü-1 ile boyanarak doğrulandığı gibi, endotel hücrelerinin genişlemesini destekleyebilir. İnsan pluripotent kök hücrelerinin uygun süre Dispase ile tedavi edilmesi, daha sonra tüm izleri gidermek için iyice yıkanması gerekir.Dispase tamamen çıkarılmazsa, hücre ölümüne ve embriyoid cisimlerin kümelenmesine yol açabilir. Bu yöntem, konjenital böbrek hastalıklarının gelişimini, ayrıca çeşitli böbrek hasarı yollarını ve in vitro terapötik müdahaleler için potansiyeli incelememize yardımcı olmuştur.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Insan pluripotent kök hücreleri gelen melanosit besleyici içermeyen türetilmesi

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Tanımlı ve hepatosit benzeri Hücrelerinin Ölçeklenebilir Nesil insan pluripotent kök hücreleri gelen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Standart ve tekrarlanabilir ön türü beyin Organoids insan nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Insan pluripotent kök hücrelerinin karaciğer hücrelerine verimli farklılaşma

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinden Beyin Organoidleri Üretmek için Statik Kendi Kendini Yöneten Bir Yöntem

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

In vitro Neuromuscular Junction Induced from Human Induced Pluripotent Stem Cells

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden İndüklenen İn vitro Nöromüsküler Kavşak

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized synapse that transmits action potentials from the motor neuron to skeletal muscle for mechanical ...

Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Hemojenik Endotel Hücrelerinin İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Yönlendirilmiş Farklılaşması

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial ...